Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn đặc hiệu với Listeria Monocytogenes bằng kỹ thuật Phage display

Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn đặc hiệu với Listeria Monocytogenes bằng kỹ thuật Phage display Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn đặc hiệu với Listeria Monocytogenes bằng kỹ thuật Phage display Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn đặc hiệu với Listeria Monocytogenes bằng kỹ thuật Phage display luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG KHÁNG THỂ GẮN ĐẶC HIỆU VỚI LISTERIA MONOCYTOGENES BẰNG KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY NGUYỄN XUÂN HƯNG HÀ NỘI 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG KHÁNG THỂ GẮN ĐẶC HIỆU VỚI LISTERIA MONOCYTOGENES BẰNG KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN XUÂN HƯNG Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TÔ KIM ANH HÀ NỘI 2006 i MôC LôC MôC LôC i LờI CảM ƠN ii THUËT NGữ VIếT TắT iii LờI Mở ĐầU iv I TỉNG QUAN TµI LIƯU 1 Listeria monocytogenes Các phương pháp ph¸t hiƯn Listeria monocytogenes 17 Kü thuËt phage display 24 II NéI DUNG Vµ PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 37 VËt liÖu 37 Phương pháp nghiên cứu 40 III KếT QUả Và TH¶O LUËN 51 Phương pháp cố định tế bµo míi 51 Sµng läc phage 56 Chọn dòng phage đặc hiệu với L monocytogenes 59 3.1 3.2 Sàng lọc dòng phage riêng biệt với L monocytogenes 0704 59 Sàng lọc dòng đà chọn với chủng vi khuẩn khác 62 Tách dòng đọc trình tự gen mà hóa kháng thể 65 4.1 4.1 Nhân gen mà ho¸ kh¸ng thĨ b»ng PCR 65 Tách dòng sản phẩm PCR 67 Xác định đặc trưng kháng thể thu 78 5.1 5.2 Tiên đoán cấu trúc bËc ba 78 Tiên đoán thông số khác 79 KÕt luËn 80 Đề nghị 81 TàI LIệU THAM KHảO 83 Phô lôc 97 ii LêI CảM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Tô Kim Anh - Phòng Hóa sinh Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS Lê Quang Huấn - Phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đà hướng dẫn tận tình dìu đắt trình nghiên cứu hoàn thành luận án Trong trình làm luận văn vừa qua, đà nhận giúp đỡ tận tình bảo cán phòng Công nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt ThS Vũ Thị Bích Hường Nhân dịp xin cảm ơn thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm đà giúp đỡ dạy bảo thời gian học tập, nghiên cứu Bên cạnh xin cảm ơn gia đình đà tạo điều kiện động viên hoàn thành luận văn! iii THUậT NGữ VIếT TắT Stt Ký hiệu Tên đầy đủ ADN Axit Deoxyribonucleic Amp Ampicillin bp Base pair (cặp bazơ nitơ) ddNTP Dideoxynucleotide dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thÝ nghiÖm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) EtBr Ethidium Bromide HRP Horseradish peroxidase 10 IPTG Isopropyl-b -D-Thiogalactopyranoside 11 IR Inter-repeat region (miền lặp nội mạch bảo tồn) 12 Ka Kanamycin 13 kDa Kilo Dalton 14 LB M«i tr­êng Lauria Betani 15 LEB Listeria enrichment broth (Môi trường làm giàu Listiera) 16 LRR Leucine-rich repeat (đoạn lặp giàu leucine) 17 LTA Axit lipoteichoic 18 NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuÕch đại dựa trình tự axit nucleic) 19 OD Optical Density (MËt ®é quang häc) 20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 21 PEG Polyetylen Glycol 22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 23 TAE Tris - Acetate - EDTA 24 TE Tris - EDTA 25 v/ph vßng/phót 26 X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- b - D-galactopyranoside iv LờI Mở ĐầU Sự có mặt vi sinh vật gây bệnh thực phẩm vấn đề sức khỏe quan tâm rộng rÃi giới Bệnh vi sinh vật gây chiÕm xÊp xØ 25% tỉng sè ca tư vong toàn cầu Do đó, nhiều nghiên cứu nỗ lực chế tạo xét nghiệm nhằm phát nhanh vi sinh vËt g©y bƯnh thùc phÈm nh»m tèi thiểu hóa nguy hại cho người tiêu dùng L monocytogenes thủ phạm gây bệnh nghiêm trọng cho người động vật Vi khuẩn quan tâm đặc biệt khả phát triển nhiệt độ thấp tỷ lệ gây chết nhiễm lên tới 30% Rất nhiều phương pháp phát nhanh L monocytogenes đà phát triển, phương pháp miễn dịch, đặc biệt sắc ký miễn dịch cho thấy tiềm ứng dụng to lớn tính đơn giản, độ nhạy, độ xác cao khả áp dụng thực địa Chìa khóa thành công kỹ thuật nằm kháng thể gắn đặc hiệu với L monocytogenes Để tạo kháng thể có nhiều phương pháp, nhiên phage display kỹ thuật hiệu để chọn lọc kháng thể tái tổ hợp từ thư viện kháng thể Đề tài luận văn thạc sỹ khoa học Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn đặc hiệu với Listeria monocytogenes kỹ thuật phage display mong muốn góp phần nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng gắn đặc hiệu với L monocytogenes Trong đề tài này, vấn đề giải bao gồm: - Xây dựng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn mới, đơn giản, phï hỵp víi kü tht phage display - Lùa