Điều kiện Landesman Lazer suy rộng đối với một số lớp bài toán biên elliptic không tuyến tính

Điều kiện Landesman Lazer suy rộng đối với một số lớp bài toán biên elliptic không tuyến tính Điều kiện Landesman Lazer suy rộng đối với một số lớp bài toán biên elliptic không tuyến tính Điều kiện Landesman Lazer suy rộng đối với một số lớp bài toán biên elliptic không tuyến tính luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Bích Ngọc ĐIỀU TRA, NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU HÕA LƯỢNG ĐƯỜNG TRONG MÁU ĐỂ ỨNG DỤNG CHO BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số : 62 42 30 15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2012 Cơng trình hồn thành tại: Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Nguyễn Văn Mùi TS.Phạm Thị Hồng Minh Phản biện 1: GS.TS.Nguyễn Xuân Thắng - Trường Đại học Dược Hà Nội – Bộ Y tế Phản biện 2: PGS.TS.Lê Quang Huấn - Viện Công nghệ Sinh học - Viện KH&CNVN Phản biện 3: PGS.TS.Trịnh Hồng Thái - Trường ĐHKHTN Đại học Quốc gia Hà Nội Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội [ MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG 1.1.1 Khái niệm phân loại bệnh ĐTĐ 1.1.1.1 Khái niệm 1.1.1.2 Phân loại 1.1.2 Bệnh ĐTĐ type tính kháng insulin 1.1.2.1 Cơ chế tác dụng insulin 1.1.2.2 Tính kháng insulin 10 1.1.3 Biến chứng bệnh đái tháo đƣờng 12 1.1.4 Tình hình bệnh đái tháo đƣờng giới Việt Nam 14 1.1.4.1 Tình hình bệnh ĐTĐ giới 14 1.1.4.2 Tình hình bệnh ĐTĐ Việt Nam 15 1.2 SỬ DỤNG THUỐC VÀ THẢO DƢỢC TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG 15 1.2.1 Sử dụng thuốc điều trị đái tháo đƣờng 16 1.2.2 Nghiên cứu điều trị ĐTĐ thảo dƣợc giới 19 1.2.3 Nghiên cứu điều trị ĐTĐ từ nguồn thực vật Việt Nam 22 1.3 HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT DO ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE 24 1.3.1 Cơ chế tác dụng chất gây ức chế enzym α-glucosidase 24 126 1.3.2 Tổng quan dịch chiết thực vật hoạt chất sinh học có khả ức chế α-glucosidase 26 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 NGUYÊN LIỆU 35 2.1.1 Nguyên liệu đối tƣợng nghiên cứu 35 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 36 2.1.2.1 Hóa chất 36 2.1.2.2.Thiết bị thí nghiệm 37 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Phƣơng pháp chiết xuất 39 2.2.1.1 Xử lý mẫu 39 2.2.1.2 Chiết mẫu nước nóng 39 2.2.1.3 Chiết mẫu cồn 600 39 2.2.1.4 Chiết thu phân đoạn dung mơi có độ phân cực tăng dần 39 2.2.2 Phƣơng pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 40 2.2.2.1 Nuôi chuột nhắt béo chế độ ăn giàu chất béo (HFD- high fat diet) 41 2.2.2.2 Gây chuột nhắt ĐTĐ type thực nghiệm 41 2.2.2.3 Định lượng đường huyết 42 2.2.2.4 Nghiệm pháp dung nạp glucose 42 2.2.2.5 Định lượng insulin máu chuột kỹ thuật ELISA 43 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết chuột nhắt ĐTĐ type 43 2.2.3.1 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao thô 24 mẫu thực vật chuột nhắt ĐTĐ type 43 2.2.3.2 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao chiết phân đoạn mẫu vối, chè đắng chuột nhắt ĐTĐ type 45 2.2.3.3 Khả hạ đường huyết chế phẩm Thivoda chuột nhắt ĐTĐ type 45 2.2.4 Xác định số hóa sinh 45 2.2.4.1 GOT (glutamate oxalo acetate transaminase ) 45 2.2.4.2 GPT (glutamate pyruvate transaminase) 46 2.2.4.3 Cholesterol 46 127 2.2.4.4 Triglyceride 46 2.2.4.5 HDLc, LDLc 46 2.2.5 Phƣơng pháp làm tiêu đúc cắt gan chuột 47 2.2.6 Xác định khả ức chế enzym α-glucosidase 48 2.2.7 Xác định thành phần hóa học số mẫu thực vật 49 2.2.6.1 Khảo sát sơ thành phần hóa học số cao thô thực vật 49 2.2.6.2 Phương pháp phân lập chất 51 2.2.6.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 51 2.2.8 Bào chế chế phẩm Thivoda 53 2.2.9 Xác định độc tính cấp chế phẩm Thivoda 55 2.2.