Nghiên cứu một số tính chất của nấm men phân lập từ hạt kefir​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM MEN PHÂN LẬP TỪ HẠT KEFIR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM MEN PHÂN LẬP TỪ HẠT KEFIR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới cô giáo T – Giảng viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội TS Đàm Thanh Xn, người ln quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ đường học tập, nghiên cứu khoa học Đồng thời, xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh toàn thể thầy, cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tồn thể gia đình, thầy giáo trường tất bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .2 1.1 Lịch sử dùng sản phẩm sữa lên men 1.2 Hạt kefir .3 1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir 1.2.2 Đặc điểm hạt kefir hạt kefir 1.2.3 Tác dụng 1.3 Nấm men 10 1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 10 1.3.2 Ứng dụng nấm men 12 1.3.3 Các công trình nghiên cứu nấm men hạt kefir 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .15 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 15 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 15 2.1.3 Môi trƣờng 15 ụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 16 2.2.2 Khảo sát số đặc tính probiotic 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .17 .17 p 17 18 18 2.3.5 Phƣơng 18 .18 19 .19 2.3.9 Phƣ 20 20 2.3.11 20 21 22 22 2.3.14 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23 23 ấm men từ hạt kefir Hà Lan 23 3.1.3 3.1.4 ều kiện hô hấ 25 ồn 29 ệt độ 3.2 Khảo sát số đặ 3.2.1 Khả .30 .32 ẩn có hại 32 3.2.2 Khả chịu pH acid dày 35 3.2.3 Khả cộng sinh với vi khuẩn lactic 36 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lactobacillus L Streptococcus Str Lactococcus Lc Leuconostoc Leuc Kluyveromyces Kl Saccharomyces S Candida C Debaryomyces D Pichia P Issatchenkia I Yarrowia Y Torulaspora T Rhodosporidium R Bacillus B Escherichia E KHV DĐVN MT1 MT2 MT3 Ngân hàng giống tế bào Hoa Kỳ (The American Type Culture Collection) ATCC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các vi sinh vật có hạt kefir Bảng 2.1: Nguyên liệu, hóa chất 15 16 Bảng 2.2: Bảng 3.1: Ảnh hƣởng điều kiện hô hấp đến tăng sinh khối 26 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng hô hấp đến khả tiêu thụ đƣờng 26 Bảng 3.3: So sánh khả sinh ethanol nấm men kefir với S cerevisiae tron 28 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến tăng sinh khố 30 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng nấm men kefir 31 Bảng 3.4: Bảng 3.5: 32 B subtilis kefir kefir Bảng 3.10: 34 36 37 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang 1.1: H - 24 h 3.2: 24 24 27 B subtilis B subtilis 34 34 : 35 : 36 2h 36 ĐẶT VẤN ĐỀ s (FAO/WHO) năm 2002 cho sức khỏe củ chủ” [15] t Baccillus S cerevisiae & S boulardii Nghiên cứu kefir c CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử dùng sản phẩm sữa lên men Sữa chất tiết giàu dinh dƣỡng động vật có vú Giá trị dinh