Phân lập tuyển chọn và khảo nghiệm các dòng vi khuẩn azospirillum nội sinh trên sinh trưởng và năng suất của lúa cao sản trồng trên đất phù sa ngọt tại tỉnh an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THANH HỒNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO NGHIỆM CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM NỘI SINH TRÊN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT CỦA LÚA CAO SẢN TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÙ SA NGỌT TẠI TỈNH AN GIANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CẦN THƠ - NĂM 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THANH HOÀNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO NGHIỆM CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM NỘI SINH TRÊN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT CỦA LÚA CAO SẢN TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÙ SA NGỌT TẠI TỈNH AN GIANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ: 62420107 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN HỮU HIỆP CẦN THƠ - NĂM 2014 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i TÓM TẮT iv ABSTRACT v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH .x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 2.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY LÚA 2.1.1 Phân loại lúa 2.1.2 Họ hòa thảo (Poaceae) 2.1.3 Chi lúa (Oryza) .5 2.1.4 Các loài lúa trồng 2.1.5 Lúa hoang .8 2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG PHÂN BÓN .8 2.2.1 Tình hình sử dụng phân bón vơ 2.2.2 Tình hình sử dụng phân bón sinh học 2.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA GẠO TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 10 2.4 KHÁI QUÁT NÔNG NGHIỆP TỈNH AN GIANG 12 2.5 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM 14 2.5.1 Phân loại vi khuẩn Azospirillum 14 2.5.2 Đặc tính hình thái, sinh lý vi khuẩn Azospirillum 14 2.5.3 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Azospirillum 20 2.5.3.1 Đặc tính cố định đạm vi khuẩn Azospirillum .20 2.5.3.2 Đặc tính sử dụng nguồn carbon vi khuẩn Azospirillum 25 2.5.3.3 Đặc tính sử dụng acid amin vi khuẩn Azospirillum 26 2.5.3.4 Đặc tính khử acetylene vi khuẩn Azospirillum .29 2.5.3.5 Đặc tính tổng hợp chất điều hịa tăng trưởng Azospirillum 30 2.5.3.6 Đặc tính sinh thái vi khuẩn Azospirillum .35 2.5.4 Gen nif vi khuẩn Azospirillum 36 2.5.4.1 Gen nif Azospirillum 36 2.5.4.2 Cấu trúc gen nifH vi khuẩn Azospirillum .37 2.5.4.3 Chức gen nif Azospirillum 38 2.5.5 Tính đa dạng enzyme cố định đạm nitrogenase 43 2.5.5.1 Cấu trúc, chức enzyme nitrogenase 43 2.5.5.2 Các yếu tố hạn chế biểu enzyme nitrogenase .44 i 2.6 HỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AZOSPIRILLUM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 44 2.7 KỸ THUẬT PCR 47 2.7.1 Khái quát kỹ thuật PCR 47 2.7.2 Trình tự bước thực phản ứng PCR 48 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 49 3.1.1 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm .49 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm .50 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm 51 3.1.4 Địa điểm thí nghiệm .51 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 3.2.1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản lúa hoang 52 3.2.1.1 Môi trường nuôi vi khuẩn Azospirillum .52 3.2.1.2 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản trồng lúa hoang .53 3.2.2 Xác định đặc tính hình thái định danh vi khuẩn Azospirillum kỹ thuật sinh học phân tử 55 3.2.2.1 Đặc tính hình thái chuyển động vi khuẩn Azospirillum 55 3.2.2.2 Xác định kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum .55 3.2.2.3 Xác định Gram vi khuẩn Azospirillum .57 3.2.2.4 Định danh dòng vi khuẩn Azospirillum 57 3.2.3 Tuyển chọn Azospirillum lúa cao sản trồng phịng thí nghiệm 59 3.2.3.1 Mơi trường dung dịch trồng .59 3.2.3.2 Trồng lúa cao sản phịng thí nghiệm .59 3.2.3.3 Thu mẫu lúa phân tích tiêu nông học 60 3.2.4 Trắc nghiệm độ hữu hiệu Azospirillum lúa cao sản trồng nhà lưới 61 3.2.4.1 Trồng lúa cao sản nhà lưới 61 3.2.4.2 Thu mẫu lúa phân tích tiêu nơng học 61 3.2.5 Trắc nghiệm độ hữu hiệu Azospirillum lúa cao sản trồng đồng ruộng 62 3.2.5.1 Trồng lúa cao sản đồng ruộng 62 3.2.5.2 Thu mẫu lúa phân tích tiêu nơng học 62 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 4.1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản lúa hoang 64 4.1.1 Nguồn gốc mẫu lúa hoang lúa cao sản 64 4.1.2 Nguồn gốc dòng vi khuẩn Azospirillum 65 4.1.3 Môi trường nuôi vi khuẩn Azospirillum 67 4.2 Đặc tính hình thái định danh dịng vi khuẩn Azospirillum .70 ii 4.2.1 Đặc tính hình thái vi khuẩn Azospirillum 70 4.2.1.1 Hình dạng chuyển động vi khuẩn Azospirillum .70 4.2.1.2 Kích thước khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Azospirillum .71 4.2.1.3 Xác định Gram vi khuẩn Azospirillum .73 4.2.2 Định danh dòng vi khuẩn Azospirillum 73 4.2.2.1 Định danh vi khuẩn Azospirillum kỹ thuật PCR .73 4.2.2.2 Phân tích gel sản phẩm PCR 75 4.3 Tuyển chọn vi khuẩn Azospirillum lúa cao sản trồng phịng thí nghiệm 76 4.3.1 Màu lúa 77 4.3.2 Chiều cao lúa 77 4.3.3 Chiều dài rễ lúa sau thu hoạch 77 4.3.4 Hàm lượng đạm tổng số lúa .80 4.4 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum lúa cao sản trồng nhà lưới 80 4.4.1 Độ hữu hiệu Azospirillum lúa OM 6976 trồng nhà lưới 80 4.4.1.1 Chiều cao lúc 30 ngày lúc thu hoạch .80 4.4.1.2 Trọng lượng khô (TLK) thân trọng lượng (TL) 1.000 hạt 81 4.4.1.3 Số hạt lúa hàm lượng đạm hạt lúa .82 4.4.1.4 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum .83 4.4.2 Độ hữu hiệu Azospirillum lúa OM 4218 trồng nhà lưới 85 4.4.2.1 Màu trọng lượng khô thân .85 4.4.2.2 Chiều cao lúc 30 ngày lúc thu hoạch .86 4.4.2.3 Số hạt/bông lúa trọng lượng 1.000 hạt 88 4.4.2.4 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum .89 4.5 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum lúa cao sản trồng đồng ruộng 89 4.5.1 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum lúa OM 6976 trồng đồng 89 4.5.1.1 Màu chiều cao lúc 45 ngày sau sạ (NSKS) 89 4.5.1.2 Các tiêu nông học lúc thu hoạch lúa 90 4.5.2 Độ hữu hiệu Azospirillum lúa OM 4218 trồng ngồi đồng 94 4.5.2.1 Các tiêu nơng học lúa lúc 45 ngày sau sạ (NSKS) 94 4.5.2.2 Các tiêu nông học lúc thu hoạch lúa 96 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 100 5.1 KẾT LUẬN 100 5.2 ĐỀ XUẤT .100 TÀI LIỆU THAM KHẢO .102 iii TÓM TẮT Sáu mươi mẫu lúa (48 mẫu lúa cao sản 12 mẫu lúa hoang mọc lẫn ruộng lúa cao sản) thu thập để phân lập vi khuẩn cố định đạm Azospirillum Hình thái khuẩn lạc