chän tạo kháng thể đặc hiệu cho L monocytogenes sử dụng kỹ thuật phage display - Tách dòng đọc trình tự đoạn kháng thể thu - Mô cấu trúc kháng thể thu I I TỉNG QUAN TµI LIƯU LISTERIA MONOCYTOGENES 1.1 Giíi thiệu chung Listeria monocytogenes lần mô tả Murray cộng năm 1926 [1] Trước số báo cáo đà đề cập việc phân lập chủng có khả Listeria [2], đáng tin cậy báo cáo Hulphers [3] Tuy nhiên, tác giả báo cáo không gửi chủng họ phân lập tới Ngân hàng giống chuẩn nên sau chủng không nghiên cứu so sánh với chủng khác [4] Năm 1927, nghiên cứu trường hợp chết lạ thường chuột nhảy xảy gần Johannesburg, Nam Phi, Pirie đà khám phá vi sinh vật mới, tác nhân gây bệnh Tiger River đặt tên Listerella hepatolytica [5] Hai tác giả Murray Pirie gửi chủng họ tới Ngân hàng giống chuẩn Quốc gia (NTC) viện Lister London Giám đốc thời NTC Leningham đà bị bất ngờ giống hai chủng nên yêu cầu Murray Pirie tiếp xúc Khi đồng rõ ràng, họ định gọi vi khuẩn Listerella monocytogenes [5, 6] Tuy nhiên năm 1939, Hội đồng phản biƯn, đy ban hƯ thèng vi khn qc tÕ ®· từ chối tên chi Listerella nên Pirie đề xuất tên chi Listeria năm 1940[5] Không số vi khuẩn gây bệnh nguyên nhân dẫn đến vụ bùng phát lớn có tính lịch sử Vibrio cholerae hay Yersinia pestis, L monocytogenes vµ bƯnh nã gây (listeriosis) bắt đầu ghi nhận thức vào năm 1924 Trường hợp nhiễm L monocytogenes xác nhận người quân nhân bị viêm màng nÃo vào cuối chiến tranh Thế giới thứ Một điều thú vị sử gia đà giả định L monocytogenes nguyên nhân khiến Queen Ams 17 (thế kỷ 17) mang thai không thành công [7] 1.2 Phát sinh loài phân bố Phát sinh loài Mối liên hệ Listeria với vi khuẩn khác không rõ ràng cho ®Õn thËp kû 70 cđa thÕ kû 20 Theo khóa phân loại vi khuẩn Bergey, Listeria Lactobacillus, Brochothrix, Kurthia, Caryophanon thuộc lớp Bacilli với đặc trưng: đối xứng, không tạo bào tử, dạng que, Gram dương, (bảng 1) [4] Trong nhiều năm, chi Listeria chứa loài L monocytogenes Sau loài khác bổ sung vào chi gồm: L denitrificans (vì có khả khử nitrate) năm 1948, L grayi (để vinh danh nhà vi sinh vật Mỹ, M Bảng 1: Vị trí phân loại Listeria Giới: Ngành: Líp: Bé: Hä: Chi: Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Listeriaceae Listeria L Gray) năm 1966, L murrayi (để vinh danh nhà vi sinh vật Canada, E G D Murray) năm 1971, L innocua (vì vô hại nó) năm 1981, L ivanovii (để vinh danh nhà vi sinh vật Bungary, I Ivanov) năm 1985, L welshimeri (để vinh danh nhà vi sinh vật Mỹ, H J Welshimer) năm 1983, L seeligeri (để vinh danh nhà vi sinh vật Đức, H P R Seeliger) năm 1983 Gần đây, phương pháp sinh học phân tử giúp đánh giá tính đa dạng chi Listeria xác hơn, cho thấy gåm loµi: L monocytogenes, L ivanovii, L innocua, L welshimeri, L seeligeri, L grayi [8] Phân tích phát sinh loài dựa gen mà hóa 16S rRNA, 23S rRNA cịng nh­ prs, ldh, vclA, vclB vµ iap chØ r»ng cã thÓ chia sè loài thuộc chi Listeria thành hai nhánh: L monocytogenes vµ L innocua n»m cïng mét nhãm nhãm thø hai gåm L welshimeri, L ivanovii, vµ L seeligeri (hình 1) [9] Hình 1: Cây phát sinh loài chi Listeria dựa gen 16S rRNA, 23S rRNA, iap, prs, vclB ldh Chủng không bệnh: màu gây xanh, chủng gây bệnh: màu đỏ [Theo 9] Phân bè Cã thĨ ph©n lËp L monocytogenes tõ nhiỊu ngn khác bao gồm đất, thức ăn gia súc, nước, nước thải, thực phẩm phân [10-12] Thức ăn gia súc ủ kỵ khí có khả nguồn gây lây nhiễm L monocytogenes chăn nuôi gia súc nguồn gốc bùng phát lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh chuỗi thức ăn [13] 1.3 Đặc tính Listeria monocytogenes 1.3.1 Đặc tính hình thái L monocytogenes vi khuẩn Gram dương, hình que ngắn, cân đối, hai đầu tròn, kích th­íc (0,4 - 0,5) x (0,5 2) mm (h×nh 2) Loài vi khuẩn không hình thành capsul không sinh bào tử [14] Chúng sống dạng dơn bào chuỗi ngắn xếp thành dạng X, Y Đôi tế bào có hình cầu với đường kính trung bình khoảng 0,5 mm Trong canh trường lỏng, số tế bào khả Hình 2: Hình ảnh vi khuẩn L monocytogenes qua kính hiển vi điện tử quét trì nhuộm Gram bị nhầm với chi Haemophillus [15] Listeria có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu theo nhóm kháng nguyên tế bào (somatic) O kháng nguyên tiên mao (flagellar) H Nhóm kháng nguyên O có 15 loại (I-XV) kháng nguyên H gồm loại (A-D) [16] Kiểu huyết chủng Listeria xác định dựa diện kháng nguyên O H (bảng 2) Theo L monocytogenes có 13 kiĨu hut thanh, víi kiĨu hut 4b, 1/2a, 1/2b nguyên nhân gây khoảng 98% vụ nhiễm độc người [17, 18] Các chủng có kiểu huyết 4b phân lập từ hầu hết vơ bïng ph¸t listeriosis c¸c kiĨu hut 1/2a, 1/2b thường nguyên nhân trường hợp nhiễm bệnh rải rác [18] 93 164 Yin, J., Liu, F., Schinke, M., Daly, C., Walsh, C T 2004 Phagemid encoded small molecules for high throughput screening of chemical libraries J Am Chem Soc 126:13570-13571 165 Rodi, D J., Janes, R W., Sanganee, H J., Holton, R A., Wallace, B A., Makowski, L 1999 Screening of a library of phage-displayed peptides identifies human bcl-2 as a taxol-binding protein J Mol Biol 285:197-203 166 Jin, Y., Yu, J., Yu, Y G 2002 Identification of hNopp140 as a binding partner for doxorubicin with a phage display cloning method Chem Biol 9:157-162 167 Sche, P P., McKenzie, K M., White, J D., Austin, D J 1999 Display cloning: functional identification of natural product receptors using cDNA-phage display Chem Biol 6:707-716 168 Steukers, M., Schaus, J.