Enhancing the quality of fresh snakehead fish fillets through improved handling and storage

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG TRẦN VĂN TUẤN KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ ĐỊNH DANH TẢO PHỤ SINH (Epiphytic algae) TRÊN RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) NI TRỒNG TẠI KHÁNH HỊA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƢỜNG TRẦN VĂN TUẤN KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VÀ ĐỊNH DANH TẢO PHỤ SINH (Epiphytic algae) TRÊN RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) NI TRỒNG TẠI KHÁNH HỊA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Mã số học viên: 58DT12 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ- ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập hội đồng: 464/QĐ- ĐHNT ngày 14/5/2020 Ngày bảo vệ: 25/5/2020 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đặng Thuý Bình ThS Khúc Thị An Chủ tịch Hội Đồng: PGS TS Nguyễn Văn Duy Phịng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HỊA – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm định danh tảo phụ sinh (Epiphytic algae) rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ni trồng Khánh Hịa” cơng trình nghiên cứu cá nhân tôi, chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Kết phần đề tài cấp “Nghiên cứu tảo phụ sinh (Epiphyte algae) rong sụn (Kappaphycus alvarezil) nuôi trồng Khánh Hòa Ninh Thuận” Ths Khúc Thị An làm chủ nhiệm đề tài (mã số B2016-TSN-01) Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày 23 tháng 03 năm 2020 Tác giả luận văn Trần Văn Tuấn iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm on thầy cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Truờng Đ i học Nha Trang giảng d y t o điều kiện thuận lợi cho viẹc thực hiẹn lu n van Tôi đ c biẹt cảm on TS Đặng Thuý Bình ThS Khúc Thị An t n tình huớng dẫn, bảo để tơi c thể hồn thành lu n van cao học Tơi xin cảm ơn Quý thầy cô cán viên chức Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học Môi trường, Trường Đ i học Nha Trang t o điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn b n học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trường Đ i học Nha Trang thành viên đề tài “Nghiên cứu tảo phụ sinh (Epiphyte algae) rong sụn (Kappaphycus alvarezil) ni trồng t i Khánh Hịa Ninh Thuận ” Ths Khúc Thị An làm chủ nhiệm đề tài (mã số B2016-TSN-01) nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt trình tiến hành thực nghiệm Đặc biệt cảm ơn em Trương Thị Oanh Nguyễn Quang Sáng tận tình giúp đỡ tơi q trình thực nghiên cứu đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu đồng nghiệp Trường THCS & THPT Đ Sar_tỉnh Lâm Đồng nơi công tác t o điều kiện ủng hộ vượt qua kh khăn trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, b n bè, anh chị, … yêu thương, động viên ủng hộ vượt qua kh khăn trình học tập thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn Khánh Hòa, ngày 23 tháng 03 năm 2020 Tác giả luận văn Trần Văn Tuấn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học rong sụn Kappaphycus alvarezii 1.1.1 Hệ thống phân lo i 1.1.2 Đặc điểm hình thái rong sụn 1.1.3 Đặc điểm sinh sản rong sụn 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng rong sụn 1.1.5.1 Độ mặn 1.1.5.2 Dịng chảy lưu thơng 1.1.5.3 Nhiệt độ 1.1.5.4 Cường độ ánh sáng 1.1.5.5 Dinh dưỡng 1.2 Tổng quan epiphyte 1.2.1 Khái quát epiphyte 1.2.2 Phân lo i epiphyte 1.2.3 Ảnh hưởng epiphyte lên rong sụn 1.2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh epiphyte nước 10 1.2.4.1 Chỉ thị phân tử rbcL DNA lục l p 10 1.2.4.2 Các nghiên cứu epiphyte nước 11 v 1.2.4.3 Các nghiên cứu epiphyte nước 13 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Thời gian địa điểm 14 2.2 Đối tượng nghiên cứu 14 2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu 14 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Thu mẫu địa điểm nghiên cứu 15 2.4.2 Khảo sát tình hình nhiễm xác định epipyle algae (tảo phụ sinh) rong sụn 16 2.4.2.1 Xác định d ng epiphyte rong sụn 16 2.4.2.2 Xác định mật độ epiphyte mẫu rong sụn 16 2.4.3 Định lo i epiphyte phương pháp hình thái di truyền 16 2.4.3.1 Định lo i piphyte đặc điểm hình thái 16 2.4.3.2 Định lo i epiphyte phương pháp sinh học phân tử 17 2.4.3.3 Kiểm chứng phân lo i xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng lo i 18 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Các d ng tảo phụ sinh triệu chứng 21 3.2 Định lo i Epiphyte dựa đặc điểm hình thái di truyền 24 3.2.1 Định lo i dựa đặc điểm hình thái 24 3.2.2 Kiểm chứng định lo i epiphyte phương pháp sinh học phân tử 26 3.2.2.1 Tách chiết DNA khuếch đ i gen rbcL DNA lục l p 26 3.2.2.2 Kiểm chứng định lo i thị phân tử 27 3.3 Khảo sát mối quan hệ phát sinh loài Melanothamnus thailandicus 27 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 29 Kết luận 29 Khuyến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC I vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt DW Cs PCR Viết đầy đủ Dry Weight Cộng Polymerase Chain Reaction vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.2 Thông tin trình tự, địa điểm thu mẫu mã số genbank loài epiphyte 19 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Rong sụn ni trồng phương pháp cột dây treo bề mặt t i vịnh Vân Phong, Khánh Hoà Hình 1.2 Vịng đời rong sụn Kappaphycus alvarezii Hình 1.3 Sơ đồ khái quát thuật ngữ d ng epiphyte Hình 1.4 “Goose bumps” nhiễm Neosiphonia apiculata tản rong Kappaphycus Hình 1.5 Cấu t o lục l p 10 Hình 1.6 Bộ gen lục l p loài Arabidopsis thaliana (Họ Cải) 11 Hình 1.7 Các mẫu bị nhiễm epiphytes 12 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14 Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu rong sụn nhiễm epiphyte t i Khánh Hòa 15 Hình 3.1 Rong sụn bị nhiễm epiphyte d ng sợi bám (mũi tên) 21 Hình 3.2 Rong sụn bị nhiễm true epiphyte (D ng u lồi) 22 Hình 3.3 Mật độ trung bình true epiphyte theo tháng năm 2017 2018 t i Vân Phong 23 Hình 3.4 Hình thái ngồi Melanothamnus thailandicus 24 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái Ceramium clarionense 25 Hình 3.6 Hình ảnh điện di DNA tống số sản phẩm khuếch đ i gen rbcL loài Melanothamnus thailandicus 26 Hình 3.7 Vị trí khác biệt Nucleotide 27 Hình 3.8 Cây phát sinh lồi 28 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Doty) sinh trưởng tự nhiên vùng biển Châu Á Thái Bình Dương, vùng Đơng Nam Á Trong năn gần đây, nghề nuôi rong sụn phát triển m nh g p phần x a đ i, giảm ngèo Epiphyte diện thường xuyên thành phần quan trọng hệ sinh thái biển Tuy nhiên, bệnh epiphyte gây ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng rong sụn, bệnh trắng nhũn thân (ice-ice disease) Cho đến nay, nghiên cứu bệnh epiphyte h n chế Trong thập kỷ gần đây, thị phân tử sử dụng rộng rãi phân lo i thực vật, đ , thị Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) DNA lục l p chứng tỏ công cụ hữu hiệu định lo i khảo sát mối quan hệ phát sinh loài Mục tiêu nghiên cứu đề tài nhằm khảo sát tình hình nhiễm, định lo i khảo sát mối