tế bào dòng vi khuẩn Azospirillum có màu trắng đục, trắng trong, vàng nhạt; hình dạng trịn, bìa ngun, độ cao (hay lài); trịn, bìa ngun, nhầy, độ cao (hay lài); tế bào dạng que ngắn Vi khuẩn Azospirillum dùng chủng cho lúa cao sản OM 6976 OM 4218 trồng huyện Châu Phú, tỉnh An Giang nhằm xác định hiệu dòng vi khuẩn phân lập Kết có 04 dịng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp T7, Azospirillum sp 7R, Azospirillum sp 25HR định danh tổng số 60 dòng vi khuẩn Azospirillum phân lập Khi chủng riêng lẻ 04 dòng vi khuẩn Azospirillum sp cho lúa cao sản OM 6976 OM 4218 trồng nhà lưới huyện Châu Phú, tỉnh An Giang, dòng vi khuẩn giúp lúa gia tăng chiều cao (24,5-34,6%, 20,0-21,7%), trọng lượng khô (36,1146,4%, 83,5-92,9%), số hạt (172,0-218,8%, 60,7-61,2%), so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp khơng bón đạm Hàm lượng đạm hạt lúa nghiệm thức có chủng vi khuẩn Azospirillum sp cao 2,5-3,9% so với nghiệm thức đối chứng Ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn Azospirillum sp trọng lượng 1.000 hạt cao (5,7-6,7%, 21,1-23,2%) so với nghiệm thức đối chứng Ứng dụng 02 dòng Azospirillum sp 6T1 Azospirillum sp 25HR chủng cho lúa cao sản (OM 6976 OM 4218) trồng đất phù sa điều kiện đồng ruộng huyện Châu Phú, tỉnh An Giang để xác định hiệu cố định đạm hai dòng vi khuẩn lên phát triển suất lúa Kết thí nghiệm cho thấy, chủng kết hợp lúc 02 dòng vi khuẩn giúp lúa gia tăng chiều cao (6,6-7,9%, 17,7-20,9%), chiều dài (1,3-4,4%, 4,9-13,6%) số hạt (15,2-61,2%, 10,2-23,5%), trọng lượng 1.000 hạt (1,5-5,6%, 8,18,5%), trọng lượng khô thân (2,8-56,9%, 28,6-57,1%) cao so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp khơng bón đạm Hàm lượng đạm hạt lúa nghiệm thức có chủng 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp cao so với nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Azospirillum sp (6,0-11,0%) Ở nghiệm thức chủng vi khuẩn Azospirillum sp suất lúa cao so với nghiệm thức đối thức đối chứng khơng chủng vi khuẩn khơng bón đạm (55,0-55,2%, 55,5-55,7%) Từ kết thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum sp giúp thay đạm (50-75 kgN/ha, 50KgN/ha) Từ khóa: Azospirillum, phân lập, vi khuẩn cố định đạm, lúa cao sản OM 6976, lúa cao sản OM 4218, lúa hoang iv ABSTRACT Sixty samples rice (forty-eight samples of high yield rice and twelve samples wild rice appeared in cultivated rice field) were collected to isolate nitrogenfixing bacterium Azospirillum Ecology of colonies and cells of bacterium Azospirillum are milky-white, white, yellowish; in a circular form, the cover material, high buoyancy (or interest); round, cover materials, mucous, high buoyancy (or interest); short rod-shaped cells These bacteria were applied to the high yield rice OM 6976 and OM 4218 grown in Chau Phu District, An Giang Province in order to estimate the efficiency of the isolated bacterial strains The results showed that 4/60 strains including Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp T7, Azospirillum sp 7R, and Azospirillum sp 25HR were identified When these four strains were applied separately to the high yield rice OM 6976 and OM 4218 grown in pots in a greenhouse in Chau Phu District, An Giang Province, they enabled the rice to increase their height (24.5-34.6%%, 20.0-21.7%), dry weight (36.1-146.4%, 83.5-92.9%), the number of full grains on blossoms (172.0-218.8%, 60.7-61.2%), in comparision to Azospirillum sp free treatments The nitrogen content of rice grains in inoculated Azospirillum sp treatments was higher 2.5-3.9% than those of Azospirillum sp free ones 1000-seed weight of inoculated Azospirillum sp treatments was higher (5.7-6.7%, 21.1-23.2%) than those of nitrogen and Azospirillum sp free ones Azospirillum sp 6T1 and Azospirillum sp 25HR were applied to the high crop yield rice (OM 6976 and OM 4218) grown in alluvial soil in Chau Phu District, An Giang Province to determine their effectiveness on the growth and yield of rice The results showed that these two bacterial strains Azospirillum sp enabled the inoculated rice increased their height (6.6-7.9%, 17.7-20.9%), length of blossoms (1.3-4.4%, 4.9-13.6%), the number of full grains on blossoms (15.261.2%, 10.2-23.5%), 1,000 grain weight (1.5-5.6%, 8.1-8.5%), dry weight of plant (2.8-56.9%, 28.6-57.1%) compared to those of Azospirillum sp free treatments The nitrogen content of rice grains in Azospirillum sp treatments was higher 6.0-11.0% than those of Azospirillum sp free ones Yield of rice inoculated with Azospirillum sp treatments was higher than those nitrogen and Azospirillum sp free ones (55.0-55.2%, 55.5-55.7%) The experimental results showed that the combination of two nitrogen-fixing bacterial strains Azospirillum sp helped replace nitrogen (50-75 KgN/ha, 50KgN/ha) Key words: Azospirillum, isolate, nitrogen-fixing bacterium, high yield rice OM 6976, high yield rice OM 4218, wild rice v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A: Azospirillum ADN: Acid Deoxyribo Nucleic Azo: Azospirillum AzoCR: Vi khuẩn Azospirillum rễ lúa cao sản AzoCT: Vi khuẩn Azospirillum thân lúa cao sản AzoHR: Vi khuẩn Azospirillum rễ lúa hoang AzoR: Vi khuẩn Azospirillum rễ lúa AzoT: Vi khuẩn Azospirillum thân lúa Biofertilizer: Phân sinh học CFU: Colony-Forming Unit CPS: Capsular polysaccharide CV: Coefficient of Variation EM: Effective Microorganisms EPS: Exo-polysaccharide FAO: Food and Agriculture Organization GDP: Gross Domestic Product IAA: Indole-3-Acetic Acid LSD: Least Significant Difference MA: Mẫu Anh NFb: Nitrogen Free brothymol NPK: Nitrogen - Phosphorus - Kali PCR: Polymerase Chain Reaction PE: Polyethylene PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria PP: Polypropylene ppm: parts per million PSM: Phosphate Solubilizing Microorganisms UV: Ultraviolet YMA: Yeast Mannitol Agar vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Diện tích, suất sản lượng lúa giới qua năm 11 Bảng 2.2: Diện tích sản lượng lúa nước qua năm 12 Bảng 2.3: Đặc tính số giống lúa cao sản trồng tỉnh An Giang 12 Bảng 2.4: Diện tích trồng lúa huyện, thị, thành phố tỉnh An Giang 13 Bảng 2.5: Cơ cấu giống lúa trồng vụ Hè Thu Đông Xuân An Giang 13 Bảng 2.6: Các loài Azospirillum phân lập, định danh theo thời gian 21 Bảng 2.7: Sự diện Azospirillum trồng, đất hợp chất hữu 22 Bảng 2.8: Mơi trường, đặc tính hình thái điều kiện sinh trưởng Azospirillum 23 Bảng 2.9: EPS (Exo-polysaccharide) tổng hợp A lipoferum A brasilense trình tăng trưởng 24 Bảng 2.10: CPS (Capsular polysaccharide) tổng hợp A lipoferum A brasilense tỷ lệ C/N