Nghiên cứu nấm Phytophthora Palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh

Nghiên cứu nấm Phytophthora Palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh Nghiên cứu nấm Phytophthora Palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TÂM NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO VÀ MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TÂM NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO VÀ MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM NGỌC DUNG TS PHẠM THẾ HẢI Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong ś t quá trình học tập và thực hiện đề tài, em đã nhâ ̣n đươ ̣c sự giúp đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t đế n tâ ̣p thể hướng dẫn khoa ho ̣c : TS Phạm Ngọc Dung và TS Phạm Thế Hả i, những người thầ y tâm huyế t , đã tâ ̣n tình hướng dẫn , chỉ bảo và giúp đỡ em quá trình thực hiê ̣n đề tài và hoàn thành luâ ̣n văn này Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắ c đế n Ban lañ h đa ̣o , Phòng tổ chức hành chính , Bô ̣ môn An toàn và Đa da ̣ng sinh ho ̣c , Viê ̣n Môi trường Nông nghiê ̣p đã đồ ng ý và tạo điều kiện cho em về thời gian học tập và thực hiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bô ̣ thuô ̣c nhóm Bê ̣nh ̣i ăn quả và công nghệ sinh ho ̣c, Bô ̣ môn Bê ̣nh Cây , Viê ̣n Bảo Vê ̣ Thực Vâ ̣t đã ta ̣o điề u kiê ̣n giúp đỡ quá trin ̀ h thực hiê ̣n các thí nghiê ̣m đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầ y cô ta ̣i Khoa Sinh ho ̣c , đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô ở Bô ̣ môn Vi sinh vâ ̣t ho ̣c, trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã nhiê ̣t tin ̀ h giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương pháp luâ ̣n và nghiên cứu khoa ho ̣c, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắc nhấ t đến gia đình , người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã đô ̣ng viên , giúp đỡ và dành những tình cảm thân thương - đó là ng̀ n ̣ng lực ma ̣nh mẽ để có thể hoàn thành bản luâ ̣n văn này Hà Nội, ngày tháng năm 2014 HỌC VIÊN Phạm Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao Thế giới và Viêṭ Nam 1.1.1 Tình hình thiệt hại nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao gây nên 1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora 1.1.3 Qui luật phát sinh và phát triển của bệnh 1.1.4 Một số nghiên cứu về phân lập nấm Phytophthora 1.1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định các loài nấm Phytophthora gây hại trồng 1.2 Tình hình nghiên cứu biện pháp phịng trừ sinh học bệnh thối đen quả ca cao Thế giới và Viêṭ Nam 11 1.2.1 Nấm Trichoderma sp đối kháng nấm P palmivora 12 1.2.2 Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 18 Chƣơng 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nội dung nghiên cứu 21 2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 21 2.2.2 Các trang thiết bị và dụng cụ 22 2.2.3 Nguồn vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 22 2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp phân lập, xác định nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 23 2.4.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc tính gây bệnh của nấm Phytophthora palmivora quả ca cao 25 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái , sinh học, sinh thái của nấ m P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 25 2.4.4 Phân lập và tuyển chọn số vi sinh vật đối kháng nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao điều kiện phòng thí nghiệm 26 2.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sinh hóa của số nấm Trichoderma sp có khả đối kháng cao với nấm P palmivora 28 2.4.6 Nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P palmivora 30 2.4.7 Định loài nấm kỹ thuật sinh học phân tử 33 2.4.8 Xác định loài vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 35 2.4.9 Chỉ tiêu theo dõi chung 36 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Xác định tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao 37 3.1.1 Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 37 3.1.2 Lây bệnh nhân tạo để xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 42 3.1.3 Xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao kỹ thuật sinh học phân tử 44 3.2 Đặc điểm hình thái nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 48 3.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 52 3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của sợi nấm 52 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của sợi nấm 54 3.3.3 Ảnh hưởng của độ pH tới sự phát triển của sợi nấm P palmivora …… ….60 3.3.4 Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến nấm P palmivora 57 3.4 Xác định số vi sinh vật có khả đối kháng với nấm P palmivora 59 3.4.1 Phân lập các vi sinh vật đối kháng các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông 59 3.4.2 Xác định khả đối kháng của các vi sinh vật có ích với nấm gây bệnh 62 3.4.