Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến năng suất chất lượng của nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM --- VŨ HOÀI NAM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyceps

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -

VŨ HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CỦA NẤM

ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)

Ngành Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngươi hướng dẫn khoa học: PGS.TS Dương Văn Cường

THÁI NGUYÊN – 2018

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Dương Văn Cường đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS Ma Thị Trang cùng các cán bộ Viện Khoa học sự sống trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Học Viên

Vũ Hoài Nam

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo 4

1.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ thảo 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.4 Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 6

1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 7

1.2.1 Giá trị dược liệu 7

1.2.2 Giá trị dinh dưỡng 11

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 13

1.3.1 Vai trò của giống 13

1.3.2 Yếu tố dinh dưỡng 14

1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá thể nhân tạo thể rắn 15

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trên Thế gới 19

iii

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 21

2.1 Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21

2.2 Hóa chất và thiết bị 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Bố trí thí nghiệm 23

2.4.2 Phương pháp chuẩn bị giống cấp I 23

2.4.3 Phương pháp cấy giống 24

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

2.4.5 Phương pháp phân tích hàm lượng cordycepin 27

2.5 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 31

2.6 Chỉ tiêu theo dõi 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nhân giống cấp I tới sinh trưởng và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo 32

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại gạo khác nhau dùng làm giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triên nấm Đông trùng hạ thảo 35

3.3 Ảnh hưởng của các nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 37

3.4 Ảnh hưởng của các nguồn ni to đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 42

iv

3.5 Ảnh hưởng của muối đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm, sự hình thành

và phát triển của quả thể, năng suất sinh học 46

3.6 Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa các nguồn dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo. 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PDA : Potatose dextrose Aga

SDAY : Sabouraud Maltose aga plus Yeast Extract SMAY : Sabouraud Dextrose aga plus Yeast Extract

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nấm ĐTHT Cordyceps militaris 12

Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 21Bảng 3.1: So sánh về tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên môi trường nhân giống cấp I 33Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đến sự phát triển của hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo 34Bảng 3.3: bảng tổng hợp đánh giá khả năng thích nghi của hệ sợi nấm trên các loại cơ chất giá thể khác nhau 35Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các cơ chất gạo đến sự hình thành

và phát triển của mầm quả thể, năng suất sinh học 36Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn carbon tới năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 40Bảng 3.6: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn carbon tới hàm lượng Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT 41Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng các nguồn ni to khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 44 Bảng 3.8: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hàm lượng Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT 45Bảng 3.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 48Bảng 3.10: Bảng phân tích ảnh hưởng của nguồn muối khoáng tới hàm lượng Cordycepine ở quả thể nấm ĐTHT 49Bảng 3.11: Xác định nguồn dinh dưỡng và mức biến đổi các yếu tố dinh dưỡng 50Bảng 3.12: Ma trận kết quả mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng tới năng suất nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 51

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 4

Hình 1.2 Phân loại nấm Cordyceps 5

Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo 6

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo 30

Hình 3.1: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên các môi trường nhân giống cấp I sau 10 ngày 32

Hình 3.2: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris ở môi trường PDA có bổ sung các nồng độ pepton khác nhau sau 15 ngày 34

Hình 3.3: Kết quả khảo sát mật độ quả thể nấm ĐTHT trên các loại cơ chất gạo khác nhau 37

Hình 3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 38

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 39

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 41

Hình 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn ni tơ đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 42

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 43

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 44

Hình 3.10 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng đến khả năng sinh trưởng của sợi nấm 46

Hình 3.11 Ảnh hưởng của muối khoáng tới sinh trưởng và phát triển của quả thể nấm Đông trùng hạ thảo 47

Hình 3.12 Ảnh hưởng của các muối khoáng khác nhau tới năng suất nuôi trồng nấm 49

1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung chỉ những loài nấm thuộc lớp

Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes Tên gọi

của chúng bắt nguồn từ những quan sát thực tế: vào mùa Đông bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực vật (Hạ thảo)

vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo

Từ y học cổ truyền Trung Hoa cho đến y học hiện đại của các nước phát

triển Mỹ, châu Âu đều công nhận giá trị dược lý của đông trùng hạ thảo C

militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể:

Cordycepin có tác dụng ức chế sự phân hạch và trì hoãn sự lây lan của các tế bào ung thư (Khan, Tania et al 2010); Adenosine được chứng minh có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch; Mannitol có tác dụng làm tăng độ thẩm

thấu của huyết tương và dịch trong ống thận, gây lợi niệu thẩm thấu và làm tăng

lưu lượng máu thận; Superoxide dismutise để phòng ngừa và điều trị xuất huyết

não, viêm loét, loại bỏ tình trạng viêm, loạn nhịp tim, phù nề, nhiễm độc, bệnh thấp khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương bức xạ, nhiễm độc thuyên tắc Ngoài ra, trong dịch chiết Đông trùng hạ thảo còn chứa chứa nhiều loại vitamin và acid amin thiết yếu cho cơ thể

Do có công dụng tốt nên nhu cầu sử dụng ĐTHT ngày càng tăng cao, trong khi đó nguồn cung cấp từ tự nhiên mỗi năm chỉ đáp ứng được m nhu cầu thị trường Bên cạnh đó, hoạt động khai thác quá mức có thể khiến loài nấm này có nguy cơ bị tuyệt chủng Trước tình hình đó, các nhà khoa học trên thế giới như đã tiến hành nghiên cứu nuôi ĐTHT trên môi trường nhân tạo Trong

các loài thuộc chi Cordyceps, Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris là hai

loài phổ biến và được nghiên cứu nhiều hơn cả Các hướng nghiên cứu hiện nay

2

chủ yếu theo ba con đường: Một là ĐTHT được nuôi trên ký chủ côn trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao Hai là, nuôi cấy ĐTHT trên môi trường dịch lỏng với mục tiêu là nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất chính là Cordycepine; tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử

lý nguồn nước thải sau khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi hoạt chất còn phức tạp và giá thành cao Hướng thứ ba là nuôi trên giá thể rắn nhân tạo, đây là một hướng đi đầy tiềm năng do: Việc thu hoạch quả thể nấm trên giá thể nhân tạo không những có thể thu hoạch được hoạt chất sinh học vốn quý trong nấm mà còn có thêm các acid amin và các vitamin thiết yếu khác Bên cạnh đó, nguồn cơ chất nhân tạo còn lại có thể tận dụng phục vụ cho công tác chăn nuôi Hơn nữa các báo cáo trước đây đã chứng minh rằng trên quả thể của nấm có chứa nhiều các hoạt tính sinh học hơn trong các sợi nấm

Tại Việt Nam, cho đến nay mặc dù đã có nhiều cơ sở và đơn vị nhân nuôi thành công nấm Đông trùng hạ thảo, tuy nhiên nuôi trồng Đông trùng hạ thảo trên môi trường nhân tạo gặp phải những khó khăn: Nấm C.militaris có tính thoái hóa cao nên việc sản xuất nấm không ổn định, hoặc ở một vài nơi mặc dù nuôi trồng thành công nhưng hàm lượng hoạt chất sinh học không cao Xuất

phát từ những quan điểm đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh

hưởng của các điều kiện môi trường đến năng suất, chất lượng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”

2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá được ảnh hưởng môi trường nhân giống và các điều kiện dinh

dưỡng tới khả năng sinh tổng hợp Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris trên môi trường giá thể thể rắn

3

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng tới năng suất và hàm lượng

hoạt chất Cordycepine ở nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Tên gọi Đông trùng hạ thảo

Đông trùng Hạ thảo (ĐTHT) tên khoa học là Cordyceps, chỉ hiện tượng những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bọ cánh phấn thuộc chi Thitarodes Tên gọi chúng xuất phát từ quan sát thực tế: vào mùa