quan hệ phát sinh loài epiphyhte phụ sinh rong sụn ni trồng t i Khánh hồ (Vịnh Cam Ranh Vân Phong) dựa đặc điểm hình thái di truyền Các phương pháp thực bao gồm: khảo sát d ng triệu chứng nhiễm epiphyte, xác định mật độ epiphyte rong sụn; định lo i đặc điểm hình thái; kiểm chứng định lo i epiphyte khảo sát mối quan hệ phát sinh loài dựa thị phân tử rbcL DNA lục l p Kết bước đầu cho thấy bệnh epiphyte xuất vào khoảng thời gian từ tháng đến tháng năm Epipyhte c d ng ký sinh rong sụn, gồm: d ng sợi bám d ng sợi xâm lấn d ng u lồi (Melanothamnus thailandicus) Trong đ , M thailandicus loài ghi nhận Việt Nam song sụn Mật độ rong sụn nhiễm epiphyte tăng từ tháng đến tháng 8, c khác biệt c ý nghĩa thống kê tháng tháng 8, mật độ nhiễm epiphyte năm 2017 2018 Trình tự rbcL epiphyte thể tương đồng cao (99.98%) với loài M thailandicus phân bố Thái Lan Cây phát sinh loài cho thấy M thailandicus Khánh Hòa Thái Lan xếp nhánh, với loài thuộc giống Melanothamnus t o thành nhánh đồng d ng x Hình 3.8: Cây phát sinh lồi (phƣơng pháp NJ, phần mềm Mega)) loài Melanothamnus (tên đồng danh Neosiphonica theo liệu Genbank) Giá trị tin cậy (Boostraps) đƣợc biểu nhánh Hình chữ nhật loài nghiên cứu Tên đƣợc cập nhật đƣợc ghi theo (Díaz-tapia et al., 2017) Theo Muangmai et al (2014), M thailandicus c quan hệ gần gũi với loài Neosiphonia sphaerocarpa Polysiphonia forfex Díaz-tapia et al (2017) xếp lồi vào giống Melanothamnus Giống Melanothamnus (gồm 46 loài) đặc trưng đỉnh sinh trưởng c tế bào Nguồn gốc tiến h a giống Melanothamnus ước tính 75,7 - 95,78 triệu năm trước Mặc dù phát sinh kỷ Phấn trắng, Melanothamnus giống chủ yếu Ấn Độ-Thái Bình Dương vắng mặt giống phía đơng bắc Đ i Tây Dương chưa thể giải thích 28 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận Kết khảo sát cho thấy c d ng tảo phụ sinh (Epiphyte) rong sụn: D ng u lồi, d ng sợi xâm lấn d ng sợi bám với triệu chứng bệnh đặc trưng T i địa điểm nuôi rong sụn t i Vân Phong, V n Ninh, bệnh epiphyte xuất vào khoảng thời gian từ tháng đến tháng hàng năm Mật độ nhiễm epiphyte tăng dần từ tháng đến tháng Mật độ nhiễm tháng c khác biệt c ý nghĩa với tháng Mật độ epiphyte năm 2018 cao khác biệt c ý nghĩa với năm 2017 Kết định danh dựa đặc điểm hình thái, định lo i loài epiphyte rong sụn: Epiphyte bám (1 loài): Ceramium clarionense True epiphyte (1 loài): Melanothamnus thailandicus Kết định danh phương pháp sinh học phân tử khảo sát mối quan hệ tiến h a kiểm chứng định lo i vị trí phân lo i lồi Melanothamnus thailandicus Khuyến nghị Cần c nghiên cứu sâu hơn, rõ ràng điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ mặn nước biển, tốc độ gi , hàm lượng dinh dưỡng nước biển, …) ảnh hưởng đến mật độ epiphyte rong sụn tỉnh Khánh Hoà nước ta Định danh phương pháp sinh học phân tử tiếp loài định danh hình thái (Ceramium clarionense) 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Huy Chích, Đỗ Văn Ninh, Vũ Ngọc Bội (2014) Đánh giá hiệu sử dụng enzyme Viscozyme L thay hoá chất sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappapycus alvarezii (Doty) Doty T p chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 4/2014 Nguyễn Nguyên Chiến (2006) Khảo sát tình hình ni rong sụn Kappaphycus alvarezii t i Khánh hịa tiến hành nuôi thực nghiệm điều kiện khác Luận văn Đ i học Nông Lâm TPHCM Nguyễn Hữu Dinh (1995 – 1996) Khảo nghiệm nuôi trồng rong sụn Khánh Hòa, 23p Trần Mai Đức, Trần Quang Thái, Nguyễn Bách Khoa, Đỗ Kim Tâm (2012) Mơ hình ni trồng rong sụn (Kappaphycus alvarezii) lồng treo