-M., Gool, R v., Hoyoux, A., Richalet, P., et al 2006 Rapid kinetic-based screening of human Fab fragments J Immunol Methods 310:126-135 169 Ozawa, M., Ohashi, K., Onuma, M 2005 Identification and characterization of peptides binding to newcastle disease virus by phage display J Vet Med Sci 67:1237-1241 170 Klimka, A., Yu, N., Shami, E Y 2003 Construction of proteolysis resistant human interleukin-2 by fusion to its protective single chain antibody Cytokine 22:134-141 171 Mourez, M., Kane, R S., Mogridge, J., Metallo, S., Deschatelets, P., et al 2001 Designing a polyvalent inhibitor of anthrax toxin Nat Biotechnol 19:958-961 172 Gao, B Y L., Li, L., Lu, Z., Fan, X., Patel, C A., et al 2003 Potent suppression of viral infectivity by the peptides that inhibit multimerization of human immunodeficiency virus type (HIV-1) Vif proteins J Biol Chem 278:6596-6602 173 Schumacher, T N., Mayr, L M., Minor, D L., Milhollen, M A., Burgess, M W., Kim, P S 1996 Identification of D-peptide ligands through mirror-image phage display Science 271:1854-1857 174 Eckert, D M., Malashkevich, V N., Hong, L H., Carr, P A., Kim, P S 1999 Inhibiting HIV-1 entry: discovery of D-peptide inhibitors that target the gp41 coiledcoil pocket Cell 99:103-115 175 Kozlov, I A., Xu, S M Y., Huang, X., Lee, L., Sears, P S., et al 2001 Synthesis of solid-supported mirror-image sugars: a novel method for selecting receptors for cellular-surface carbohydrates ChemBioChem 2:741-746 176 Wiesehan, K., Buder, K., Linke, R P., Patt, S., Stoldt, M., et al 2003 Selection of D-amino-acid peptides that bind to Alzheimer's disease amyloid peptide abeta1-42 by mirror image phage display ChemBioChem 4:748-753 177 Findeis, M A., Musso, G M., Arico-Muendel, C C., Benjamin, H M., Hundal, A M., et al 1999 Modified-peptide inhibitors of amyloid beta-peptide polymerization Biochemistry 38:6791-6800 178 Poduslo, J F., Curran, G L., Kumar, A., Frangione, B., Soto, C 1999 Beta-sheet breaker peptide inhibitor of Alzheimer's amyloidogenesis with increased blood-brain barrier permeability and resistance to proteolytic degradation in plasma J Neurobiol 39:371-382 179 Sarikaya, M., Tamerler, C., Schwartz, D T., Baneyx, F 2004 Materials assembly and formation using engineered polypeptides Annu Rev Mater Res 34:373-408 180 Naik, R R., Stringer, S J., Agarwal, G., Jones, S E., Stone, M O 2002 Biomimetic synthesis and patterning of silver nanoparticles Nat Mater 1:169-172 94 181 Yu, L., Banerjee, I A., Matsui, H 2003 Direct growth of shape-controlled nanocrystals on nanotubes via biological recognition J Am Chem Soc 125:1483714840 182 Li, C., Botsaris, G D., Kaplan, D L 2002 Selective in vitro effect of peptides on calcium carbonate crystallization Cryst Growth Des 2:387-393 183 Flynn, C E., Mao, C., Hayhurst, A., Williams, J L., Georgiou, G., et al 2003 Synthesis and organization of nanoscale II-VI semiconductor materials using evolved peptide specificity and viral capsid assembly J Mater Chem 13:2414-2421 184 Reiss, B D., Mao, C., Solis, D J., Ryan, K S., Thomson, T., Belcher, A M 2004 Biological routes to metal alloy ferromagnetic nanostructures Nano Lett 4:1127 1132 185 Mao, C., Flynn, C E., Hayhurst, A., Sweeney, R., Qi, J., et al 2003 Viral assembly of oriented quantum dot nanowires Proc Natl Acad Sci USA 100:69466951 186 Mao, C., Solis, D J., Reiss, B D., Kottmann, S T., Sweeney, R Y., et al 2004 Virus-based toolkit for the directed synthesis of magnetic and semiconducting nanowires Science 303:213-217 187 Lee, S W., Belcher, A M 2004 Virus-based fabrication of micro- and nanofibers using electrospinning Nano Lett 4:387-390 188 Nam, K T., Peelle, B R., Lee, S W., Belcher, A M 2004 Genetically driven assembly of nanorings based on the M13 Virus Nano Lett 4:23-27 189 Sieber, V., Pluckthun, A., Schmid, F X 1998 Selecting proteins with improved stability by a phage-based method Nat Biotechnol 16:955-960 190 Bai, Y., Feng, H 2004 Selection of stably folded proteins by phage-display with proteolysis Eur J Biochem 271:1609-1614 191 Chu, R., Takei, J., Knowlton, J R., Andrykovitch, M., Pei, W., et