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 CHIẾT XUẤT BẰNG NƢỚC NÓNG VÀ CỒN 600 CÁC MẪU THỰC VẬT 57 3.2 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐIỀU HÕA ĐƢỜNG HUYẾT CỦA DỊCH CHIẾT THỰC VẬT TRÊN CHUỘT NHẮT ĐTĐ TYPE 59 3.2.1.Gây chuột nhắt ĐTĐ type 59 3.2.1.1 Kết nuôi chuột nhắt béo 59 3.2.1.2 Nồng độ đường huyết chuột nhắt béo sau tiêm STZ 62 3.2.1.3 Định lượng insulin máu chuột nhắt béo tiêm STZ 63 3.2.1.4 Nghiệm pháp dung nạp glucose 65 3.2.2 Sàng lọc mẫu thực vật có khả hạ đƣờng huyết 66 3.2.2.1 Đợt I 66 3.2.2.2 Đợt II 67 3.2.2.3 Đợt III 68 3.2.2.4 Đợt IV 69 3.3 NGHIÊN CỨU CAO CHIẾT MẪU LÁ VỐI VÀ LÁ CHÈ ĐẮNG 71 3.3.1 Ảnh hƣởng cao nƣớc vối, chè đắng lên hình thái tế bào chức gan chuột 72 3.3.1.1 Các số GOT, GPT máu chuột 72 3.3.1.2 Ảnh hưởng lên cấu trúc mô gan 73 3.3.2 Cao chiết phân đoạn vối 74 128 3.3.2.1.Khối lượng cao chiết phân đoạn vối 74 3.3.2.2 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao chiết phân đoạn vối 75 3.3.2.3 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase cao phân đoạn 76 3.3.2.4 Phân lập, xác định cấu trúc hợp chất từ cao phân đoạn vối có hoạt tính hạ đường huyết tốt 77 3.3.2.5 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ vối 89 3.3.3 Cao chiết phân đoạn chè đắng 91 3.3.3.1 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết cao chiết phân đoạn chè đắng …………………………………………………………………………… 92 3.3.3.2 Thành phần hóa học phân đoạn n-hexane chè đắng 93 3.3.4 Xác định hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 97 3.4 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ TÁC DỤNG CỦA CHẾ PHẨM THIVODA 99 3.4.1 Chọn lọc chế phẩm nguồn gốc từ thực vật có khả hạ đƣờng huyết 99 3.4.1.1 Định tính thành phần hóa học có mẫu thực vật 101 3.4.1.2 Tác dụng hạ đường huyết cao tổng nước cao tổng cồn 102 3.4.2 Bào chế nghiên cứu chế phẩm Thivoda có tác dụng điều hòa đƣờng huyết chuột nhắt đái tháo đƣờng type 104 3.4.2.1 Bào chế chế phẩm Thivoda 104 3.4.2.2 Nghiên cứu khả hạ đường huyết chế phẩm Thivoda chuột nhắt ĐTĐ type 105 3.4.2.3 Cơ chế hạ đường huyết 106 3.4.2.4 Nghiên cứu độc tính cấp chế phẩm Thivoda 109 KẾT LUẬN 111 ĐỀ NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 Tiếng Việt 115 Tiếng Anh 118 PHỤ LỤC 129 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR: 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cô ̣ng hƣởng tƣ̀ ̣t nhân proton) 13C-NMR: 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cô ̣ng hƣởng tƣ̀ ̣t nhân cacbon) ATP: Adenosine triphosphate BMI: Body Mass Index (Chỉ số khối thể) CBuOH: Cao n-buthanol CC: Cao cồn CEtA: Cao ethylacetate CHe: Cao n-hexane CNC: Cao nƣớc cuối CNN: Cao nƣớc nóng COSY : Chemical Shift Correlation Spectroscopy CTPT : Cơng thức phân tử DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐTĐ: Đái tháo đƣờng ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzym) g: Gam G1P: Glycerol phosphate GOD: Glucose oxidase GOT: Glutamate oxalate transaminase GPT: Glutamate pyruvate transaminase h: Giờ HbA1C: Glycated hemoglobin (Hemoglobin gắn đƣờng glucose) HDL: High Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao) HFD: High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo) HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IC50: Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hóa sinh) IDF: International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đƣờng Quốc tế) LD0: Lethal dose, 0% (Liều dƣới liều chết) LD50: Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LDL: Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) m: Khối lƣợng mg: Miligam ml: Mililit Mp: Melting point (Điểm nóng chảy) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) NCEP: National Cholesterol Education Program (Chƣơng trình Giáo dục Quốc gia Cholesterol) ND: Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thƣờng) NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) OD: Optical Density (Mật độ quang) POD: Peroxidase P-value: Probability value (Trị số p) PVPP: Polyvinylpyrrolidone R: Receptor