giàn phao Kỷ yếu hội nghị quốc tế biển Đông 2012, Tập 1, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Quốc gia Lê Mai Hương, Trần Thị Hồ Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Mai Đức, Huỳnh Hoàng Như Khánh, Đặng Diễm Hồng (2010) Sử dụng chủng vi khuẩn phân lập rong sụn (Kappaphycus alvarezii) bị bệnh để thử nghiệm lây nhiễm bệnh ice – ice thực nghiệm rong khỏe m nh, T p chí Khoa học Cơng Nghệ, tập 48, số 4A, tr 257-264 Ph m Thị Mai 2019 Nghiên cứu nhân giống rong sụn (Kappaphycus alvarezii) phương pháp ni cấy mơ T p chí Nơng nghiệp phát triển Nông thôn Huỳnh Quang Năng Nguyễn Hữu Dinh (1999) Kết nghiên cứu trồng rong sụn - Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty vào vùng biển Việt Nam, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Biển tồn quốc lần thứ IV tập II, tr 942-947 Huỳnh Quang Năng (2005) Trồng rong biển g p phần phát triển kinh tế cải thiện môi trường thủy vực biển, Kỷ yếu Hội thảo Tồn quốc Bảo vệ mơi trường thủy vực biển, Kỷ yếu Hội thảo Tồn quốc Bảo vệ mơi trường Nguồn lợi thủy sản: 226-232 30 Lê Văn Sanh (2016) Nghiên cứu số điều kiện tự nhiên ảnh hưởng đến hình thành phát triển rong tảo phụ sinh (epiphyte algae) rong sụn (kappaphycus alvarezii Đồ án tốt nghiệp đ i học Nha Trang 10 Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật T p chí sinh học 2014, 36(3): 265-294 DOI: 10.15625/08667160/v36n3.5974 11 Ngô Thị Thu Thảo, Huỳnh Hàn Châu Trần Ngọc Hải 2010 Ảnh hưởng việc nuôi kết hợp mật độ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) với tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) T p chí Khoa học, Trường Đ i học Cần Thơ 6a 100-110 12 Phùng Thế Trung (2004) Tìm hiểu kỹ thuật ni trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii t i Khánh Hòa Đề tài tốt nghiệp đ i học, trường Đ i học Thủy sản Tài liệu tiếng Anh 13 An K.T, Cầm V.C (2015) Callus induction of kappaphycus alvarezii collected from khanh hoa province by tissue culture Journal of Fisheries science and Technology Special issue – 2015 14 Azanza R.V., Ask E (2017), Reproductive Biology and Eco-physiology of Farmed Kappaphycus and Eucheuma Tropical Seaweed Farming Trends, Problems and Opportunities, 45–53 doi:10.1007/978-3-319-63498-2_3 15 Baldock (2012), “Algae Revealed” Australian State Herbarium: Master key to the Filamentous Red Algae 16 Borlongan I.A.G., Luhan M.R.J., Padilla P.I.P., Hurtado A (2016), Photosynthetic responses of „Neosiphonia sp epiphyte-infected‟ and healthy Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta) to irradiance, salinity and pH variations Journal of Applied Phycology, 28(5), 2891-2902 https://doi.org/10.1007/s10811-016-0833-4 17 Choi H.G., Kim M.S., Guiry M.D and Saunders G.W (2001), Phylogenetic relationships of Polysiphonia (Rhodomelaceae, Rhodophyta) and its relatives based on anatomical and nuclear small-subunit rDNA sequence data Can J Bot 79: 1465–1476 18 Díaz-tapia P., Mcivor L., Freshwater D.W., Verbruggen H., Wynne M.J., Maggs C.A., Gray V.S.F (2017), The genera Melanothamnus Bornet & Falkenberg and Vertebrata S F Gray constitute well-defined clades of the red algal tribe 31 Polysiphonieae Eur J Phycol 52, 1–30 https://doi.org/10.1080/09670262.2016.1256436 19 Fletcher R.L (1995), Epiphytism and fouling in Gracilaria cultivation: an overview J Appl Phycol 7: 325–333 20 Hall T.A (1999), BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows95/98/NT Nucleic Acids Symp Ser 41, 95–98 21 Hanyuda T., Suzawa Y., Suzawa T., Arai S., Sato