al 2002 Redesign of a four-helix bundle protein by phage display coupled with proteolysis and structural characterization by NMR and X-ray crystallography J Mol Biol 323:253-262 192 Riechmann, L., Winter, G 2000 Novel folded protein domains generated by combinatorial shuffling of polypeptide segments Proc Natl Acad Sci USA 97:10068-10073 193 Fischer, N., Riechmann, L., Winter, G 2004 A native-like artificial protein from antisense DNA Protein Eng Des Sel 17:13-20 194 Takeuchi, T., Harris, J L., Huang, W., Yan, K W., Coughlin, S R., Craik, C S 2000 Cellular localization of membrane-type serine protease and identification of protease-activated receptor-2 and single-chain urokinase-type plasminogen activator as substrates J Biol Chem 275:26333-26342 195 Beck, Z Q., Hervio, L., Dawson, P E., Elder, J H., Madison, E L 2000 Identification of efficiently cleaved substrates for HIV-1 protease using a phage display library and use in inhibitor development Virology 274:391-401 196 Rasmussen, F H., Yeung, N., Kiefer, L., Murphy, G., Lopez-Otin, C., et al 2004 Use of a multiple-enzyme/multiple-reagent assay system to quantify activity levels in samples containing mixtures of matrix metalloproteinases Biochemistry 43:29872995 95 197 Rebar, E J., Huang, Y., Hickey, R., Nath, A K., Meoli, D., et al 2002 Induction of angiogenesis in a mouse model using engineered transcription factors Nat Med 8:1427-1432 198 Beerli, R R., Segal, D J., Dreier, B., Barbas, C F 1998 Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks Proc Natl Acad Sci USA 95:14628-14633 199 Segal, D J., Goncalves, J., Eberhardy, S., Swan, C H., Torbett, B E., et al 2004 Attenuation of HIV-1 replication in primary human cells with a designed zinc finger transcription factor J Biol Chem 279:14509-14519 200 Mortlock, A., Low, W., Crisanti, A 2003 Suppression of gene expression by a cellpermeable Tet repressor Nucleic Acids Res 31:e152 201 Xu, Y., Yamamoto, N., Janda, K D 2004 Catalytic antibodies: hapten design strategies and screening methods Bioorg Med Chem 12:5247-5268 202 Hilvert, D 2000 Critical analysis of antibody catalysis Annu Rev Biochem 69:751-793 203 Tanaka, F., Lerner, R A., Barbas, C F 2000 Reconstructing aldolase antibodies to alter their substrate specificity and turnover J Am Chem Soc 122:4835-4836 204 Tanaka, F., Fuller, R., Shim, H., Lerner, R A., Barbas, C F 2004 Evolution of aldolase antibodies in vitro: correlation of catalytic activity and reaction-based selection J Mol Biol 335:1007-1018 205 Legendre, D., Laraki, N., Graslund, T., Bjornvad, M E., Bouchet, M., et al 2000 Display of active subtilisin 309 on phage: analysis of parameters influencing the selection of subtilisin variants with changed substrate specificity from libraries using phosphonylating inhibitors J Mol Biol 296:87-102 206 Paul, S., Tramontano, A., Gololobov, G., Zhou, Y X., Taguchi, H., et al 2001 Phosphonate ester probes for proteolytic antibodies J Biol Chem 276:28314-28320 207 Juillerat, A., Gronemeyer, T., Keppler, A., Gendreizig, S., Pick, H., et al 2003 Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for efficient labeling of fusion proteins with small molecules in vivo Chem Biol 10:313-317 208 Xia, G., Chen, L., Sera, T., Fa, M., Schultz, P G., Romesberg, F E 2002 Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase Proc Natl Acad Sci USA 99:6597-6602 209 Mutuberria, R., Satijn, S., Huijbers, A., Van Der Linden, E., Lichtenbeld, H., et al 2004 Isolation of human antibodies to tumor-associated endothelial cell markers by in vitro human endothelial cell selection with phage display libraries J Immunol Methods 287:31-47 210 Edwards, B M., Main, S H., Cantone, K L., Smith, S D., Warford, A., Vaughan, T J 2000 Isolation and tissue profiles of a large panel of phage antibodies binding to the human adipocyte cell surface J Immunol Methods 245:6778 211 Wu, M., Pasula, R., Smith, P A., Martin, W J 2003 Mapping alveolar binding sites in vivo using phage peptide libraries Gene Ther 10:1429-1436 212 Jost, P J., Harbottle, R P., Knight, A., Miller, A D., Coutelle, C., Schneider, H 2001 A novel peptide, THALWHT, for the targeting of human airway epithelia FEBS Lett 489:263-269 96 213 O'Brien, P M., Aitken, R 2001 Antibody Phage Display: Methods and Protocols Totowa, NJ.: Humana Press Inc 391 pp 214 Ivanov, V S., Suvorova, Z K., Tchikin, L D., Kozhich, A T., Ivanov, V T 1992 Effective method for synthetic peptide immobilization that increases the sensitivity and specificity of ELISA procedures J Immunol Methods 153:229-233 215 Siegel, D L., Chang, T Y., Russell, S L., Bunya, V Y 1997 Isolation of cell surface-specific human monoclonal antibodies using phage display and magneticallyactivated cell sorting: applications in immunohematology J Immunol Methods 206:73-85 216 Konthur, Z., Crameri, R 2003 High-throughput applications of phage display in proteomic analyses TARGETS 2:261-270 217 Trost, M., Wehmhöner, D., Kärst, U., Dieterich, G., JürgenWehland, Jänsch, L 2005 Comparative proteome analysis of secretory proteins from pathogenic and nonpathogenic Listeria species Proteomics 5:1544-1557 218 Bhunia, A K., Ball, P H., Fuad, A T., Kurz, B W., Emerson, J W., Johnson, M G 1991 Development and characterization of a monoclonal antibody specific for Listeria monocytogenes and Listeria innocua Infect Immun 59:3176-3184 219 Paoli, G C., Chen, C.