sinh khối tế bào tăng trưởng 24 Bảng 2.11: Tỷ lệ hấp thu oxy A lipoferum A brasilense phát triển nồi lên men lít q trình đồng hóa fructose suy thoái EPS 24 Bảng 2.12: Hoạt động khử acetylene A lipoferum A brasilense nuôi cấy nồi lên men lít q trình đồng hóa fructose suy thoái EPS 24 Bảng 2.13: Ảnh hưởng loại acid amin lên tăng trưởng cố định đạm Azospirillum spp 27 Bảng 2.14: Ảnh hưởng acid amin lên tăng trưởng giải phóng ammoniac Azospirillum spp 28 Bảng 2.15: Ảnh hưởng acid amin lên tăng trưởng cố định đạm Azospirillum sppa 29 Bảng 2.16: Hàm lượng IAA vi khuẩn Azospirillum sp tổng hợp 33 Bảng 2.17: Những gen cố định đạm Azospirillum xác định 40 vii Bảng 2.18: Thành phần dung dịch dùng cho phản ứng PCR 48 Bảng 4.1: Nguồn gốc mẫu lúa hoang lúa cao sản thu hoạch.64 Bảng 4.1: Nguồn gốc mẫu lúa hoang lúa cao sản thu hoạch (tt)… 65 Bảng 4.2: Nguồn gốc dòng vi khuẩn Azospirillum phân lập từ lúa 66 Bảng 4.2 Nguồn gốc dòng vi khuẩn Azospirillum phân lập từ lúa (tt).67 Bảng 4.3: Đặc điểm, màu sắc môi trường thời gian tăng trưởng Azospirillum 69 Bảng 4.3: Đặc điểm, màu sắc môi trường thời gian tăng trưởng Azospirillum (tt) 70 Bảng 4.4: Đặc tính khuẩn lạc dòng vi khuẩn Azospirillum 71 Bảng 4.4 Đặc tính khuẩn lạc dịng vi khuẩn Azospirillum (tt) 71 Bảng 4.5: Đặc tính tế bào dòng vi khuẩn Azospirillum 74 Bảng 4.5: Đặc tính tế bào dịng vi khuẩn Azospirillum (tt) .75 Bảng 4.6 Màu diệp lục tố lúa theo thời gian tăng trưởng lúa 78 Bảng 4.7 Chiều cao lúa tuần sau trồng phịng thí nghiệm 79 Bảng 4.8 Chiều dài rễ lúa lúc tuần sau trồng phịng thí nghiệm 80 Bảng 4.9 Hàm lượng đạm lúa trồng phịng thí nghiệm (%) 80 Bảng 4.10: Chiều cao lúa lúc 30 ngày sau trồng lúc thu hoạch 81 Bảng 4.11: Trọng lượng khô thân trọng lượng 1.000 hạt lúc thu hoạch lúa 82 Bảng 4.12: Số hạt hàm lượng đạm hạt lúa lúc thu hoạch 83 Bảng 4.13: Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum chủng cho lúa 85 Bảng 4.14: Màu trọng lượng khô thân .85 Bảng 4.15: Chiều cao lúc 30 ngày sau trồng lúc thu hoạch 88 Bảng 4.16: Số hạt/trên lúa trọng lượng 1.000 hạt lúc thu hoạch lúa 89 Bảng 4.17: Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum chủng cho lúa 89 Bảng 4.18: Màu chiều cao lúa lúc 45 ngày sau trồng đồng 90 Bảng 4.19: Chiều cao cây, chiều dài số hạt lúc thu hoạch lúa 92 viii cho lúa cao sản OM 6976 giúp gia tăng suất từ 55,0-55,2% giúp thay lượng N tương đương 50-75kgN/ha (Bảng 4.21) A C B D E Chú thích: A-Đối chứng (khơng chủng Azospirillum khơng bón N); B-Khơng chủng Azospirillum bón 100N (theo cách nông dân thường sử dụng); C-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR không bón N; D-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N; E-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 25N Hình 4.14: Đặc điểm sinh trưởng lúa cao sản OM 6976 có chủng Azospirillum (B, C, D E) đối chứng (A) lúc chuẩn bị thu hoạch đồng ruộng 4.5.2 Độ hữu hiệu vi khuẩn Azospirillum lúa OM 4218 trồng ngồi đồng ruộng 4.5.2.1 Các tiêu nơng học lúa lúc 45 ngày sau sạ (NSKS) a) Màu lá: Ở chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N, bón 25N 50N cho màu lúa xanh tốt, khác biệt rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lúa đối chứng có lúa màu xanh vàng biểu thiếu hụt đạm Màu có chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum bón 50N 25N khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với màu nghiệm thức bón 100N Như vậy, chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum bón 50N 25N nhận thấy 02 dịng Azospirillum cố định lượng đạm tương đương từ 25-50 kgN/ha chủng cho lúa (Bảng 4.22, Hình 4.15 Hình 4.16) Kết tương tự Lin et al (2009); Lavrinenko et al (2010) Lin et al (2012) nghiên cứu trước Điều cho thấy vi khuẩn cố định đạm cho lúa giúp lúa có màu xanh tốt so với không chủng vi khuẩn Azospirillum b) Chiều cao cây: Lúa chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N, bón 50N 25N có chiều cao khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng thời gian 45 94 ngày sau sạ, Azospirillum chưa phát huy tác dụng lúa Lúa chủng 02 dịng Azospirillum bón 25N giúp tăng chiều cao 13,22% so với đối chứng Mặt khác, lúa khơng chủng Azospirillum bón 100N có chiều cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Điều cho thấy, đạm có vai trò quan trọng gia tăng chiều cao giai đoạn 45 ngày SKGS đồng ruộng (Bảng 4.22, Hình 4.15 Hình 4.16) Lin et al (2009); Lavrinenko et al (2010) Lin et al (2012) cho kết tương tự Chú thích: Mỗi lơ nghiệm thức có diện tích 50m2, lơ có bờ đê cao 40-50cm để ngăn cách không cho nước thơng thương qua lại đầu lơ có lỗ thông nước với kênh nông nghiệp chạy dọc theo ruộng lúa Hình 4.15: Các thí nghiệm trồng lúa ngồi đồng ruộng phân lô trước gieo sạ lúa cao sản OM 4218 A C B D E Chú thích: A-Đối chứng (khơng chủng Azospirillum khơng bón N); B-Khơng chủng Azospirillum bón 100N (theo cách nơng dân thường sử dụng); C-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N; D-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N; E-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 25N Hình 4.16: Đặc điểm sinh trưởng lúa cao sản OM 4218 có chủng Azospirillum (B, C, D E) đối chứng (A) lúc 45 ngày sau gieo sạ đồng ruộng 95 Bảng 4.22: Màu chiều cao lúa lúc 45 ngày sau trồng đồng TT Nghiệm thức Màu Chiều cao Đối chứng (không chủng Azospirillum không 2,0a 52,8a bón N) Khơng chủng Azospirillum, bón 100N (theo cách 4,0c 62,1b nông dân thường sử dụng) Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 3,8b 55,1a Azospirillum sp 25HR khơng bón N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 4,0c 53,6a Azospirillum sp 25HR bón 50N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 4,0c 53,9a Azospirillum sp 25HR bón 25N CV (%) 12,0 7,9 Chú thích: Các trị số cột màu thể mức độ thiếu thừa đạm bón cho lúa Các giá trị trung bìng cột theo sau có mẫu tự biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% 4.5.2.2 Các tiêu nông học lúc thu hoạch lúa a) Chiều cao cây: Những lúa chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N hay bón 50N 25N có chiều cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Những lúa không chủng Azospirillum bón 100N có chiều cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Mặt khác, chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum cho lúa khơng bón N hay bón 50N 25N nhận thấy chiều cao tương đương khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với không chủng Azospirillum bón 100N Như vậy, chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum giúp lúa gia tăng chiều cao từ 17,720,9% so với không chủng Azospirillum