Đông bào tử nấm xâm nhiễm, ký sinh trong cơ thể ấu trùng (Đông trùng), đến mùa hè quả thể nấm mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất trông giống một loại thực vật (Hạ thảo) vì vậy nó có tên là Đông trùng hạ thảo

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 1.1.2 Nguồn gốc và phân loại

ĐTHT trong tự nhiên được phát hiện chủ yếu ở một số cao nguyên của Nepal, Ấn Độ, Trung Quốc và Bhutan…, trung bình các cao nguyên này có độ cao từ 3500m đến 5000m so với mặt nước biển Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm cấu trúc phân tử, Đông trùng hạ thảo được xếp vào phân

giới nấm (Fungi), ngành nấm túi (Ascomycota), lớp Sordariomycetes, bộ

Các loài thuộc chi Cordyceps khác nhau lây nhiễm ở giai đoạn nhộng và các

ký chủ khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ Vào cuối thu hoặc đầu mùa đông, bào tử nấm nhờ gió phát tán ra bên ngoài và tìm kiếm cơ thể ký chủ phù hợp Khi tiếp xúc với ký chủ, bào tử nấm bắt đầu hı̀nh thành các ống nảy mầm

có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease… làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Một vài

loài Cordyceps còn có khả năng tác động tới hành vi vật chủ, khiến chúng phải

leo lên cây và gắn mình vào đó trước khi chết để đảm bảo sự phát tán bào tử một cách tối đa Sau đó các bào tử bắt đầu hình thành hệ sợi, hê ̣sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ gây chết ký chủ Khi thời tiết ấm áp hơn,

6

hệ sợi nấm bắt đầu phát triển một cách mạnh mẽ hình thành quả thể và chồi lên khỏi mặt đất và tiếp tục vòng sinh sản mới nhờ phát tán bào tử

Hình 1.3 Vòng đời sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.4 Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

Trong cây phân loại loài, Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được

xem là loài có đặc điểm tiến hóa nhất chi Cordyceps do có phổ kí chủ rộng Chúng có thể kí sinh trên cả sâu non, nhộng hoặc cá thể trưởng thành của một số

loại côn trùng Cordyceps militaris là một loài sinh sản vô tính, sau khi phát

triển thành thục có thể hình thành các nang bào tử; bên trong các nang bào tử là tập hợp các bào tử đơn và phát tán vào trong không khí Các bào tử này trong điều kiện thích hợp sẽ nảy chồi tạo thành các sợi nấm sơ cấp Các sợi nấm sơ cấp một mặt không ngừng phát triển để tạo hệ sợi thứ cấp, một mặt tiếp tục xâm nhập vào cơ thể côn trùng sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ thể côn trùng Kết thúc giai đoạn sinh trưởng, các hệ sợi thứ cấp được liên kết với nhau tạo thành một khối thồng nhất gọi là quả thể nấm Quả thể nấm có màu vàng cam hoặc cam hồng dài khoảng từ 2 – 8 cm Quả thể nấm tiếp tục phát triển đến giai đoạn thành thục và phát tán bào tử bắt đầu chu kì sinh trưởng và phát triển mới

7

So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris nuôi trồng dễ hơn trong môi trường nhân tạo Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng được xem như

là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có hoạt tính sinh học

và tính chất dược liệu tương tự nhau Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã

chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa nhiều loại thành phần có hoạt tính

sinh học như cordycepin, ergosterol, mannitol và polysaccharides

1.2 Giá trị nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

1.2.1 Giá trị dược liệu

 Giá trị dược liệu theo y học cổ truyền

Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục

Những năm gần đây, các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được những công dụng chữa bệnh và bồi bổ cơ thể mà các nhà Y học cổ truyền đã sử dụng

do các hoạt chất sinh học quý trong quả thể nấm: Cordycepin deoxyadenosine) có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus (Zhou, Meyer et al 2002); Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch (Tsai, Lin et al 2010); Mannitol cũng có chức năng hoạt tính sinh học, giúp lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu (Li, Yang et al 2006)… và nhiều loại vitamin khác