H., Ueda K and Kumano S (2004), Biogeography and taxonomy of Batrachospermum helminthosum (Batrachospermales, Rhodophyta) in Japan inferred from rbcL gene sequences J Phycol 40: 581–588 22 Hurtado A.Q., Biter A.B (2007), Plantlet regeneration of Kappaphycus alvarezii var adik-adik by tissue culture J Appl Phycol 19(6): 783-786 23 Hurtado A.Q., Critchley A.T (2006), Epiphytes In: A.T (2006), Epiphytes In: A.T Critchley, M Ohno and D.B Largo (eds) World Seaweed Resources – An Authoritative Reference System ISBN 9075000804, ETI Information Services, UK DVD-ROM 24 Hurtado A.Q., Critchley A.T., Trespoey A., Lhonneur G.B (2006), Occurrence of Polysiphonia epiphytes in Kappaphycus farms at Calaguas Is., Camarines Norte, Philippines In: Anderson R., Brodie J., Onsoyen E., Critchley A (eds) Eighteenth International Seaweed Symposium Springer Netherlands, pp 75-80 25 Kim M.S (2003), Taxonomic reassessment of the genus Polysiphonia (Rhodomelaceae, Rhodophyta): morphology and reproduction of Neosiphonia decumbens and N harlandii Algae 18: 107–119 26 Kim M.S (2005), Taxonomy of a poorly documented alga, Neosiphonia savatieri (Rhodomelaceae, Rhodophyta) from Korea Nova Hedwigia 81: 163–175 27 Kim M.S and Lee I.K (1999), Neosiphonia flavimarina gen et sp nov with a taxonomic reassessment of the genus Polysiphonia (Rhodomelaceae, Rhodophyta) Phycol Res 47: 271–281 28 Kim M.S., Lim P.E and Phang S.M (2008), Taxonomic notes on Malaysian Neosiphonia and Polysiphonia (Rhodomelaceae, Rhodophyta) In: (S.M Phang, K Lewmanmont and P.E Lim, eds.) Taxonomy of Southeast Asian seaweeds nstitute of Ocean and Earth Sciences University of Malaya Kuala Lumpar Monograph Series Volume pp 33–44 32 29 Mamoozadeh N.R and Freshwater D.W (2011), Taxonomic notes on Caribbean Neosiphonia and Polysiphonia (Ceramiales, Florideophyceae): five species from Florida, USA and Mexico Bot Mar 54: 269–292 30 Masuda M., Abe T., Kawaguchi S and Phang S.M (2001), Taxonomic notes on marine algae from Malaysia VI Five species of Ceramiales (Rhodophyceae) Bota-nica Marina, 44: 467-477 31 Muangmai N., Maneekat S., Petsut, Keawsuralikhit C (2012), Newly reported marine red alga, Neosiphonia savatieri ( Hariot) M.S Kim et I.K.Lee 1999 (Rhodophyta Rhodomelaceae) from Thailand Biodiversity Journal, (3):247-250 32 Muangmai N., Yamagishi Y., Maneekat S., Kaewsuralikhit C., (2014), The new species Neosiphonia thailandica sp nov ( Rhodomelaceae , Rhodophyta ) from the Gulf of Thailand Bot Mar 57, 459–467 https://doi.org/10.1515/bot-2014-0042 33 Moz J., Freile-Pelegrín Y and Robledo D (2004), Mariculture of Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) color strains in tropical waters of Yucatán, México Aquaculture, 239: 161-177 34 Ohno M., Nang H.Q and Hirase S (1996), Cultivation and Carrageenan yield and quality of Kappaphycus alvarezii in the waters of Vietnam Journal of Applied Phycology, 8: 431-437 35 Pang T., Liu J., Liu Q., Lin W (2011), Changes of photosynthetic behaviors in Kappaphycus alvarezii infected by epiphyte Evidence-babed complementary and llternative medicine: eCAM2011: 658906 36 Stuercke B and Freshwater D.W (2008), Consistency of morphological characters used to delimit Polysiphonia sensu lato species (Ceramiales, Florideophyceae): Analyses of North Carolina, USA specimens Phycologia 47: 541–559 37 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S (2013), MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 Mol Biol Evol 30, 2725– 2729 