khơng bón N (Bảng 4.23 Hình 4.17) Kết tương tự tìm thấy Lin et al (2009, 2012); Lavrinenko et al (2010) b) Chiều dài bông: Nghiệm thức chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N hay bón 50N 25N có chiều dài bơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Khi lúa khơng chủng Azospirillum bón 100N có chiều dài bơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Bên cạnh đó, lúa chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum khơng bón N hay bón 50N 25N có chiều dài bơng tương đương khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lúa khơng chủng Azospirillum bón 100N Như vậy, lúa chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum giúp gia tăng chiều dài từ 4,9-13,6% so với khơng chủng Azospirillum khơng bón N (Bảng 4.23 Hình 4.16) Kết tương tự tìm thấy Lin et al (2009, 2012) Lavrinenko et al (2010) 96 Bảng 4.23: Chiều cao cây, chiều dài số hạt/bông lúc thu hoạch TT Nghiệm thức Chiều Chiều Số cao dài hạt/bông Đối chứng (khơng chủng Azospirillum 61,1a 16,2a 71,5a khơng bón N) Khơng chủng Azospirillum, bón 100N 78,5bc 19,2c 86,5bc (theo cách nông dân thường sử dụng) Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 73,9b 17,0ab 88,3bc Azospirillum sp 25HR khơng bón N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 71,9b 18,0bc 78,8b Azospirillum sp 25HR bón 50N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 73,7b 18,4bc 83,0b Azospirillum sp 25HR bón 25N CV (%) 5,4 8,3 18,1 Chú thích: Các giá trị trung bình cột theo sau có mẫu tự biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% c) Số hạt/bông: Lúa chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N hay bón 50N 25N có số hạt/bơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Lúa chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum giúp gia tăng số hạt/bơng 61,15% so với nghiệm thức đối chứng Mặt khác, lúa không chủng Azospirillum bón 100N có số hạt/bơng tương đương khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum khơng bón N hay bón 50N 25N Bên cạnh đó, chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum khơng bón N giúp gia tăng 10,2-23,5% số hạt/bơng so với đối chứng nghiệm thức bón N theo cách nông dân thường sử dụng (100N) Từ kết cho thấy, chủng 02 dòng Azospirillum cho lúa giúp cố định N làm gia tăng số hạt/bơng (Bảng 4.23 Hình 4.17) Lin et al (2009); Lavrinenko et al (2010) Lin et al (2012) có phát tương tự d) Trọng lượng khô (TLK) thân lá: Lúa chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N hay bón 25N 50N có TLK thân khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng Tương tự, nghiệm thức bón N theo cách nơng dân thường sử dụng (bón 100N) có TLK thân khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lúa khơng chủng Azospirillum khơng bón N Mặt khác, lúa chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum khơng bón N hay bón 25N 50N có TLK thân tương đương khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lúa khơng chủng Azospirillum bón 100N Bên cạnh đó, chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum bón 50N giúp gia tăng TLK thân từ 28,6-57,1% so với đối chứng (Bảng 4.24 Hình 4.17) Kết tương tự Bashan Levanony, (1990, 1997) nghiên cứu trước 97 e) Trọng lượng (TL) 1.000 hạt: Nghiệm thức chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N có TL 1.000 hạt cao (25,5g), chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum khơng bón N bón 50N có TL 1.000 hạt thấp (25,4g) Cây lúa chủng 02 dịng Azospirillum khơng bón N hay bón 50N 25N có TL 1.000 hạt khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lúa đối chứng Khi bón đạm đầy đủ (100N) TL 1.000 hạt cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lúa khơng bón N, khơng chủng Azospirillum chủng Azospirillum khơng bón N hay có bón đạm Khi chủng Azospirillum giúp TL 1.000 hạt tăng từ 8,1-8,5% so với đối chứng (Bảng 4.24 Hình 4.17) Bashan Levanony, (1990, 1997) Khammas, et al (1989) cho kết tương tự Bảng 4.24: Trọng lượng khô thân trọng lượng 1.000 hạt TT Nghiệm thức TLK thân Đối chứng (không chủng Azospirillum 5,6a khơng bón N) Khơng chủng Azospirillum, bón 100N 10,2c (theo cách nơng dân thường sử dụng) Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 7,2b Azospirillum sp 25HR khơng bón N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 7,2b Azospirillum sp 25HR bón 50N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, 8,8b Azospirillum sp 25HR bón 25N CV (%) 3,3 TL 1.000 hạt 23,5a 25,5b 25,4b 25,5b 25,4b 3,4 Chú thích: Các giá trị trung bình cột theo sau có mẫu tự biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% A B C D E Chú thích: A-Đối chứng (khơng chủng Azospirillum khơng bón N); B-Khơng chủng Azospirillum bón 100N (theo cách nông dân thường sử dụng); C-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N; D-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N; E-Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 25N Hình 4.17: Đặc điểm sinh trưởng lúa cao sản OM 4218 có chủng Azospirillum (B, C, D E) đối chứng (A) lúc chuẩn bị thu hoạch đồng ruộng 98 f) Năng suất lúa: Ở nghiệm thức có chủng kết hợp 02 dịng Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N 25N có suất khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lúa đối chứng Khi bón đủ N cho lúa (bón 100N) nhận thấy suất cao tương đương khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lúa chủng 02 dòng Azospirillum có bón N khơng bón N bổ sung Như vậy, chủng kết hợp 02 dòng Azospirillum cho lúa cao sản OM 4218 giúp gia tăng suất từ 55,5-55,7% so với đối chứng giúp thay 50kgN/ha (Bảng 4.25) Bảng 4.25: Năng suất lúa lúc thu hoạch đồng ruộng TT Nghiệm thức Đối chứng (không chủng Azospirillum khơng bón N) Khơng chủng Azospirillum, bón 100N (theo cách nông dân thường sử dụng) Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR khơng bón N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 50N Chủng kết hợp Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR bón 25N CV (%) Năng suất (tấn/ha) 4,11a 6,36b 6,39b 6,40b 6,40b 17,09 Chú thích: Các giá trị trung bình cột theo sau có mẫu tự biểu thị khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% Qua phân tích kết thí nghiệm phân lập định danh vi khuẩn Azospirillum, thí nghiệm trồng lúa cao sản phịng thí nghiệm, thí nghiệm trồng lúa cao sản OM 6976, OM 4218 nhà lưới, thí nghiệm trồng lúa cao sản OM 6976, OM 4218 trồng lúa đồng ruộng cho thấy vi khuẩn Azospirillum phân lập từ lúa cao sản vùng sinh thái khác tỉnh An Giang dùng kết hợp dòng vi khuẩn Azospirillum địa (Azospirillum sp 6T1 Azospirillum