(3’-8

 Giá trị dược liệu theo y học hiện đại

Đã có những nghiên cứu phân tích được một số thành phần có hoạt chất có trong nấm Đông trùng hạ thảo như cordycepin (3'-deoxyadenosine), ergothioneine, ergosterol, D-mannitol, γ-aminobutyric acid (GABA), và polysaccharides Do có nhiều hoạt tính hữu ích nên đã được sử dụng cho nhiều mục đích y học (Mizuno T 1996) Đến nay, hơn 10 nucleoside và các thành phần liên quan của nó (bao gồm adenine, adenosine, cytidine, cytosine, guanine, guanosine, uracil, uridine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, 2` deoxyuridine, 2`-deoxyadenosine, cordycepin N6-methyladenosine, và 6-hydroxyethyl-adenosine) đã được xác định và tách chiết (Chang ST and Wasser

SP 2012)

Một số hoạt chất quan trọng mang giá trị dược liệu

Cordycepin (3'-deoxyadenosine)

Cordycepin là thành phần hoạt chất chính có trong quả thể Cordyceps

militaris, được phát hiện lần đầu tiên từ Cordyceps militaris và sau đó tìm thấy

có mặt trong Cordyceps sinensis (Cunningham, Manson et al 1950) và

Cordyceps kyushuensis (Ling JY, Sun YJ et al 2002)

Theo Khan và cộng sự (2010), Cordycepine trong ĐTHT có khả năng ức chế sự phát triển của khối U, tăng thời gian sống cho những con chuột được cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự di căn của tế bào ung thư (Asaduzzaman Khan, Mousumi Tania et al 2010) Dịch chiết từ nấm ĐTHT ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn (HUVEC), dòng tế bào mô mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT180 Dịch chiết của nấm này cũng giảm metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080 Mới đây người

ta cũng đã phát hiện ra một emzym phân giải protein từ các quả thể khô của

Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và ung

thư bàng quang

9

Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư Trong một nghiên cứu

Park et al (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế

bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế bào) (Park, Na et al 2009) Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng

ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết nấm Cordyceps

militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594

Adenosine (C10H13N5O4)

Nucleotides (bao gồm adenosine, uridine, cytidine, uracil và guanosine)

là các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris (Kredich NM and

Guarino AJ 1961) Adenosine có nhiều tác dụng dược lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính và ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương Các nucleosides khác cũng có thể được sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác nhau Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ thần kinh kích thích Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy rằng adenosine là một bộ điều biến có tác dụng ức chế và tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó bao gồm quy định của giấc ngủ và mức độ hưng phấn, rối loạn thần kinh, quy định

về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động của ethanol

và chất gây nghiện Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính của phân nhóm của các thụ thể adenosine trong mạch máu, cũng như ảnh hưởng của các thụ thể adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên Carlezon et al (2005) nhận thấy rằng cytidine có tác dụng chống trầm cảm giống như trong các thử nghiệm bơi

ở chuột (Baik JS, Kwon HY et al.)

Cordycepic acid (D-mannitol)(C 6 H 14 O 6 )

Cordycepic acid, một chất đồng phân của axit quinic, là một trong những thành phần dược phẩm chính hoạt động Cordycepic acid đã được xác định là D-

10

mannitol Mannitol là một chế phẩm sinh học với hoạt động sinh học quan trọng Hàm lượng của mannitol trong loài Cordyceps thay đổi theo môi trường sống Nghiên cứu cho thấy, có khoảng 25-80 mg/g ở trong quả thể nấm (Chatterjee R, Srinivasan KS et al 1957),(Liu JM, Zhong YR et al 1989)

Polysaccharides

Một số polysaccharides và đường khác đã được xác định có trong chiết xuất

Cordyceps militaris và các hoạt động dược lý của chúng đã được nghiên cứu

Những polysaccharides có hiệu quả trong việc điều chỉnh lượng đường trong máu, ngăn ngừa di căn, chống ung thư cũng như bảo vệ gan và tác dụng hạ huyết áp (Kim JR, Yeon SH et al 2002),(Yu R, Song L et al 2004)