https://doi.org/10.1093/molbev/mst197 38 Trono C (1999), Seaweeds, in: Carpenter, K.E and Niem, V.H (Ed.), The Living Marine Resources of the Western Central Pacific, Vol FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes FAO, Rome, pp 19–99 39 Vairappan C.S (2006), Seasonal Occurrences of Epiphytic Algae on the Commercially Cultivated Red Alga Kappaphycus Alvarezii (Solieriaceae, 33 Gigartinales, Rhodophyta) Journal of Applied Phycology, 18(3-5), 611–617 doi:10.1007/s10811-006-9062-6 40 Vairappan C., Chung C., Hurtado A.Q., Soya F., Lhonneur G., Critchley A (2009), Distribution and symptoms of epiphyte jotun K., Notoya M (eds) Nieteenth International Seaweed Symposium Springer Nether Netherlands, pp 27-33 41 Vairappan C., Chung C., Matsunaga S (2014), Effect of epiphyte infection on physical and chemical properties of carrageenan produced by Kappaphycus alvarezii Doty J Appl Phycol 26(2): 923-931 42 Tsiresy G., Preux J., Lavitra T., Dubois P., Lepoint G & Eeckhaut I 2016 Phenology of farmed seaweed Kappaphycus alvarezii infestation by the parasitic epiphyte Polysiphonia sp in Madagascar J Appl Phycol 28(5): 2903 2914 doi: 10.1007/s10811-016-0813-8 34 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các bƣớc tiến hành tách chiết kiểm tra DNA tổng số Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cân 0,6 g agarose cho vào 40mL đệm TBE 1X chứa bình tam giác 100 mL, đun sơi lị vi s ng gel tan hồn toàn Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 70°C chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai Thêm μL Ethidium bromide, lắc nhẹ tránh t o bọt trộn Ethidium bromide vào gel (h a chất độc h i cần tuyệt đối cẩn thận thao tác) Đổ gel khuôn lắp sẵn lược (lược 10 giếng 15 giếng) Khi gel nguội hồn tồn đơng cứng l i, rút nhẹ lược theo phương thẳng đứng để tránh rách giếng Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di thêm đệm TBE 1X ngập gel Dùng micropipette trộn μL mẫu với μL loading dye 6X, tra vào giếng gel Hút μL DNA Ladder (thang DNA) vào giếng Tiến hành ch y điện di với nguồn điện 90V, 500mA 20 phút Đọc kết quả: Sau ch y xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator xem band DNA tổng số tia cực tím I Phụ lục 2: Mật độ nhiễm true epiphyte Vân Phong năm 2017 2018 Số lượng epi/cm2 năm 2017 Stt Số lượng epi/cm2 năm 2018 Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng Tháng 1 1 0 1 1 1 3 2 0 0 1 1 0 2 0 2 10 1 2 11 0 0 12 1 2 13 0 14 1 15 2 16 1 0 17 0 1 18 0 0 19 1 20 0 21 1 2 22 2 23 0 24 2 25 0 26 0 II 27 2 28 0 0 0 29 30 0 31 0 0 32 0 1 33 3 3 34 1 35 0 36 2 37 1 1 38 1 2 39 0 40 1 2 41 0 1 42 1 1 43 0 0 44 1 45 2 46 2 2 47 0 1 48 0 0 49 2 50 1 1 Giá trị trung bình: 0.64 0.68 1.06 0.94 1.04 1.4 III Phụ lục Kết xử lý thống kê mật độ nhiễm epiphyte năm 2017 Kết xử lý thống kê mật độ nhiễm epiphyte năm 2018 Kết xử lý thống kê mật độ nhiễm epiphyte năm 2017 2018 IV V Phụ lục 4: Chiều dài epiphyte Stt D ng u lồi (cm) D ng bám (cm) 10 0.5 1.6 1.5 1.8 1.7 1.7 1.8 0.5 0.9 0.6 0.8 0.5 0.3 0.6 0.5 0.6 0.8 0.9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1.7 1.4 1.6 1.3 1.1 1.5 1.8 1.9 1.8 0.7 0.4 0.6 0.3 0.9 0.5 0.8 0.9 0.3 0.5 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Giá trị TB= 1.5 1.6 1.9 1.9 1.5 1.4 1.1 1.3 1.6 1.5 0.6 0.6 0.9 0.6 0.7 0.4 0.3 0.8 0.6 0.63 Độ lệch chuẩn 0.39 0.20 VI Phụ lục 5: Dóng hàng trình tự lồi Melanothamnus thailandica trình tự lồi genbank Màu đỏ (in đậm) vị trí Nucleotide khác biệt 15 25 35 45 55 M.thailandicus TGAGGACCTT CTGCTACATA GTCACGACCT