-Y., Brewster, J D 2004 Single-chain Fv antibody with specificity for Listeria monocytogenes J Immunol Methods 289:147-155 220 Liu, D 2006 Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen J Med Microbiol 55:645-659 221 Sanger, F., Nicklen, S., Coulson., A R 1977 DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467 222 Muyldermans, S., Lauwereys, M 1999 Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies J Mol Recognit 12:131-140 223 Ghahroudi, M A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S 1997 Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavychain antibodies FEBS Lett 414:521-526 224 Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Bajyana Songa, E., et al 1993 Naturally occurring antibodies devoid of light chains Nature 363:446-448 225 De Jaeger, C., De Wilde, C., Eeckhout, D., Fiers, E., Depicker, A 2000 The plantibody approach: expression of antibody genes in plants to modulate plant metabolism or to obtain pathogen resistance Plant Mol Biol 43:419-428 226 Wingren, C., Alkner, U., Ulla-Britt Hansson 2001 Antibody classes Encyclopedia of Life Science 1-8 227 Chothia, C., Lesk, A M 1987 Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins J Mol Biol 196:901-917 228 Tramontano, A 1998 Homology modeling with low sequence identity Methods 14:293-300 229 Rost, B., O'Donoghue, S 1997 Sisyphus and prediction of protein structure Comput Appl Biosci 13:345-356 230 Lambert, C., Leonard, N., Bolle, X D., Depiereux, E 2002 ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures Bioinformatics 18:1250-1256 Phô lơc Phơ lơc 1: KÕt qu¶ ELISA víi L monocytogenes 0704 hỗn hợp phage sau vòng sàng lọc Vòng sàng lọc OD Vòng Vòng Vòng Vßng Vßng 0.021 0.054 0.094 0.077 0.305 Phơ lục 2: Kết sàng lọc lực 96 dòng phage thu với L monocytogenes 0704 kỹ thuËt ELISA 10 11 12 A 0.073 0.067 0.091 0.062 0.065 0.083 0.074 0.084 0.076 0.079 B 0.071 0.061 0.071 0.067 0.072 0.064 0.091 0.093 0.098 0.082 0.064 0.108 C 0.109 0.072 D 0.095 0.082 0.102 E 0.084 0.074 0.071 0.066 0.075 0.076 F 0.09 0.081 0.07 0.073 0.086 0.118 0.077 0.06 0.077 0.09 0.073 0.064 0.07 0.067 0.085 0.068 0.084 0.076 0.069 0.069 0.067 0.1 0.085 0.099 0.085 0.078 0.062 0.08 0.073 0.103 0.065 0.082 0.088 0.089 0.101 0.085 0.087 0.066 0.064 G 0.105 0.091 0.065 H 0.066 0.069 0.071 0.103 0.064 0.101 0.092 0.088 0.182 0.136 0.07 0.073 0.083 0.074 0.11 0.11 0.096 0.061 0.102 0.06 0.078 Phô lôc 3: Trình tự nucleotide đoạn kháng thể thu Phụ lục 4: So sánh trình tự nucleotide đoạn kháng thể thu với trình tự công bố Ngân hàng gene phần mềm FASTA Alingment DB:ID Source Length Identity% Similar% Overlap E() EM_HUM:AF396469 Homo sapiens clone A10 anti- 324 96.330 96.330 327 8.3e-63 EM_HUM:AY941994 Homo sapiens clone SC4010 an 321 95.370 95.370 324 8.1e-61 EM_HUM:AY942131 Homo sapiens clone SC4159 an 321 95.370 95.370 324 8.1e-61 EM_HUM:BC073791 Homo sapiens immunoglobulin 948 94.785 94.785 326 1.1e-60 EM_HUM:AY942010 Homo sapiens clone SC4027 an 321 94.753 94.753 324 5.7e-60 EM_HUM:AY942044 Homo sapiens clone SC4064 an 321 94.753 94.753 324 5.7e-60 EM_HUM:AF103418 Homo sapiens isolate donor D 318 95.873 95.873 315 1.5e-59 EM_HUM:DQ322818 Homo sapiens immunoglobulin 322 94.154 94.154 325 2.4e-59 EM_HUM:AY942051 Homo sapiens clone SC4072 an 321 94.136 94.136 324 4.1e-59 10 EM_HUM:AF099196 Homo sapiens JakVL immunoglo 324 93.519 93.519 324 6.2e-59 11 EM_HUM:AJ408402 Homo sapiens partial IGKV ge 320 94.118 94.118 323 7e-59 12 EM_HUM:U43767 Human immunoglobulin light chain 441 93.558 93.558 326 8.2e-59 13 EM_HUM:AJ697898 Homo sapiens partial mRNA fo 321 93.827 93.827 324 1.1e-58 14 EM_HUM:BC095489 Homo sapiens immunoglobulin 957 93.252 93.252 326 1.5e-58 15 EM_HUM:M85256 Homo sapiens immunoglobulin kapp 324 93.272 93.272 327 1.5e-58 16 EM_HUM:AY942075 Homo sapiens clone SC4098 an 321 93.519 93.519 324 2.9e-58 17 EM_HUM:S73911 Ig Vk=IgM autoantibody {Vk domai 360 92.331 93.252 326 4.7e-58 18 EM_HUM:DQ101044 Homo sapiens isolate N1737K 325 92.615 92.615 325 6.8e-58 