CB, Cohen PA et al 2007)

GABA

GABA là một trong những chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong hệ thống thần kinh trung ương và ức chế dẫn truyền thần kinh giao cảm ngoại biên Một vai trò quan trọng đối với GABA ở cả điều khiển hệ thống thần kinh trung ương

và ngoại vi đến huyết áp đã được chứng minh (Suzuki R, Maehara R et al 2012)

11

GABA cũng có vai trò miễn dịch khuếch đại trong các bệnh viêm thần kinh chẳng hạn như bệnh đa xơ cứng (Carmans S, Hendriks J et al 2013)

Ergothioneine

Ergothioneine là một dẫn xuất histidine với lưu huỳnh vào vòng imidazole

và amin trimethylated (Turner E, Klevit R et al 1986)

Nhiều thử nghiệm cho thấy đây là chất chống oxy hóa và có khả năng hoạt hóa các tế bào chống lại một loạt các yếu tố gây stress tế bào (Cheah I and Halliwell B 2012)

Ergothioneine đã được chứng minh là chất tác dụng ngăn ngừa bức xạ và dọn dẹp các gốc tự do, các gốc hydroxyl, axit hypochlorous, và các gốc peroxyl cũng như để ức chế nitrat peroxynitrite vào các protein và DNA (Dubost NJ, Beelman RB et al 2007)

Tuy nhiên, ergothioneine là hầu như chỉ được sản xuất bởi nấm và một số sinh vật nhân sơ (Bello M, Barrera-Perez V et al 2012) Ergothioneine chỉ có thể được hấp thụ từ chế độ ăn uống và không thể tự sinh tổng hợp được ở người

1.2.2 Giá trị dinh dưỡng

Bên cạnh các giá trị dược liệu đã được y học hiện đại chứng minh, các phân tích dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo cũng cho thấy trong thành phần của nấm có nhiều acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu )

Tác giả Hur 2008 cũng công bố một số kết quả nghiên cứu về thành phần

hóa học của nấm ĐTHT Cordyceps militaris như sau:

13

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris

1.3.1 Vai trò của giống

Quả thể nấm được sinh ra cần phải có các điều kiện cần và đủ, đó là giống nấm và cơ chất có nguồn carbon Trong đó, giống nấm là yếu tố quyết định đến sản lượng và chất lượng của nấm làm ra Một giống khỏe mạnh sẽ sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và có khả năng hình thành quả thể tốt Mỗi giống lại có một khoảng thời gian sử dụng nhất định, vượt qua ngưỡng thời gian này sức sinh trưởng của nấm sẽ giảm, giống bị suy thoái Một số dấu hiệu của giống thoái hóa bao gồm: giảm tỷ lệ sinh trưởng, mật độ hệ sợi thấp, năng suất thấp hoặc hình thái quả thể bị biến dạng Các chủng thoái hóa có hoạt tính dehydrogenase giảm, quả thể nấm thay đổi sắc tố Bản chất của thoái hóa giống ở các chủng ĐTHT nói riêng và các loại nấm khác nói chung là do đột biết DNA(Li, Wu et al 2003) Càng nuôi trồng qua nhiều thế hệ thì tần số đột biến DNA càng lớn dẫn đến các tình trạng thoái hóa càng cao

Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng thoái hóa giống là do phương pháp phân lập Hiện nay có 3 phương pháp phân lập được sử dụng rộng rãi là: phân lập mô tế vào, phân lập đơn bào tử và phân lập bào tử phức Giống được tạo ra bằng phương pháp phân lập mô tế bào hoặc bào tử phức có thời gian thoái hóa nhanh hơn, có thể sau 1, 2 lần cấy chuyển (Shrestha, Park

et al 2004) Để hạn chế quá trình thoái hóa giống, người ta sử dụng các chủng phân lập từ đơn bào tử