sp 25HR) để chủng lại cho lúa nhận thấy vi khuẩn Azospirillum cố định đạm sinh học cho lúa giúp lúa gia tăng suất so với phương pháp canh tác truyền thống không chủng vi khuẩn Azospirillum bón lượng phân đạm hóa học cao (100kgN/ha) nhằm hướng đến sản xuất nông nghiệp theo hướng hạn chế ô nhiễm môi trường sản xuất nông nghiệp bền vững 99 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 KẾT LUẬN - Vi khuẩn phân lập từ lúa cao sản lúa hoang Kết lập 60 dòng vi khuẩn Azospirillum - Các dịng vi khuẩn Azospirillum có đặc tính giống vi khuẩn Azospirillum tác giả trước mơ tả Các dịng vi khuẩn Azospirillum phân lập có đặc điểm: khuẩn lạc trịn, nhầy (hay nhầy), bìa ngun, độ lài, Gram âm, đường kính trung bình khuẩn lạc 1,11mm Tế bào vi khuẩn có hình que ngắn có khả chuyển động, chiều dài trung bình tế bào 1,06m, chiều rộng trung bình 0,65m - Vi khuẩn nhận diện định danh, kết có 04/60 dịng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1 Azospirillum sp T7 thuộc loài Azospirillum lipoferum Azospirillum sp 25HR Azospirillum sp 7R thuộc loài Azospirillum brasilene - Kết tuyển chọn trắc nghiệm độ hữu hiệu 04 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp T7, Azospirillum sp 7R Azospirillum sp 25HR lúa cao sản trồng điều kiện phòng thí nghiệm - Kết tuyển chọn trắc nghiệm độ hữu hiệu 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR 02 giống lúa cao sản OM 4218 OM 6976 trồng điều kiện nhà lưới - Đã trắc nghiệm độ hữu hiệu 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR chủng kết hợp lúa cao sản OM 6976 trồng đồng ruộng tỉnh An Giang - Đã trắc nghiệm độ hữu hiệu 02 dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1, Azospirillum sp 25HR chủng kết hợp lúa cao sản OM 4218 trồng đồng ruộng tỉnh An Giang 5.2 ĐỀ XUẤT - Định danh dòng Azospirillum phân lập cặp mồi chuyên biệt họ vi khuẩn Azospirillum để xác định xem chúng thuộc loài để làm sở sản xuất phân vi sinh bón cho lúa - Trắc nghiệm độ hữu hiệu 02 dòng Azospirillum sp 6T1 Azospirillum sp 25HR giống lúa khác để khẳng định khả cố định đạm giúp tăng suất 100 - Ứng dụng dòng vi khuẩn Azospirillum sp 6T1 Azospirillum sp 25HR trồng không thuộc họ đậu như: bắp, lúa mì,… để khẳng định khả cố định đạm 02 dòng vi khuẩn giúp tăng suất vụ mùa canh tác 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 2006 Giống thời vụ sản xuất lúa Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 85 trang Bùi Huy Đáp, 1999 Một số vấn đề lúa Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, Việt Nam 60 trang Bùi Việt Sang, 2008 Phân lập xác định khả tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) số dòng vi khuẩn Pseudomonas sp Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam Đào Thanh Hoàng, 2005 Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn Azospirillum Luận văn Thạc sĩ Sinh học chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam Đỗ Kim Nhung Vũ Thành Công, 2011 Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA cố định đạm vi khuẩn Gluconacetobacter sp Azospirillum sp phân lập từ mía Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 18a: 161-167 Dương Thị Kim Loan, 2009 Khả cố định đạm tự đất phù sa đất phèn trồng lúa Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Tp Hồ Chí Minh Việt Nam 230 trang Nguyễn Hữu Hiệp Cao Ngọc Điệp, 2002 Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam 70 trang Nguyễn Hữu Hiệp, Phạm Thị Khánh Vân, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005 Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn Azospirillum kỹ thuật PCR Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 4: 119-126 Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005 Azospirillum: vi sinh vật cố định đạm với khơng thuộc họ Đậu Tạp chí Khoa học Cần Thơ, 2(12): 4-6 Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005, Phân lập số dòng Azospirillum lúa Luận văn Cử nhân khoa học chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam Nguyễn Phước Tương, 1989 Sự cố định đạm cộng sinh họ Đậu ứng dụng thực tiễn Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp 320: 120-124 Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 140 trang Niên giám Thống kê, 2012 Nhà xuất Thống Kê, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Phạm Hồng Hộ, 2000 Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 650 trang Tiếng Anh Albreicht, S L., and Y Okon, 1980 Cultures of Azospirillum Methods Enzymol., 69: 740-749 Arsène F., P A Kaminski, and C Elmerich, 1996 Modulation of NifA activity by PII in Azospirillum brasilense: evidence for a regulatory role of the NifA N-terminal domain J Bacteriol., 178: 4830-483 Baldani, J I., L Caruso, V L D Baldani, S R GoiS, and J Döbereiner, 1997 Recent advances in BNF with non-legume plants Soil Biol Biochem., 29: 911-922 Baldani, V L D., J I Baldani and J Döbereiner, 1987 Inoculation of field-grown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum spp in Brazil Biol Fert Soils, 4: 37-40 102 Bally, R., D Thomas-Bauzon, T Heulin, and J Balandreau, 1983 Determination of the most frequent N2-fixing bacteria in a rice rhizosphere Can J Microbiol., 29: 881887 Bar, T., and Y Okon, 1993 Tryptophan conversion to indole-3-acetic acid via indole-3acetamide in Azospirillum brasilense Sp Can J Microbial., 39: 81-86 Barbieri, P., T Zanelli, E Galli, and G Zanetti, 1986 Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production FEMS Microbiol Lett., 36: 87-90 Bashan, 2004 Azospirillum Plant relationships: Physiological, molecular, agriculture, and environmental advances 1997-2003 Can J Microbiol., 50: 521-577 Bashan, Y., and G Holguin, 1997 Azospirillum-plant relationships: Environmental and physiological advances (1990-1996) Can J Microbiol., 43: 103-121 Bashan, Y., and G Holguin, 1997a Azospirillum-plant relationships: Environmental and physiological advances (1990-1996) Can J Microbiol., 43: 103-121 Bashan, Y., and G Holguin, 1997b Azospirillum-plant relationships: Environmental and physiological advances (1990-1996) Can J Microbiol., 43: 103-121 Bashan, Y., and H Levanony, 1985 An improved selection technique and medium for the isolation and enumeration of Azospirillum brasilense Can J Microbiol., 31: 947-952 Bashan, Y., and H Levanony, 1990 Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture Can J Microbiol., 36: 591-608 Bashan, Y., G Holguin and L E de-Bashan, 2004 Azospirillum-plant relationships: Physiological, molecular, agricultural and environmental advances (1997-2003) Can J Microbiol., 50: 521-577 Ben Dekhil, S B., M Cahill, E Stackebrandt and