19 EM_HUM:AY942130 Homo sapiens clone SC4158 an 321 93.210 93.210 324 7.7e-58 20 EM_HUM:X63370 H.sapiens gene for immunoglobuli 1528 92.966 92.966 327 8.2e-58 21 EM_HUM:DQ101043 Homo sapiens isolate N1728K 322 92.923 92.923 325 1.2e-57 22 EM_HUM:DQ101173 Homo sapiens isolate P795K i 316 93.671 93.671 316 1.8e-57 23 EM_HUM:AF007572 Homo sapiens anti-DNA antibo 324 92.901 92.901 324 2e-57 24 EM_HUM:AY942128 Homo sapiens clone SC4156 an 321 92.901 92.901 324 2e-57 25 EM_HUM:AC096767 Homo sapiens BAC clone RP11- 143210 97.887 97.887 284 4.4e-57 26 EM_HUM:DQ172486 Homo sapiens isolate NM15-CD 358 92.331 92.331 326 4.6e-57 27 EM_HUM:AF329460 Homo sapiens clone SK-45 rec 321 92.593 92.593 324 5.4e-57 28 EM_HUM:AP001241 Homo sapiens genomic DNA, ch 38403 97.887 97.887 284 6.4e-57 29 EM_HUM:AP001230 Homo sapiens genomic DNA, ch 36008 97.887 97.887 284 6.6e-57 30 EM_HUM:AM184028 Homo sapiens partial mRNA fo 334 92.049 92.049 327 7.4e-57 31 EM_HUM:DQ187660 Homo sapiens donor serotyp 322 92.308 92.308 325 8.4e-57 32 EM_HUM:AJ005976 Homo sapiens mRNA for immuno 315 93.671 93.671 316 8.5e-57 33 EM_HUM:DQ322739 Homo sapiens immunoglobulin 359 92.025 92.025 326 1.2e-56 34 EM_HUM:AF228323 Homo sapiens clone VILA immu 531 91.411 91.411 326 1.5e-56 35 EM_HUM:AB064073 Homo sapiens IGK mRNA for im 808 91.718 91.718 326 2.2e-56 36 EM_HUM:DQ322885 Homo sapiens immunoglobulin 322 92.000 92.000 325 2.2e-56 37 EM_HUM:AJ243111 Homo sapiens partial mRNA fo 311 93.910 93.910 312 2.8e-56 38 EM_HUM:L26891 Homo sapiens immunoglobulin kapp 384 91.718 91.718 326 3.1e-56 39 EM_HUM:AY867158 Homo sapiens clone 135a07 an 321 93.671 93.671 316 3.8e-56 40 EM_HUM:AY942064 Homo sapiens clone SC4087 an 321 91.975 91.975 324 3.8e-56 41 EM_HUM:M64858 Human IgK subgroup I germline ge 891 97.887 97.887 284 4.4e-56 42 EM_HUM:L33036 Human immunoglobulin kappa light 382 92.025 92.025 326 5.4e-56 43 EM_HUM:X93621 H.sapiens germline immunoglobuli 287 97.887 97.887 284 7.8e-56 44 EM_HUM:X64163 H.sapiens mRNA for Fog1L kappa l 390 91.411 91.411 326 8.3e-56 45 EM_HUM:Z27178 H.sapiens rearranged mRNA for Ig 342 91.411 91.411 326 8.9e-56 46 EM_HUM:D38039 Homo sapiens mRNA for cationic a 324 91.411 91.411 326 9.1e-56 47 EM_HUM:AY867217 Homo sapiens clone 152a04 an 330 93.354 93.354 316 1e-55 48 EM_HUM:AF209742 Homo sapiens anti-pneumococc 423 92.994 92.994 314 1.5e-55 49 EM_HUM:AF209738 Homo sapiens anti-pneumococc 421 94.426 94.426 305 1.5e-55 50 EM_HUM:AJ408403 Homo sapiens partial IGKV ge 313 92.652 92.652 313 1.8e-55 Phơ lơc 5: So s¸nh trình tự protein đoạn kháng thể thu với trình tự công bố Ngân hàng gene phÇn mỊm FASTA Identities computed with respect to: (query) Query Maximum sequences to show: 50 Colored by: identity + property Query orientation: + 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Query UNIPROT:Q6GMW1_HUMAN UNIPROT:Q502W4_HUMAN UNIPROT:KV1G_HUMAN UNIPROT:KV1R_HUMAN UNIPROT:Q6GMX8_HUMAN UNIPROT:KV1H_HUMAN UNIPROT:Q96SA9_HUMAN UNIPROT:Q9UL70_HUMAN UNIPROT:Q9UL77_HUMAN UNIPROT:Q6GMX0_HUMAN UNIPROT:KV1W_HUMAN UNIPROT:Q65ZC8_HUMAN UNIPROT:Q7Z3Y4_HUMAN UNIPROT:Q9UL81_HUMAN UNIPROT:Q9UL79_HUMAN UNIPROT:KV1E_HUMAN UNIPROT:Q6PIT5_HUMAN UNIPROT:Q65ZC9_HUMAN UNIPROT:Q5EFE6_HUMAN UNIPROT:Q6PIH7_HUMAN UNIPROT:Q7Z473_HUMAN UNIPROT:KV1C_HUMAN UNIPROT:KV1N_HUMAN UNIPROT:KV1V_HUMAN 1:109 1:109 1:179 1:109 1:179 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 1:108 1:109 1:107 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 1:129 1:109 109:244 1:109 1:179 1:109 1:107 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 105:240 1:109 1:179 1:109 1:179 1:109 1:179 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 [ : 80 ATQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQP AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIFAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIICRASQGIRNDLTWYQQKPGKAPKELIYAASNLQSGVPSRFSGSGAGTEFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLTWYQQKPGTAPKRLIYGATSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLSWYQQKPGKAPQVLIYAASSLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKSLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNYLNWYQLKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLRP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVTSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKFLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDTVTITCRASQDISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYGASSLQSGVQSKFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQA DIVMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISSYLAWYQQKPGKAPELLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQS BIZMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQSVNKYLNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLLP AIQLTQSPSSLSASVGERVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKPPKLLIYDASTMESGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQP DIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYRWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASRAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCRASQDIRNYVAWYQQKSGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQS DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCRASQSIGSYLAWYQQKPGKAPQLLIYAASTLQSGVPSRFSGSASGTDFTLSISCLQS DIQMTQSPSPLSASVGDSVTITCQASQDIRNSLIWYQQKPGKAPKFLIYDAENLEIGVPSRFRGSGSGTDFALSISSLQP DIQMTZSPSSLSASVGBRVTITCRASZTISSYLBWYZZKPGKAPBLLIYAASBLHSGVPSRFSGSGSGTBFTFTISSLZP DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVYNYVAWFQQKPGKAPKSLIYDASTLQSGVPSNFTGSGSGTDFILTISSLQP 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 UNIPROT:KV1X_HUMAN UNIPROT:KV1F_HUMAN UNIPROT:KV1B_HUMAN UNIPROT:Q6PIH4_HUMAN UNIPROT:KV1T_HUMAN UNIPROT:Q6GMX9_HUMAN UNIPROT:KV1M_HUMAN UNIPROT:KV1O_HUMAN UNIPROT:KV1S_HUMAN UNIPROT:KV1D_HUMAN UNIPROT:KV1L_HUMAN UNIPROT:KV1Q_HUMAN UNIPROT:KV1K_HUMAN UNIPROT:KV1Y_HUMAN UNIPROT:KV1P_HUMAN UNIPROT:KV1I_HUMAN UNIPROT:KV1A_HUMAN UNIPROT:Q569I7_HUMAN UNIPROT:KV1J_HUMAN UNIPROT:KV3H_HUMAN UNIPROT:Q96PF6_HUMAN UNIPROT:Q5M838_RAT UNIPROT:KV5S_MOUSE UNIPROT:KV5Q_MOUSE UNIPROT:KV5T_MOUSE UNIPROT:Q6GMW0_HUMAN 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 Query UNIPROT:Q6GMW1_HUMAN UNIPROT:Q502W4_HUMAN UNIPROT:KV1G_HUMAN UNIPROT:KV1R_HUMAN UNIPROT:Q6GMX8_HUMAN UNIPROT:KV1H_HUMAN UNIPROT:Q96SA9_HUMAN UNIPROT:Q9UL70_HUMAN UNIPROT:Q9UL77_HUMAN 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:109 1:129 1:108 1:108 1:179 1:109 1:179 1:108 1:108 1:108 1:107 1:108 1:108 1:108 1:108 1:108 1:117 1:108 1:179 1:117 1:129 1:116 1:179 1:108 1:108 1:108 1:180 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGHNITNFLSWYQQKPGKAPTLLIYAVSNLQVGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQP DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINTWLAWYQQKPGKAPKLLMYKASSLESGVPSRFIGSGSGTEFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISDYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGGGSGAHFTFTISSLQP DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIACRASQWISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASRLESGVPSRFSGSGSGTEFSLTISGLQP DVQMTQSPSSLSASVGDRVIITCRASQSSVDYLNWYQQKPGKAPKLLIFDTSNLQSGVPSRFSGGRSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGHRVTITCRASQNVSRWLAWYQQRPEKAPKSLIYATSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSVSVGDRVTITCQASQNVNAYLNWYQQKPGLAPKLLIYGASTREAGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIIKYLNWYQQTPGKAPKLLIYEASNLQAGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQP DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISHWLAWYQQKSGKAPKLLIYSASSLENGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP DIQMTQSPSTLSASVGDRVAITCRASQNISSWLAWYQQKPGKAPKVLIYKSSSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLZP DIQMTQSPSTQPASVGDRVTITCRASQSINIWLAWYQQKPEKAPKLLIYKASTLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRKHLNWYDQKPGKAPRLLIYGASTLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQP DIQMTQSPSTLSVSVGDRVTITCEASQTVLSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLETGVPSRFSGQGSGTBFTFTISSVZP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDITNYVNWFQQRPGQAPKVLIYGASILETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISIFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASKLEAGVPSRFSGTGSGTDFTFTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRARQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINHYLNWYQQGPKKAPKILIYDASNLETGVPSRFSGSGFGTDFTFTISGLQP DVQMTQSPSPLSASVGDRITITCQASQDIRKYLNWYQQKPGQAPKLLIYDASDLETGVPSRFSGSGFGTDFSLSISSLQT DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQPPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLQS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFICQASQDIANHLNWYQKKPGEAPKFLIYDGSFLKTGVPSRFSGGGSATNFTVTISSLQP DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDLAWYQQKSGKSPQLLIYAASRLQDGVPSRFSGSGSGTRYSLKISGMQP DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKAPKLLIYGASNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLED DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKAPKLLIYGASILEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLED DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTNINLNWFQQKPGKAPKLLIYGASILEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLED EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRVTGIPGRFSGSGSGTEFTLSISSLQS 81 1:179 1:179 1:108 1:108 1:179 1:108 1:107 1:108 1:108 ] 109 EDFATYYCLQDYNYPNTTFGQGTKLEIKR EDFATYYCLQDYNYP-WTFGQGTKVEIKR