TCATTACGTG CAATTACCAT TGATTCTAAT M.thKM502785 TGAGGACCTT CTGCTACATA GTCACGACCT TCATTACGTG CAATTACCAT TGATTCTAAT M.thKM502787 TGAGGACCTT CTGCTACATA GTCACGACCT TCATTACGTG CAATTACCAT TGATTCTAAT M.thKM502786 TGAGGACCTT CTGCTACATA GTCACGACCT TCATTACGTG CAATTACCAT TGATTCTAAT 65 75 85 95 105 115 M.thailandicus GCTACACGAT TAGCTGTTGC TCCTGCTTGG ATACCATCTG GATGTCCGAT AGTACCTCCA M.thKM502785 GCTACACGAT TAGCTGTTGC TCCTGCTTGG ATACCATCTG GATGTCCGAT AGTACCTCCA M.thKM502787 GCTACACGAT TAGCTGTTGC TCCTGCTTGG ATACCATCTG GATGTCCGAT AGTACCTCCA M.thKM502786 GCTACACGAT TAGCTGTTGC TCCTGCTTGG ATACCATCTG GATGTCCGAT AGTACCTCCA 125 135 165 175 M.thailandicus CCAAATTGAA GAACTACATC ATTTCCTAGG TAGTCTAGTA ATTGATGCAT CTGACCACAG M.thKM502785 CCAAATTGAA GAACTACATC ATTTCCTAGG TAGTCTAGTA ATTGATGCAT CTGACCACAG M.thKM502787 CCAAATTGAA GAACTACATC ATTTCCTAGG TAGTCTAGTA ATTGATGCAT CTGACCACAG M.thKM502786 CCAAATTGAA GAACTACATC ATTTCCTAGG TAGTCTAGTA ATTGATGCAT CTGACCACAG 215 225 235 M.thailandicus TGTATACCAC CTGAAGCTAC TGGTGCTACT TTACGTAAAG ATGCCCAATC TTGTTGGAAG M.thKM502785 TGTATACCAC CTGAAGCTAC TGGTGCTACT TTACGTAAAG ATGCCCAATC TTGTTGGAAG M.thKM502787 TGTATACCAC CTGAAGCTAC TGGTGCTACT TTACGTAAAG ATGCCCAATC TTGTTGGAAG M.thKM502786 TGTATACCAC CTGAAGCTAC TGGTGCTACT TTACGTAAAG ATGCCCAATC TTGTTGGAAG 285 295 M.thailandicus AAGATACCTT GCGGAAGGTT GATATCTAGA TATGGTTCAA GTAAAGTATT ATAGAAGCCT M.thKM502785 AAGATACCTT GCGGAAGGTT GATATCTAGA TATGGTTCAA GTAAAGTATT ATAGAAGCCT M.thKM502787 AAGATACCTT GCGGAAGGTT GATATCTAGA TATGGTTCAA GTAAAGTATT ATAGAAGCCT M.thKM502786 AAGATACCTT GCGGAAGGTT GATATCTAGA TATGGTTCAA GTAAAGTATT ATAGAAGCCT 345 355 185 245 305 145 195 205 255 265 315 325 155 275 335 M.thailandicus TTGATCATTA AAGGATCACC TTCTAGCTTA CCTACTACGG TACCCGCATG GATGTGATCT M.thKM502785 TTGATCATTA AAGGATCACC TTCTAGCTTA CCTACTACGG TACCCGCATG GATGTGATCT M.thKM502787 TTGATCATTA AAGGATCACC TTCTAGCTTA CCTACTACGG TACCCGCATG GATGTGATCT M.thKM502786 TTGATCATTA AAGGATCACC TTCTAGCTTA CCTACTACGG TACCCGCATG GATGTGATCT 405 415 365 375 385 395 M.thailandicus ACTCCTGCCA TTCTCATCCA TTTGCATATA ACTCTAAAGT TCATGCCGTG AATTTTTTGG M.thKM502785 ACTCCTGCCA TTCTCATCCA TTTGCATATA ACTCTAAAGT TCATGCCGTG AATTTTTTGG M.thKM502787 ACTCCTGCCA TTCTCATCCA TTTGCATATA ACTCTAAAGT TCATGCCGTG AATTTTTTGG M.thKM502786 ACTCCTGCCA TTCTCATCCA TTTGCATATA ACTCTAAAGT TCATGCCGTG AATTTTTTGG 425 435 445 455 465 475 M.thailandicus CGAGAATATG TTGAGTTACC TGCACGGTGT AAATGAAGGA TCATGTCATT TTTGCGAGCC M.thKM502785 CGAGAATATG TTGAGTTACC TGCACGGTGT AAATGAAGGA TCATGTCATT TTTGCGAGCC M.thKM502787 CGAGAATATG TTGAGTTACC TGCACGGTGT AAATGAAGGA TCATGTCATT TTTGCGAGCC M.thKM502786 CGAGAATATG TTGAGTTACC TGCACGGTGT AAATGAAGGA TCATGTCATT TTTGCGAGCC 485 495 505 515 525 535 M.thailandicus CAGATAGCCA TTGTTTGAAT TGCAGTATAA CCAATTACTA AA-TCGATCA TAATAATGAT M.thKM502785 CAGATAGCCA TTGTTTGAAT TGCAGTATAA CCAATTACTA AA-TCGATCA TAACAATGAT M.thKM502787 CAGATAGCCA TTGTTTGAAT TGCAGTATAA CCAATTACTA AA-TCGATCA TAACAATGAT M.thKM502786 CAGATAGCCA TTGTTTGAAT TGCAGTATAA CCAATTACTA AA-TCGATCA TAACAATGAT 545 M.thailandicus TGATCCAATT 555 TGCTTCGCAA 565 ATTCAGCTCT VII 575 TTCATACATA 585 TCTTCCATAG 595 TTGCAGCTGT M.thKM502785 TGATCCAATT TGCTTCGCAA ATTCAGCTCT TTCATACATA TCTTCCATAG TTGCAGCTGT M.thKM502787 TGATCCAATT TGCTTCGCAA ATTCAGCTCT TTCATACATA TCTTCCATAG TTGCAGCTGT M.thKM502786 TGATCCAATT TGCTTCGCAA ATTCAGCTCT TTCATACATA TCTTCCATAG TTGCAGCTGT 635 645 M.thailandicus AATGTTCATA TAATGACCCT TTACTTCTCC AGTTGAGGCA ATTGAACGAT TAACTGCTTC M.thKM502785 AATGTTCATA TAATGACCCT TTACTTCTCC AGTTGAGGCA