L I Sly, 1997 Transfer of Conglomeromonas largomobilis subsp largomobilis to the genus Azospirillum as Azospirillum largomobile comb nov., and elevation of Conglomeromonas largomobiliz subsp parooensis to the new type species of Conglomeromonas, Conglomeromonas parooensis sp nov Syst Appl Microbiol., 20: 72-77 Bohlool, B B., J K Ladha, D P Garrity and T George, 1992 Biological nitrogen fixation for sustainable agriculture: A perspective Plant and Soil, 141: 1-11 Caballero-Mellado, J., M Carcano-Montiel and M A Mascarua-Esparza, 1992 Field inoculation of wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum brasilense under temperate climate Symbiosis., 13: 243-253 Chattopadhyay, S., A Mukherjee, and S Ghosts, 1993 Azospirillum brasilense locus coding for phosphoenolpyruvate: fructose phosphotransferase system and global regulation of carbohydrate metabolism J Bacteriol., 175: 3240-3243 Chen, Y P., G Lopez-de-Victoria, and C R Lovell, 1993 Utilization of aromatic compounds as carbon and energy sources during growth and N2-fixation by free living nitrogen fixing bacteria Arch Microbiol., 159: 207-212 Costacurta, A., V Keijers, and J Vanderleyden, 1994 Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene Mol Gen Genet., 243: 463-472 Curl, E A., and B Truelove, 1986 The rhizosphere Springer-Verlag, Berlin 140 pp De Troch, P., and J Vanderleyden, 1996 Surface properties and motility of Rhizobium and Azospirillum in relation to plant root attachment Microb Ecol., 32: 149-169 Dean, D R., and M R Jacobson, 1992 Biochemical genetics of nitrogenase In G Stacey, R H Burris, and H J Evans (Eds.), Biological nitrogen fixation (pp 763-834) New York, NY: Chapman and Hall 840 pp Diekmann, K H., J C G Ottow and S K De Datta, 1996 Yield and nitrogen response of lowland rice (Oryza sativa L.) to Sesbania rostrata and Aeschynomene afraspera green manure in different marginally productive soils in the Philippines Biol Fert Soils, 21: 103-108 Döbereiner, J., 1988 Isolation and identification of root associated diazotrophs Plant Soil, 110: 207-212 103 Döbereiner, J., and J M Day, 1976 Associative symbioses in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites In: Newton W E., Nyman C J (eds) Proceedings of the 1st International Symposium on Nitrogen Fixation Pullman, Wash June 3-7, 1974 Washington State University Press, Pullman, 550 pp Döbereiner, J., and Pedrosa F P., 1987 Nitrogen-fixing Bacteria in Non-leguminous Crop Plants, Springer-Verlag, Berlin 320 pp Döbereiner, J., V L D Baldani and V M Reis, 1995 Endophytic occurrence of diazotrophic bacteria in non-leguminous crops, In: Azospirillum VI and relate microorganisms, Fendrik I; M del Gallo J Vanderleyden and M de Zamarocy (eds.), pp 3-14 Springer Verlag, Berlin, Germany 230 pp Dosselaere, F V., A Brock, M Lambrecht, P De Troch, E Prinson, Y Okon, V Keijers, and J Vanderleyden, 1997 Indole-3-acetic acid biosynthesis in Azospirillum brasilense In: Ogoshi A., Kobayashi K., Homma Y., Kodama F., Kondo N., Akino S (eds) Plant growth-promoting rhizobacteria: present status and future prospects”, OECD, Paris, 350 pp Eckert, B., O B Weber, G Kirchhof, A Haibritter, M Stoffels and A Hartmann, 2001 Azospirillum doebereinerae sp nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus Int J Syst Evol Microbiol., 51: 17-26 Eckert, B., O B Weber, G Kirchhof, A Haibritter, M Stoffels, and A Hartmann, 2001 Azospirillum doebereinerae sp nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus Int J Syst Evol Microbiol., 51: 17-26 Elmerich, C., M de Zamaroczy, F Arsène, L Pereg, A Paquelin, and A Kaminski, 1997 Regulation of nif gene expression and nitrogen metabolism in Azospirillum Soil Biol Biochem., 29: 847-852 Elmerich, C., W Zimmer, and C Vieille, 1992 Associative nitrogen fixing bacteria In: G Stacey, R.H Burris, and H J Evans (Eds.), Biological nitrogen fixation, New York, NY: Chapman and Hall 260 pp Fani, R., G Allotta, M Bazzicalupo, F Ricci, C Schipani, and M Polsinelli, 1989 Nucleotide sequence of the gene encoding the nitrogenase iron protein (nifH) of Azospirillum brasilense and identification of a region controlling nifH transcription”, Mot Gen Genet., 220: 81-87 Frazzon, J., and I S Schrank, 1998 Sequencing and complementation analysis of the nifUSV genes from Azospirillum brasilense FEMS Microbiol Lett., 159: 151-158 Fu, H A., W P Fitzmaurice, G P Roberts, and R H Burris, 1990 Cloning and expression of draTG genes from Azospirillum lipoferum Gene, 86: 95-98 Fu, H., A Hartmann, R G Lowery, W P Fitzmaurice, G P Roberts, and R H Burris, 1989 Posttranslational regulatory system for nitrogenase activity in Azospirillum spp J Bacteriol., 171: 4679-4685 Galimand, M., B Perroud, F Delorme, A Paquelin, C Vieille, H Bozouklian, and C Elmerich, 1989 Identification of DNA regions homologous to nitrogen fixation genes nifE, nifUS and fix-ABC in Azospirillum brasilense Sp7 J Gen Microbiol., 135: 1047-1059 Gallori, E., and M Bazzicalupo, 1985 Effect of nitrogen compounds on nitrogenase activity in Azospirillum brasilense FEMS Microbiol Lett., 28: 35-38 Glick, B R., 1995 The enhancement of plant growth by free-living bacteria Can J Microbiol., 41: 109-117 Hall, P G., and N R Krieg, 1983 Swarming of Azospirillum brasilense on soil media Can J Microbiol., 29: 1592-1594 Harris, G H., O B Hesterman, E A Paul, S E Peters and R R Janke, 1994 Fate of legume and fertilizer nitrogen-15 in a long-term cropping systems experiment Agron J., 86: 910-915 Hartmann, A, H A Fu, and R H Burris, 1987 Regulation of nitrogenase activity by ammonium chloride in Azospirillum spp J Bacteriol., 165: 864-870 Hartmann, A., and R H Burris, 1986 Regulation of nitrogenase activity by oxygen in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum J Bacteriol., 169: 944-948 104 Hartmann, A., and W Zimmer, 1994 Physiology of Azospirillum In: Azospirillum/Plant Associations (Okon, Y., Ed.) CRC Press, Boca Raton, FL 124 pp Hartmann, A., H Fu, and R H Burris, 1988 Influence of amino acids on nitrogen fixation ability and growth of Azospirillum spp Appl Envi Microbiol., 54(1): 87-93 Hartmann, A., M Singh, and W Klingmüller, 1983 Isolation and characterization of Azospirillum mutants excreting high amounts of indoleacetic acid Can J Microbiol., 29: 916-923 Holguin, G., C L Patten, and B R Glick, 1999 Genetic and molecular biology of Azospirillum Biol Fertil Soils, 29: 10-23 Howarth, R W., and R Marino, 1988 Nitrogen fixation in freshwater, estuarine, and marine ecosystems Biogeochemical controls Limnol