Rf: Hệ số di chuyển R2 : Hệ số tƣơng quan Ser: Serine STZ: Streptozotocin TV: Thực vật Tyr: Tyrosine Thr: Threonine VLDL: Very Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) WHO: World Health Organization - Tổ chức Y tế giới μg: Microgram μl: Microlit DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá kết xét nghiệm ngƣời bệnh ĐTĐ theo WHO-năm 2002 Bảng 1.3 Định nghĩa NCEP hội chứng trao đổi chất 10 Bảng 1.4 : Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế αglucosidase 26 Bảng 2.1 Các mẫu thực vật đƣợc điều tra, nghiên cứu 35 Bảng 2.2 Các thiết bị đƣợc sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 41 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết 24 mẫu thực vật lên chuột nhắt ĐTĐ type 44 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu phân đoạn mẫu vối chè đắng 45 Bảng 3.1 Chiết xuất mẫu thực vật nƣớc nóng cồn 57 Bảng 3.2 Sự khác biệt số mỡ máu chuột nhóm ND HFD 61 Bảng 3.3 Mật độ quang insulin chuẩn 63 Bảng 3.4 Khả dung nạp glucose nhóm chuột 65 Bảng 3.5 Phần trăm tách chiết thu cao phân đoạn vối 75 Bảng 3.6 Nồng độ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type sau uống cao chiết phân đoạn vối 75 Bảng 3.7: Các số liệu phổ 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’dimethylchalcon 80 Bảng 3.8 Độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR chất C3 82 Bảng 3.9 Số liệu phổ cacbon LVE2 (3-hydroxy-olean-12(13)-en- 28-oic 85 acid) phổ oleanolic acid Bảng 3.10 Phần trăm khối lƣợng chất tinh từ vối 89 Bảng 3.11 Phần trăm tách chiết cao phân đoạn chè đắng 92 Bảng 3.12 Nồng độ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type sau uống cao chiết 92 phân đoạn chè đắng Bảng 3.13 Các số liệu phổ 1H 13C-NMR H4 96 Bảng 3.14 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase chất tinh từ vối, chè đắng 97 Bảng 3.15 Kết định tính thành phần hóa học 101 Bảng 3.16 Thành phần chế phẩm Thivoda 104 Bảng 3.17 Bảng theo dõi chuột thí nghiệm LD50 110 KẾT LUẬN Xác định 8/24 mẫu thực vật điều tra có tác dụng hạ đường huyết chuột nhắt ĐTĐ type gồm vối, nụ vối, dây thìa canh, chó đẻ cưa, chè đắng, vỏ thân ổi, tầm gửi mít, củ chuối hột Trong mẫu vối, thân chó đẻ cưa, vỏ thân ổi, tầm gửi mít, củ chuối hột phát Việt Nam hoạt tính hạ đường huyết Đối với mẫu vối: - Đã xác định đƣợc 03 cao chiết phân đoạn có khả hạ đƣờng huyết tốt chuột ĐTĐ type là: CHe, CEtA, CBuOH - Đã phân lập xác định đƣợc 07 chất vối β-sitosterol (H1); βsitosterol glucopyranoside (H2); 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’- dimethylchalcon (H6); 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid(C3); 3-hydroxyolean-12(13)-en-28-oic acid) (LVE2) ; 2,3β,23-trihydroxy-urs-12en-28-oic acid (LVE4); quercetin (C7) Trong hai hợp chất C3 LVE4 khơng phải chất nhƣng lần đƣợc phân lập tinh từ vối - Công bố hoạt tính ức chế enzym α-glucosidasecủa cao phân đoạn vối chất tinh IC50 phân đoạn CHe, CEtA, CBuOH lần lƣợt là: 5,037±0,6; 5,766±0,3; 8,011±0,7 μg/ml; IC50 hoạt chất H6, C3, LVE2, LVE4 tƣơng ứng 4,3±0,2; 3,6±0,5; 6,1±0,3; 5,7±0,5 μg/ml Đối với mẫu chè đắng: CHe chè đắng có tác dụng hạ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type ức chế 55% hoạt tính α-glucosidase nồng độ 7,84μg/ml Hợp chất H4 phân lập từ CHe đƣợc xác định 24-methyl (3-hydroxy-lup-20(29)-en-24-oic acid) ester gây ức chế 59,5% hoạt tính enzym α-glucosidase nồng độ μg/ml Cao nước vối chè đắng ngồi tác dụng hạ đường huyết cịn có tác dụng phục hồi gan chuột ĐTĐ type bị tổn thương Chế phẩm Thivoda có tác dụng hạ đường huyết: - Thành phần chế phẩm Thivoda gồm: vối, nụ vối, dây thìa canh, thân chó đẻ cƣa chè đắng - Chế phẩm Thivoda có khả hạ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type cách ổn định, ngày thứ 20 mức 7,5±1,4 mmol/l tƣơng đƣơng mức giảm 71% (p102 cm (đối với nam giới), >88 cm (đối với phụ nữ)) Hàm lƣợng triglyceride huyết >150 mg/dl Hàm lƣợng HDL cholesterol huyết