Ngoài ra, vật liệu nuôi trồng giống cũng có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng

và phát triển của nấm trên cơ chất Có 2 loại giống được sử dụng trong nuôi

trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là giống dạng rắn và giống dịch

thể Cho đến nay, việc sử dụng giống dạng dịch thể là công cụ mang lại hiệu

14

quả cao nhất (Shrestha, Park et al 2004) Giống nấm trên cơ chất rắn có xu hướng chuyển sang màu vàng và có tốc độ lan hệ sợi chậm hơn, thời gian cảm ứng hình thành quả thể cũng lâu hơn

1.3.2 Yếu tố dinh dưỡng

1.3.2.1 Nguồn dinh dưỡng carbon

Nấm ĐTHT cần một lượng lớn carbon trong quá trình sinh trưởng phát triển Nguồn carbon cung cấp vật chất cho quá trình sinh trưởng, tổng hợp hợp chuyển hóa năng lượng cho các hoạt động của tế bào Hàm lượng carbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô quả thể nấm Nguồn carbon thích hợp cho nấm phát triển gồm các monosacharide và polysacharide… Nấm có sự khác biệt rất lớn trong việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn carbon có thể sử dụng để nuôi trồng nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó thích hợp

nhất là những loại có cấu trúc phân tử nhỏ (Shrestha et al., 2012)

1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng ni tơ

Ni tơ là nguyên tố bắt buộc để tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc nên tế bào Dinh dưỡng ni tơ có thể được lấy từ nguồn ni tơ hữu cơ tự nhiên, nguồn ni tơ tổng hợp, nguồn ni tơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni

Theo Gao et al (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng ni

tơ tương đối thấp Nếu hàm lượng ni tơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể

1.3.2.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có thể làm tăng năng suất quả thể Một vài nguyên tố có thể làm tăng hoạt chất sinh

học của Cordyceps militaris (Dong et al., 2012)

15

1.3.2.4 Các loại vitamin

Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin

cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm lượng vitamin nhất định

1.4 Tiềm năng nuôi trồng Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên giá

thể nhân tạo thể rắn

Do có chứa nhiều hoạt chất sinh học quý: cordycepin, adenosin,

polysaccharides, ergosterol và mannitol nên từ lâu ĐTHT được coi là một loại

thảo dược quý, có nhiều giá trị dược liệu trong việc hạ đường huyết, chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi hóa, tăng hoạt lực của tinh trùng Tuy nhiên, ĐTHT trong tự nhiên sản lượng rất ít nên để tìm kiếm và sử dụng ĐTHT tự nhiên làm dược phẩm hoặc thực

phẩm chức năng là vấn đề không khả thi (Hong,2010)

Những nghiên cứu ban đầu trên thế giới về môi trường nuôi trồng ĐTHT được thực hiện trên côn trùng, mặc dù sản lượng đã được cải thiện song vẫn chưa đáp ứng được ở quy mô công nghiệp và chi phí sản xuất vẫn còn cao Bên cạnh đó, việc tập trung sản xuất các chất hoạt chất quý trong nấm ĐTHT mà không thu quả thể bằng phương pháp lên men lỏng cũng đang được hướng tới Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là khâu xử lý nguồn nước thải sau khi thu hồi hoạt chất, đồng thời việc tách chiết thu hồi hoạt chất còn phức tạp

16

còn có thêm các acid amin và các vitamin thiết yếu khác Bên cạnh đó, nguồn

cơ chất nhân tạo còn lại có thể tận dụng phục vụ cho công tác chăn nuôi không

có sản phẩm phụ thải ra môi trường

Theo Li và cộng sự (2004), ngũ cốc và một số chất hữu cơ khác: bột đậu, hạt ngô, lõi ngô, vỏ hạt bông, kê, lúa miến, lúa mì, ngũ gốc, hoa hướng dương được chứng minh là cơ chất tốt để thay thế côn trùng (Li et a., 2004; Zhao et al., 2006) Năm 2014, Ting-chi Wen cho thấy sự hình thành quả thể của nấm ĐTHT trên cơ chất gạo cho năng suất cao hơn đáng kê so với các loại giá thể khác (Ting, 2014) Kể từ đó, gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu cho sự sinh trưởng quả thể của ĐTHT (Li, 2002; Zhang 2003; Li et al., 2006; Wen et al., 2008)