Oceanogr, 33: 688-701 Inoue, A., T Shigematsu, M Hidaka, H Masaki, and T Uozumi, 1996 Cloning, sequencing and transcriptional regulation of the draT and draG genes of Azospirillum lipoferum FS Gene, 170: 101-106 Jain, D K., and D G Patriquin, 1985 Characterization of a substance produced by Azospirillum which causes branching of wheat root hairs Can J Microbiol., 31: 206-210 Khammas, K M., E Ageron, P A D Grimont, and P Kaiser, 1989 Azospirillum irakense sp nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil Res Microbiol., 140: 679-693 Kolb, W., and P Martin, 1985 Response of plant roots to inoculation with Azospirillum brasilense and to application of indole-3-acetic acid In: Klingmüller W (ed) Azospirillum III: genetics, physiology, ecology Springer, Berlin Heidelberg, New York 365 pp Krieg, N R and J Döbereiner, 1984 Genus Azospirillum in Bergey’s manual of Systematic Bacteriology 1, N R Krieg and J G Holt Eds., Williams and Wilkins, Baltimore 690 pp Kumarasinghe, K S., F Zapata, G Kovacs, D L Eskew and S K A Danso, 1986 Evaluation of the availability of Azolla N and urea N to rice using 15N Plant and Soil, 90: 293-299 Ladha, J K., R Pareek and M Becker, 1992 Stem-nodulating legume-Rhizobium symbiosis and agronomic use in lowland rice Adv Soil Sci., 20: 147-192 Lavrinenko K., E Chernousova, E Gridneva, G Dubinina, V Akimov, J Kuever, A Lysenko, and M Grabovich, 2010 Azospirillum thiophilum sp nov., a diazotrophic bacterium isolated from a sulfide spring Int J Syst Evol Microbiol., 60: 2832-2837 Liang, Y Y., F Arsène, and C Elmerich, 1993 Characterization of the ntrBC genes of Azospirillum brasilense Sp7: their involvement in the regulation of nitrogenase synthesis and activity Mol Gen Genet., 240: 188-196 Lin, S Y., C C Young, H Hupfer, C Siering, A B Arun, W M Chen, W A Lai, F T Shen, P D Rekha, and A F Yassin, 2009 Azospirillum picis sp nov., isolated from discarded tar Int J Syst Evol Microbiol., 59: 761-765 Lin, S Y., F T Shen, L S Young, Z L Zhu, W M Chen, and C C Young, 2012 Azospirillum formosense sp nov., a diazotroph from agricultural soil Int J Syst Evol Microbiol., 62: 1185-1190 Lin, S Y., Liu, Y C., Hameed, A., Hsu, Y H., Lai, W.A., Shen, F T and Young, C C 2013 Azospirillum fermentarium sp nov., a nitrogen-fixing species isolated from a fermenter Int J Syst Evol Microbiol., 63: 3762-3768 Lopez-de-Victoria, G., and C R Lowell, 1993 Chemotaxis of Azospirillum species to aromatic compounds Appl Environ Microbiol., 59(9): 2951-2955 Ludden, P W., 1994 Reversible ADP-ribosylation as a mechanism of enzyme regulation in prokaryotes Mol Cell Biochem., 138: 123-129 Ma, L., and J Li, 1997 Cloning and sequencing of draTG genes and their downstream region of Azospirillum brasilense Y62 Chinese J Biotechnol., 13: 143-152 105 Machado, H B., M G Yates, S Funayama, L U Rigo, M B R Steffens, E M Souza, and F O Pedrosa, 1995 The ntrBC genes of Azospirillum brasilense are part of a nifR3like-ntrB-ntrC operon and are negatively regulated Can J Microbiol., 41: 674-684 Magalhães, F M., J I Baldani, S M Souto, J R Kuykendall, and J Döbereiner, 1983 A new acid-tolerant Azospirillum species An Acad Brasil Cience., 55: 417-430 Mandal, A K., and S Ghosh, 1993 Isolation of a glutamate synthase (GOGAT)-negative, pleiotropically N utilization-defective mutant of Azospirillum brasilense: cloning and partial characterization of GOGAT structural gene J Bacteriol., 175: 8024-8029 Martin-Didonet C C G., L S Chubatsu, E M Souza, M Kleina, F G M Rego, L U Rego, M Geoffrey Yates, and F O Pedrosa, 2000 Genome structure of the genus Azospirillum J Bacteriol., 182(14): 4113-4116 Mehnaz S., B Weselowski and G Lazarovits, 2007 Azospirillum canadense sp nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere Int J Syst Evol Microbiol., 57: 620-624 Michiels K., J Vanderleyden J, and C Elmerich, 1994 Genetics and molecular biology of Azospirillum In: Okon Y (ed) Azospirillum/plant associations, CRC Press, Boca Raton, Fla 250 pp Milcamps, A., V Keyers, and J Vanderleyden, 1993 Identification of a nifW-like gene in Azospirillum brasilense Biochim Biophys Acta., 1173: 237-238 Moat, A.G., and J W Foster, 1988 Microbial physiology, Wiley, New York, 597 pp O'Gara, F., and K T Shanmugam, 1976 Regulation of nitrogen fixation by Rhizobia Export of fixed N2 as NH4 Biochim Biophys Acta., 437: 313-321 Okon, Y and C A Labandera-Gonzalez, 1994 Agronomic apllications of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field inoculation Soil Biol Biochem., 26(12): 15911601 Okon, Y., 1985 Azospirillum as a potential inoculant for agriculture Trends in Biotechnology, 3: 223-228 Okon, Y., L Cakmakei, I Nur, and I Chet, 1980 Aerotaxis and chemotaxis of Azospirillum brasilense Microb Ecol., 6: 277-280 Okon, Y., S L Albrecht, and R H Burris, 1976 Factors affecting growth and nitrogen fixation of Spirillum lipoferum J Bacteriol., 127: 1248-1254 Okon, Y., Y Kapulnik and S Sarig, 1988 Field inoculation Studies with Azospirillum in Israel In: Biological Nitrogen Fixation Recent Developments (N S Subba Rao, Ed.), Oxford and I B H Publishing Co., New Delhi 290 pp Pelanda, R., M A Vanoni, M Perego, L Puibelli, A Galizzi, and B Curti, 1993 Glutamate synthase genes of the diazotroph Azospirillum brasilense J Biol Chem., 268: 3099-3106 Postgate, J R., and R R Eady, 1988 The evolution of biological nitrogen fixation In: Nitrogen Fixation: Hundred Years After Bothe, H., de Bruijn, F.J, and Newton, W.E (eds) Stuttgart: Gustav Fischer 140 pp Potrich, D P., L M P Passaglia, and I S Schrank, 2001b Partial characterization of nif genes from the bacterium Azospirillum amazonense Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 34: 1105-1113 Prinsen, E., A Costacurta, K Michiels, J Vanderleyden, and V.11 Onckelen, 1993 Azospirillum brasilense indole-3-acetic acid biosynthesis: evidence for a non-tryptophan dependent pathway Mol Plant Microbe Interact., 6: 609 -615 Quiviger, B., C Franche, G Lutfalla, D Rice, R Haselkorn, and C Elmerich, 1982 Cloning of a nitrogen fixation (nif) gene cluster of Azospirillum brasilense Biochimie., 64: 495-502 Redfield, A C., 1958 The biological control of chemical factors in the environment Am Scientist., 46: 205-222 Reinhold, B., T Hurek, and I Fendrik, 1985 Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp J Bacteriol., 162: 190-195 Reinhold, B., T Hurek, I Fendrik, B Pot, M Gillis, K Kersters, S Thielemans, and J De Ley, 1987 Azospirillum halopraeferens sp nov., a nitrogen-fixing organism 106 associated with roots of Kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) Int J Syst Bacteriol., 37: 43-51 Rodriguez-Caceres, E A., 1982 Improved medium for isolation of Azospirillum spp Appl Envi Microbiol., 44(4): 990-991 Roger, P A and J K Ladha, 1992 Biological N2 fixation in wetland rice fields: Estimation and contribution to nitrogen balance Plant and Soil, 141: 41-55 Shenoy, V V., G M Kalagudi and B V Gurudatta, 2001 Towards nitrogen autotrophic rice Curr Sci., 81(5): 451-457 Skerman, V B D., L I Sly, and M L Williamson, 1983 Conglomeromonas largomobilis gen nov., sp nov., a sodium-sensitive, mixed-flagellated organism from fresh waters Int J Syst Bacteriol., 33: 300-308 Sly, L I., and E Stackebrandt, 1999 Description of Skerrnanella parooensis gen nov., sp nov to accommodate Conglomeromonas largomobilis subsp Largomobilis to the genus Azospirillum Int J Syst Bacteriol., 49: 541-544 Stoltzfus, J R., R So, P P Malarvithi, J K Ladha and F J de Bruijn, 1997 Isolation of endophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice with biologically fixed nitrogen Plant and Soil, 194: 25-36 Tarrand, J J., N R Krieg, and J Döbereiner, 1978 A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen nov and two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb nov and Azospirillum brasilense sp nov Can J Microbiol., 24: 967- 980 Tubb, R S., 1976 Regulation of nitrogen fixation in Rhizobium sp Appl Environ Microbiol., 32: 483-488 Turner, G L., and A H Gibson, 1980 Measurement of nitrogen fixation by indirect means In: Bergersen F J (ed) Methods for evaluating biological nitrogen fixation, Wiley, New York, 150 pp Ueda, T., Y Suga, N Yahiro and T Matsuguchi, 1995 Remarkable N2-fixing bacteria diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequences J Bacteriol., 177(5): 1414-1417 Vande Brock, A., V Keijers, and J Vanderleyden, 1996 Effect of oxygen on the free-living nitrogen fixation activity and expression of the Azospirillum brasilense nifH gene in various plant-associated diazotrophs Symbiosis, 21: 25-40 Vander Brock, A., and J Vanderleyden, 1995 Review: genetics of the Azospirillum-plant association Crit Rev Plant Sci., 5: 445-466 Westby, C A., D S Cutshall, and G V Vigil, 1983 Metabolism of various carbon sources by Azospirillum brasilense J Bacteriol., 156(3): 1369-1372 Whitehead, D C., H Dibb, and R D Hartley, 1981 Extractant pH and the release of phenolic compounds from soils, plant root and leaf litter Soil Biol Biochem., 13: 343-348 Whitehead, D C., H Dibb, and R D Hartley, 1982 Phenolic compounds in soil as influenced by the growth of different plant species J Appl Ecol., 19: 579-588 Young, C C., H Hupfer, C Siering, M J Ho, A B Arun, W A Lai, P D Rekha, F T Shen, M H Hung, W M Chen, and A F Yassin, 2008 Azospirillum rugosum sp nov., isolated from oil-contaminated soil Int J Syst Evol Microbiol., 58: pp 959-963 Young, J P W., 1992 Phylogenetic classification of nitrogen-fixing organisms In G Stacey, R H Burris, and H J Evans (Eds.), Biological nitrogen fixation New York, NY: Chapman and Hall 135 pp Young, J P W., 1993 Molecular phylogeny of rhizobia and their relatives, In: R Palacios, J Mora, and W E Newton (ed.), New horizons in nitrogen fixation Kluwer Academic Publications, London, United Kingdom 592 pp Zehr, J P., and L A McReynolds, 1989 Use of degenerate oligonucleotides for amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodesmium thiebautii Appl Environ Microbiol., 55: 2522-2526 107 Zhang, Y., R H Burris, and G P Roberts, 1992 Cloning, sequencing, mutagenesis, and functional characterization of draT and draG genes from Azospirillum brasilense”, J Bacteriol., 174: 3364-3369 Zhang, Y., R H Burris, P W Ludden, and G P Roberts, 1993 Posttranslational regulation of nitrogenase activity by anaerobiosis and ammonium in Azospirillum brasilense J Bacteriol., 175: 6781-6788 Zhang, Y., R H Burris, P W Ludden, and G P Roberts, 1994 Posttranslational regulation of nitrogenase activity in Azospirillum brasilense ntrBC mutants: ammonium and anaerobic switch-off occurs through independent signal transduction pathways J Bacteriol., 176: 5780-5787 Zhang, Y., R H Burris, P W Ludden, and G P Roberts, 1996 Presence of a second mechanism for the post-tranlational regulation of nitrogenase activity in Azospirillum brasilense in response to ammonium J Bacteriol., 178: 2948-2953 Zhang, Y., R H Burris, P W Ludden, and G P Roberts, 1997 Regulation of nitrogen fixation in Azospirillum brasilense FEMS Microbiol Lett., 152: 195-204 Zhou, S., Han, L., Wang, Y., Yang, G., Zhuang, L and Hu, P., 2013 Azospirillum humicireducens sp nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from a microbial fuel cell Int.J Syst Evol Microbiol., 63: 2618-2624 Zimmer, W., C Aparicio, and C Elmerich, 1991 Relationship between tryptophan biosynthesis and indole-3-acetic acid production in Azospirillum: identification and sequencing of a trpGDC cluster Gen Genet, 229: pp 41-51 Zimmer, W., K Kloos, B Hundeshagen, E Niederau, and H Bothe, 1995 Auxin biosynthesis and denitrification in plant growth promoting bacteria In: Fendrik I., Del Gallo M., Vanderleyden J., de Zamaroczy M (eds) Azospirillum VI and related microorganisms, genetics-physiology-ecology”, NATO ASI series, series G: ecological sciences, vol G37 Springer, Berlin Heidelberg, New York 228 pp Trang web http://clrri.org/ (Ngày 06/8/2013) http://images.google.com/images?q=Azospirillum+halopraeferens (Ngày 06/8/2013) http://vi.wikipedia.org (Ngày 15/8/2013) http://www.angiang.gov.vn (Ngày 15/8/2013) http://www.bacterio.cict.fr/a/azospirillum.html (Ngày 21/8/2013) http://www.fao.org (Ngày 21/8/2013) http://www.google.com.vn/imgres?q=femo+molybdenum+nitrogenase (Ngày 30/8/2013) http://www.gso.gov.vn (Ngày 30/8/2013) http://www.gso.gov.vn (Ngày 02/9/2013) http://www.irri.org (Ngày 02/9/2013) http://www.omonrice.org (Ngày 02/9/2013) 108 ... án: Phân lập, tuyển chọn khảo nghiệm dòng vi khuẩn Azospirillum sinh trưởng suất lúa cao sản trồng tỉnh An Giang Mục tiêu cụ thể luận án: - Phân lập dòng vi khuẩn Azospirillum từ lúa hoang lúa cao. .. tất mẫu lúa hoang lúa cao sản trồng tỉnh An Giang - Sáu mươi (60) dòng vi khuẩn Azospirillum địa phân lập từ lúa hoang lúa cao sản trồng tỉnh An Giang - Nhận diện định danh 04/60 dòng vi khuẩn. .. THƠ VI? ??N NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THANH HỒNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO NGHIỆM CÁC DÒNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM NỘI SINH TRÊN SINH TRƯỞNG VÀ NĂNG SUẤT CỦA LÚA CAO SẢN TRỒNG