EDFATYYCLQYNSYPRT-FGQGTKVEIKR EDFATYYCLQQNSYPRS-FGQGTKVEIKR EDFATYYCLQYSSFP-WTFGQGTKVEVKR EDFATYYCQQAHSFP-FTFGPGTKVDIKR EDFATYYCQQNYITP-TSFGQGTRVEIKR EDFATYYCQQSYS TLTFGGGTKVEIKR EDVATYYC-QKYNSAPRTFGPGTKLEIKR EDFATYYCQQSYS-TSWTFGEGTKVEIKR 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 UNIPROT:Q6GMX0_HUMAN UNIPROT:KV1W_HUMAN UNIPROT:Q65ZC8_HUMAN UNIPROT:Q7Z3Y4_HUMAN UNIPROT:Q9UL81_HUMAN UNIPROT:Q9UL79_HUMAN UNIPROT:KV1E_HUMAN UNIPROT:Q6PIT5_HUMAN UNIPROT:Q65ZC9_HUMAN UNIPROT:Q5EFE6_HUMAN UNIPROT:Q6PIH7_HUMAN UNIPROT:Q7Z473_HUMAN UNIPROT:KV1C_HUMAN UNIPROT:KV1N_HUMAN UNIPROT:KV1V_HUMAN UNIPROT:KV1X_HUMAN UNIPROT:KV1F_HUMAN UNIPROT:KV1B_HUMAN UNIPROT:Q6PIH4_HUMAN UNIPROT:KV1T_HUMAN UNIPROT:Q6GMX9_HUMAN UNIPROT:KV1M_HUMAN UNIPROT:KV1O_HUMAN UNIPROT:KV1S_HUMAN UNIPROT:KV1D_HUMAN UNIPROT:KV1L_HUMAN UNIPROT:KV1Q_HUMAN UNIPROT:KV1K_HUMAN UNIPROT:KV1Y_HUMAN UNIPROT:KV1P_HUMAN UNIPROT:KV1I_HUMAN UNIPROT:KV1A_HUMAN UNIPROT:Q569I7_HUMAN UNIPROT:KV1J_HUMAN UNIPROT:KV3H_HUMAN UNIPROT:Q96PF6_HUMAN UNIPROT:Q5M838_RAT 1:109 1:179 1:109 1:129 1:109 109:244 1:109 1:179 1:109 1:107 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 105:240 1:109 1:179 1:109 1:179 1:109 1:179 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:129 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 1:109 1:109 1:179 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:107 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:108 1:109 1:117 1:109 1:108 1:109 1:179 1:109 1:117 1:109 1:129 1:109 1:116 1:109 1:179 DDFATYYCQQSYNIP-LTFGGGTNVEIKR EDSATYYCQQSYS-TLITFGQGTRLEIKDDFATYYCQQYSNYP-LTFGGGTKLEIKR EDFATYYCQQYKSYP-VTFGQGTKLEIKR EDFATYYCQQSYS ALTFGPGTKVDIRR EDFATYYCQQYYSFP-PTFGQGTKVEIKR EDFATYYCQQSYTTPYT-FGPGTKVEMTR EDFATFYCQQFKSYPRT-FGQGTTLEIKR DDFATYYCQQYSNYP-LTFGGGTKLEIKR EDFATYYCQQYYNSP-PTFGQGTRVEITR EDFATYYCQQLNSSP-PTFGGGTKVEIKR EDFATYYCQQYYTYP-WTFGQGTKVEIKR EDFATYYCQQYYNLPYT-FGQGTKLEIKR ZBFATYYCZZSYSSP-TTFGZGTRLZIKR EDFATYYCQQYNSYPYT-FGQGTKVQIKR EDFATYYCQQNYNF-SFTFGGGTKVDNKDDFATYYC-QQYNSDSKMFGQGTKVEVKG EDIATYYC-QQYDYLPWTFGQGTKVEIKR DDFATYYC-QPYNSNSPQFGQGTKVEIKR DDFATYYCQQSYTNPEVTFGGGTTVDIKR EDFATYYCQQYNTYP-LTFGGGTKVEIKR EDIATYYCQQYNNWP-PTFGQGTKVEVKR EDIATYYCQQYQSLPYT-FGQGTKLQITR EDFATYFCQQAHSVP-LTFGGGTTVDIKR BBFATYYC-QQYN-TFFTFGPGTKVDIKR DDFATYYCQQYSRYPYT-FGQGTKLDIKR EDINGYYCQQYDNVP-ITFGQGTRVENKG ZBFATYYCQZYLDLPRT-FGQGTKVDLKR EDIATYYC-QQYDTLPLTFGGGTKVDIKR EDIATYYCQQFDNLP-LTFGGGTKVDFKR EDFATYYCQQYNSYP -EDIATYYC-QQYDTLPRTFGQGTKLEIKR EDVATYYCQQFETFP-LTFGPGTKVEIKR DDFATYYC-QQYNSYS EDFAVYYCQQYNNWPPWTFGQGTRVEIKR EDFATYYCQQYHHLP-FTFGPGTKVDFKR EDEADYFCQQSYKYPYT-FGAGTKLELKR Phơ lơc 6: Kh¸ng sinh môi trường tăng sinh Dung dịch kháng sinh Thành phần Nồng độ Ampicilin (50mg/ml) Ampicillin Na-salt 70% ethanol Kanamycin H2O 1g 20ml 1g 20ml Kanamycin (50mg/ml) Môi trường Thành phần Nồng độ LB lỏng Bacto-tryptone NaCl Yeast extract 10 g/l 10 g/l g/l LB đặc Bacto-tryptone NaCl Yeast extract Agar 10 g/l 10 g/l g/l 15g/l Oxford Columbia Blood Agar Base Aesculin Ferric ammonium citrate Lithium chloride Cycloheximide Colistin sulphate Acriflavine Cefotetan Fosfomycin 39.0g/l 1.0g/l 0.5g/l 15.0g/l 200.0 mg/l 10.0 mg/l 2.5 mg/l 1.0 mg/l 5.0 mg/l LEB Trypton Soyaton Glucose NaCl K2HPO4 Cao men Acryflavine Nalidixic acid 17 g/l g/l 2,5 g/l g/l 2,5 g/l g/l 0,01 g/l 0,04 g/l Cycloheximide 0,05 g/l 2xTY Bacto tryptone Bacto yeast extract NaCl 16 g/l 10 g/l g/l TYE Bacto-agar NaCl tryptone Yeast extract 15 g/l g/l 10 g/l g/l Phô lôc 7: Đệm dung dịch Đệm Tên Thành phần Nồng độ PBS (10X) NaCl KCl Na2HPO4.7H2O KH2PO4 80.0 g/l 2.0 g/l 27.2 g/l 2.4 g/l §Ưm Citrate (10X) Sodium citrate hydrate Citric acid x H2O 26,84 g/l 1,828 g/l Tên Thành phần Nồng độ Dung dịch I Tris-HCl pH 8,0 EDTA pH 8,0 Glucose 25mM 10mM 50mM Dung dÞch II NaOH SDS 0,2N 1% Dung dÞch III CH3COOK CH3COOH ®Ëm ®Ỉc N­íc cÊt 60ml 5M 115ml 28,5 ml CaCl2 CaCl2 100mM PEG/NaCl Polyethylene glycol 8000 NaCl 20% 2,5 mol/l MPBS Skimmed milk PBS 2% 1X Dung dÞch TPBS Tween 20 PBS 0,05% 1X Triethylamine Triethylamine TMB stock TMB DMSO 10mg 1ml Dung dÞch nhuém TMB Citrate buffer TMB stock H2O2 30% H2 O 1ml 100ml 1ml 9ml ... sỹ khoa học Nghiên cứu tách dòng kháng thể gắn ®Ỉc hiƯu víi Listeria monocytogenes b»ng kü tht phage display? ?? mong muốn góp phần nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng gắn đặc hiệu với L monocytogenes. .. công kỹ thuật nằm kháng thể gắn đặc hiệu với L monocytogenes Để tạo kháng thể có nhiều phương pháp, nhiên phage display kỹ thuật hiệu để chọn lọc kháng thể tái tổ hợp từ thư viện kháng thể Đề... HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG KHÁNG THỂ GẮN ĐẶC HIỆU VỚI LISTERIA MONOCYTOGENES BẰNG KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN XUÂN HƯNG