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học của các chủng nấm Trichoderma phân lập 67 3.4.4 Định danh nấm Trichoderma kỹ thuật sinh học phân tử 73 3.4.5 Nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối kháng với nấm P palmivora 74 3.4.6 Xác định đặc điểm phân loại của các vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora kỹ thuật sinh học phân tử 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT Viết tắt Cụm từ a, b, c, d : Phân lớp sự sai khác giữa các công thức AFLP : Kỹ thuật phân tích đa hình đoạn dài kh́ch đại CA : Mơi trường cà rốt, agar CMA : Môi trường cà rốt, bột ngô, agar cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Độ biến động của thí nghiệm (%) DNA : Axit deoxyribonucleic ĐC : Đối chứng ĐK : Đường kính HQ : Hiệu quả IRRISTAT : Phần mềm thống kê nông nghiệp KH : Ký hiệu PCA : Môi trường khoai tây, cà rốt, agar PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp PDA : Môi trường khoai tây, dextrose, agar RFLP : Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn sp : Một loài spp : Nhiều loài VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả bẫy nấm Bảng 3.2 Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao 37 Ảnh hưởng của thuốc Benlat 80WP đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh thối đen quả ca cao 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thuốc Tachigaren 30L đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây thối đen quả ca cao 40 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh RH đến khả phân lập nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao 41 Bảng 3.5 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các chủng nấm Phytophthora sp Bảng 3.6 gây bệnh thối đen quả ca cao 43 Kết quả giải trình tự các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao 44 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Định danh các loài nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao dựa tìm kiếm sở dữ liệu 46 Đặc điểm hình thái các loài nấm Phytophthora palmivora phân lập từ ca cao 51 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 54 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 56 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 57 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 59 Bảng 3.13 Số chủng Trichoderma spp phân lập từ tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông 60 Bảng 3.14 Số chủng vi khuẩn phân lập từ tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông có khả đối kháng nấm P palmivora 61 Bảng 3.15 Khả ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp nấm P palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao 63 Bảng 3.16 Khả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 65 Bảng 3.17 Hiệu quả ức chế của số chủng vi khuẩn phân lập với nấm P palmivora gây thối đen quả ca cao 66 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 69 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 71 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 72 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp (F30711) 73 Bảng 3.22 Định tính hoạt độ enzyme của các chủng nấm Trichoderma sp có triển vọng đối kháng cao với nấm P palmivora 73 Bảng 3.23 Giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi Ngân hàng Gen (GenBank) 75 Bảng 3.24 Khả lên men yếm khí của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 76 Bảng 3.25 Khả khử nitrat của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 77 Bảng 3.26 Khả đồng hóa nguồn Các bon từ đường Glucose, Sacarose, tinh bột tan và rượu Mannitol của các chủng vi khuẩn có triển vọng 78 Bảng 3.27 Khả chịu mặn của các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 79 Bảng 3.28 Định tính hoạt độ enzyme của số chủng vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora 80 Bảng 3.29 Kết quả xác định loài vi khuẩn đối kháng nấm P palmivora sinh học phân tử 81 DANH MỤC HÌ NH Trang Hình 1.1 Sơ đờ chu trình số ng của nấ m Phytophthora Hình 1.2 Hình thái học của Phytophthora palmivora Hình 3.1 Cây phả hệ không rễ dựa chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ của 20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao Việt Nam với các loài Phytophthora 47 Hình 3.2 Đặc điểm của bào tử nang 48 Hình 3.3 Bào tử nang hình thành cành bào tử mọc dạng sym 49 Hình 3.4 Bào tử hậu hình thành đỉnh sợi và giữa sợi 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng của mơi trường ni cấy đến sự phát triển của nấm P palmivora 53 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P palmivora 56 Hình 3.7 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P palmivora 58 Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm P palmivora 58 Hình 3.9 Đồ thị thể hiện tỷ lệ phân lập các chủng nấm Trichoderma spp thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nơng 61 Hình 3.10 Đồ thị thể tiện tỷ lệ phân lập các chủng vi khuẩn có triển vọng đối kháng nấm P palmivora 62 Hình 3.11 Hiệu quả ức chế của các chủng nấm Trichoderma spp nấm P palmivora 63 Hình 3.12 Khả ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm P palmivora 64 Hình 3.13 Hiệu quả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 65 Hình 3.14 Khả ức chế nấm P palmivora chất kháng sinh bay của các chủng nấm Trichoderma spp 66 Hình 3.15 Hiệu quả ức chế của số chủng vi khuẩn phân lập với nấm P palmivora 67 Hình 3.16 Khả đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm P palmivora 67 ... PHẠM THỊ TÂM NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO VÀ MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số : 60420107 LUẬN... nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao Thế giới và Vi? ?ṭ Nam 1.1.1 Tình hình thiệt hại nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen ca cao gây nên Bệnh thối đen. .. ? ?Nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen ca cao số vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh? ?? Đề tài nhằm hướng tới hai mục tiêu chính: (i) xác đinh đặc điểm ca? ?c chủng nấm Phytophthora