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt

được một số kết quả Việc nghiên cứu mang tính chất điều tra, phát hiện, thu

thập và bước đầu phân lập chúng trong điều kiện Việt Nam

Nghiên cứu về thành phần loài:Trịnh Tam Kiệt (1996) đã nêu danh mục các loài nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họ Clavicipitaceae có 3

loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis

và loài Cordyceps sobolifera Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông trùng hạ thảo có

phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa,

Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh (Trịnh Tam Kiệt 1996)

Năm 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học

Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT ( Cordyceps nutans ) tại

khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tác giả Phạm Quang Thu

17

đã thông báo phát hiện được loài nấm ĐTHT và được giám định là loài

Cordyceps nutans Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân

bố tại Việt Nam (Phạm Quang Thu 2009)

Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát

hiện nấm ĐTHT Cordyceps Gunnii (Phạm Quang Thu 2009)

Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT

Cordyceps militaris ( Nấm nhộng trùng thảo) (Phạm Quang Thu and Nguyễn

Mạnh Hà 2009)

Nấm ĐTHT Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở

Việt Nam Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh

vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ, phần

đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ (Phạm Quang Thu and Nguyễn Mạnh Hà 2009)

Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cứu

nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng

nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m

Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung

Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris

PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người Kết quả

đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là:

- Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc

18

- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh

- Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang

Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số

vitamin và một số nguyên tố vi lượng (Phạm Thị Thuỳ 2010)

Trần Văn Mão (2002) đã nêu sơ bộ về môi trường nhân giống, kỹ thuật

nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Tuy

nhiên, những thông tin này đều tập hợp từ các nguồn tài liệu tham khảo của Trung Quốc

Phạm Quang Thu (2009) đã thử nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể

nhân tạo chủng nấm CM1 loài Cordyceps militaris, chủng giống đang nuôi

trồng với quy mô công nghiệp tại Quảng Châu, Trung Quốc Kết quả đã thu được thể quả nấm phát triển bình thường trên giá thể (Phạm Quang Thu and Nguyễn Mạnh Hà 2009)

Năm 2015, Trung tâm Công Nghệ Sinh học – Viện Di truyền Nông nghiệp công bố bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng Nhộng trùng thảo (

Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho biết loại gạo

Lứt có thể sử dụng làm cơ chất nền phù hợp trong môi trường nuôi trồng nhộng trùng thảo với năng suất sinh học cao nhất (Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà et al 2015)

Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu Đông trùng hạ thảo

Cordyceps ở Việt Nam Qua các nghiên cứu trên cho thấy việc tiếp tục nghiên

cứu và đi sâu hơn vào kỹ thuật trồng loài nấm này để cung cấp nguyên liệu cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng là hoàn toàn cần thiết tại Việt Nam Đáp ứng nhu cầu bảo vệ sức khỏe con người

19

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trên Thế gới

Nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được tiến

hành ở nhiều nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương Tây

và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm Tại Thái Lan, Wongsa P và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của

hệ sợi và hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps ký sinh kiến Môi trường

PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi (WONGSA P, TASANATAI K et al 2005)

Jae Sung Kim và đồng tác giả (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng tằm

để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris Nhộng tằm được đựng trong

trong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở 121oC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20-25oC, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O (Kim Jae-Sung, Yingai Jin et al 2006)

Hai loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris được tập trung nghiên

cứu nuôi lấy sinh khối hệ sợi nhiều nhất (Russell R and Paterson M 2008)

20

Duck-Hyun Cho và đồng tác giả (2003), tại Hàn Quốc, đã tiến hành nghiên cứu

sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là 7208; 7845;