ATTGAACGAT TAACTGCTTC M.thKM502787 AATGTTCATA TAATGACCCT TTACTTCTCC AGTTGAGGCA ATTGAACGAT TAACTGCTTC M.thKM502786 AATGTTCATA TAATGACCCT TTACTTCTCC AGTTGAGGCA ATTGAACGAT TAACTGCTTC 695 705 M.thailandicus CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAGCG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502785 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502787 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC M.thKM502786 CATAGAATAT AGAAATCTTT CTTTCCAACG CATAAAAGGC TGCGAATTAA TGTTTTCATC 755 765 605 665 725 615 625 675 685 735 745 655 715 775 M.thailandicus ATCTTTTAGA AAATCCAATC CGCCTTTTAA ACCTTCGTAA ACAACTCTTC CGTAGTTTTT M.thKM502785 ATCTTTTAGA AAATCCAATC CGCCTTTTAA ACCTTCGTAA ACAACTCTTC CGTAGTTTTT M.thKM502787 ATCTTTTAGA AAATCCAATC CGCCTTTTAA ACCTTCGTAA ACAACTCTTC CGTAGTTTTT M.thKM502786 ATCTTTTAGA AAATCCAATC CGCCTTTTAA ACCTTCGTAA ACAACTCTTC CGTAGTTTTT 785 795 805 815 825 835 M.thailandicus ACCAGAAAGA CCTAATTTTG GTTTAACAGT CGCACCTAAG AATGGACGAC CGAATTTATC M.thKM502785 ACCAGAAAGA CCTAATTTTG GTTTAACAGT CGCACCTAAG AATGGACGAC CGAATTTATC M.thKM502787 ACCAGAAAGA CCTAATTTTG GTTTAACAGT CGCACCTAAG AATGGACGAC CGAATTTATC M.thKM502786 ACCAGAAAGA CCTAATTTTG GTTTAACAGT CGCACCTAAG AATGGACGAC CGAATTTATC 875 885 895 845 855 865 M.thailandicus CATACGTTCA CGTTCTACAA CAATTCCTGT TGCAGGTCCT TGGAAAGTTT TAAGATAAGC M.thKM502785 CATACGTTCA CGTTCTACAA CAATTCCTGT TGCAGGTCCT TGGAAAGTTT TAAGATAAGC M.thKM502787 CATACGTTCA CGTTCTACAA CAATTCCTGT TGCAGGTCCT TGGAAAGTTT TAAGATAAGC M.thKM502786 CATACGTTCA CGTTCTACAA CAATTCCTGT TGCAGGTCCT TGGAAAGTTT TAAGATAAGC 945 955 905 915 925 935 M.thailandica TACAGGTAGA CGCATATCTT CTAGTCTTAA AGCTTTTACT GCTTTAAATC CAAATACGTT M.thKM502785 TACAGGTAGA CGCATATCTT CTAGTCTTAA AGCTTTTACT GCTTTAAATC CAAATACGTT M.thKM502787 TACAGGTAGA CGCATATCTT CTAGTCTTAA AGCTTTTACT GCTTTAAATC CAAATACGTT M.thKM502786 TACAGGTAGA CGCATATCTT CTAGTCTTAA AGCTTTTACT GCTTTAAATC CAAATACGTT 965 975 985 995 1005 1015 M.thailandicus ACCAATAATT GAAGCTGTTA AATTTGCAAT AGAGCCTTCT TCAAATAGAT CAATATCATA M.thKM502785 ACCAATAATT GAAGCTGTTA AATTTGCAAT AGAGCCTTCT TCAAATAGAT CAATATCATA M.thKM502787 ACCAATAATT GAAGCTGTTA AATTTGCAAT AGAGCCTTCT TCAAATAGAT CAATATCATA M.thKM502786 ACCAATAATT GAAGCTGTTA AATTTGCAAT AGAGCCTTCT TCAAATAGAT CAATATCATA 1025 1035 1045 1055 M.thailandicus TGCAATATAA GCAAAATATT GATCAGAAGT ATTAGGTACA GCATCTACTT TATAAGCTTT M.thKM502785 TGCAATATAA GCAAAATATT GATCAGAAGT ATTAGGTACA GCATCTACTT TATAAGCTTT M.thKM502787 TGCAATATAA GCAAAATATT GATCAGAAGT ATTAGGTACA GCATCTACTT TATAAGCTTT M.thKM502786 TGCAATATAA GCAAAATATT GATCAGAAGT ATTAGGTACA GCATCTACTT TATAAGCTTT M.thailandicus AGCTCTATAA AGATCACAAG CTGTTAGTAG ATCTGTCCAA AC M.thKM502785 AGCTCTATAA AGATCACAAG CTGTTAGTAG ATCTGTCCAA AC M.thKM502787 AGCTCTATAA AGATCACAAG CTGTTAGTAG ATCTGTCCAA AC M.thKM502786 AGCTCTATAA AGATCACAAG CTGTTAGTAG ATCTGTCCAA AC 1085 1095 1105 VIII 1065 1115 1075 ... Springer Netherlands, pp 75-80 25 Kim M.S (2003), Taxonomic reassessment of the genus Polysiphonia (Rhodomelaceae, Rhodophyta): morphology and reproduction of Neosiphonia decumbens and N harlandii... Lewmanmont and P.E Lim, eds.) Taxonomy of Southeast Asian seaweeds nstitute of Ocean and Earth Sciences University of Malaya Kuala Lumpar Monograph Series Volume pp 33–44 32 29 Mamoozadeh N.R and Freshwater... tropical waters of Yucatán, México Aquaculture, 239: 161-177 34 Ohno M., Nang H.Q and Hirase S (1996), Cultivation and Carrageenan yield and quality of Kappaphycus alvarezii in the waters of Vietnam