CHO-7846 của loài Cordyceps militaris trên môi trường dinh dưỡng và quá trình hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina

dichotoma Linnaeus Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng

khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thuần khiết Chỉ có 2 chủng CHO-7208

và CHO-7846 hình thành thể quả khi sử dụng sâu non Allomyrina dichotoma

Linnaeus làm giá thể Chiều dài của thể quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy (Vijayan K and H)

Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học

BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps militaris Sản

phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế

21

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng giống Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris nhập nội tại ngân

Cân phân tích Pank Chất khử trùng (cồn 70o)

Nồi hấp vô trùng Cốc đong, ống đong Glucose

Tủ an toàn sinh học cấp II Đĩa petri MgSO4

Máy điều hòa Túi nilon,Chun nịt Peptone

22

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gene – Viện Khoa học sự sống

– Đại học Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2017 đến tháng 9/2018

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nhân giống cấp

I tới sinh trưởng và phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại gạo khác nhau dùng làm giá thể tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất Cordycepine

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn ni tơ đến khả năng sinh trưởng và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng muối khoáng đến khả năng sinh

trưởng và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

- Nội dung 6: Xây dựng mối tương quan giữa các yếu tố dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 hoặc 4 công thức tùy theo mỗi thí nghiệm , mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 mẫu

Chủng nấm ĐTHT được cấy trên các môi trường nhân giống cấp I khác nhau Các môi trường nhân giống cấp I được sử dụng như sau:

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường

nhân giống cấp I Công

thức

Ký hiệu Môi trường nhân

giống cấp I

Thành phần dinh dưỡng

chiết khoai tây 200g/L

2 CT2 SMAY Maltose 40g/L; ; Peptone 10 g/L;

Cao nấm men 10 g/L, agar 20g/L

3 CT3 SDAY Dextrose 10g/L; Peptone 2,5 g/L;

Cao nấm men 5 g/L; Agar 20g/L

Dextrose 10g/L, Glucose 4g/L; pepton 6 g/L; cao nấm men 4 g/L;

24

như: đậu, ngô, hạt kê, lúa mì, ngũ gốc… Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những nước hàng đầu về xuất khẩu gạo, nhiều loại gạo nổi tiếng và đa dạng về các đặc tính gạo dẻo, gạo khô, gạo xốp, gạo nở… Do đó chúng tôi lựa chọn các loại gạo có đặc tính khác nhau để nghiên cứu

Các loại gạo được sử dụng tương ứng với các đặc tính chín nở khác nhau,

bố trí thí nghiệm được thể hiện như sau:

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá

thể khác nhau Công thức Ký hiệu Loại gạo được sử dụng Đặc tính chín nở

+ Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

Nguồn carbon cung cấp vào môi trường được nấm sử dụng để tổng hợp nên các chất như: hydratcarbon, amino acid, acid nucleis, lipid… cần thiết cho

sự phát triển của nấm Bên cạnh đó, nấm sử dụng nguồn carbon là nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu sử dụng carbon cũng khác nhau Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát các nguồn carbon khác nhau

Để nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn carbon khác nhau đến khả năng sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo, tôi tiến hành thực hiện cấy giống nấm

Cordyceps militaris trên 3 nguồn Carbon khác nhau: Glucose, Saccarose,

Mantose và môi trường đối chứng không được bổ sung nguồn carbon:

+ Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn ni tơ đến khả năng sinh trưởng

và hàm lượng Cordycepine của nấm Đông trùng hạ thảo

Ni tơ được cho là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho môi trường nuôi cấy nấm Đông trùng hạ thảo Hệ sợi nấm sử dụng nguồn ni tơ để tổng hợp cá chất hữu cơ như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào

Để nghiên cứu sự ảnh hưởng nguồn ni tơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo, tôi tiến hành thực hiện cấy giống nấm

Cordyceps militaris trên 3 nguồn ni tơ khác nhau: Peptone, Cao nấm men,

Cao mal và môi trường đối chứng không được bổ sung nguồn ni tơ

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn ni tơ Công thức Ký hiệu Nguồn ni tơ bổ sung