dƣỡng tự nhiên sữa đƣợc khuyến khích sử dụng cho ngƣời từ buổi đầu xã hội loài ngƣời Điều lồi động vật đƣợc hóa Các sản phẩm sữa lên men đƣợc đề cập sớm tiếng Phạn cơng trình Kito giáo Ngày nay, vùng Cận Đơng Bắc Phi có nhiều thực phẩm sữa lên men truyền thống, biến thể sữa chua mát [22] Tầm quan trọng sữa chua mát văn hóa ẩm thực Hy Lạp (1.500 năm trƣớc Cơng Ngun) Rome (750 năm trƣớc Công Nguyên) đƣợc nhà nghiên cứu đề cập đến Sự xuất chứng khảo cổ tìm thấy Windmill Hill Dorset, Anh (1.800 năm trƣớc Công Nguyên) cho biết mát đƣợc làm Anh trƣớc có xuất ngƣời La Mã [22] Yogurt sản phẩm sữa chua đƣợc biết đến nhiều sản phẩm phổ biến khắp giới Yogurt có nguồn gốc từ Bungari [13] Ngƣời dân Thracia cổ đại (các cƣ dân sớm vùng đất Bungari) thêm sữa lên men vào sữa tƣơi đun sôi để tạo sản phẩm gọi „prokish‟ hay „kvasenomliako‟ Trong kỉ 11, sữa chua Bungari đƣợc đổi tên thành „yogurt‟ „Yogurt‟ từ có nguồn gốc Thổ Nhĩ Kỳ, đó: „yog‟ nghĩa dày cịn „urt‟ sữa tức sữa dày Ở Tây Âu, yogurt đƣợc đề cập lần Pháp ngƣời bác sĩ Thổ Nhĩ Kỳ chữa khỏi bệnh tiêu chảy cho vua Pháp Francois sữa chua cừu Kể từ đó, yogurt đƣợc sử dụng rộng rãi Tây Âu Nhà sinh vật học tiếng ngƣời Nga Ilya Metchnikoff ngƣời cơng bố tính chất khoa học yogurt [17] Ông cho vi khuẩn yogurt ức chế vi khuẩn gây bệnh không mong muốn ruột ngƣời, tiêu thụ sữa lên men với Lactobacilli giúp kéo dài tuổi thọ [29] Sữa lên men thƣờng phân thành bốn loại: (1) Loại tính acid kiêm rƣợu nhƣ kefir, koumiss (rƣợu sữa ngựa); (2) Loại tính acid cao nhƣ sữa chua Bungari; (3) 33 : (-): không xuất vòng ức chế B subtilis E coli B subtilis E coli Tuy nhiên, ho izobutyric, axit lactic, malic, citric… B subtilis B subtilis [2 Shigella, Salmonella… B subtilis b) Mục đích: Tiến hành: 34 900 B subtilis – ATCC6633 Kết quả: trên B subtilis B subtilis B subtilis D (mm) TB 15,7 15,8 14,9 15,5 9,7 9,5 9,4 9,53 B subtilis C t 35 : 3.2.2 Khả chịu pH acid dày Mụ Tiến hành: - Nhân n kefir MT1, 50 v/p X nh Kết quả: 36 : sau 2h TB 76,9 2,9 79,7 3,2 91,3 4,0 82,6 3,4 y: pH 1,2 -2 L acidophilus [15] n 3.2.3 Khả cộng sinh với vi khuẩn lactic 37 kefir a) K T1 C/20p) C/24h Lƣợng sinh khối (g) % tăng sinh khối Sau 24h 10g Môi Lần Lần Lần TB 10,83 10,71 10,70 10,75 7,5% 9,21 9,00 8,90 9,04 -9,6% g n -7% [28 ] - -9,6% T 38 kefir b) Mụ c Tiến hành: Trong ống nghiệm, ống 5ml sữ - Hạt kefir - Nấm men kefir & L acidophilus ( - S cerevisiae & L acidophilus - L acidophilus ( - Nấm men kefir ( NMk+L.a.) S+L.a.) k) 300C Sau Tất ống nuôi điều kiện kị khí (tủ ấm) 370C trừ 24h, quan sát khả đông tụ sữa, đo pH thị vạn quan sát khả hạt Kết quả: Bả Ống nghiệm NMk+L.a NMS+L.a L.a NMk Khả đông tụ sữa +++ ++ ++ + - pH 4-5 5-6 5-6 5-6 6-7 - - Khả hạt (+) xảy tượng (-) không xảy tượ Nhận xét: , nhiều dấu (+) tượng xảy mạnh 39 ữa có pH= 6,5-6,8 Sữa đơng tụ (sự đơng tụ casein) tác nhân acid làm giảm pH dƣới điểm đẳng điện casein pI 5,1- 5,3 enzym renin Tác nhân acid acid lactic sinh vi khuẩn đƣợc bổ sung vào sữ đông tụ làm giảm pH xuố đơng tụ ngồi acid lactic sinh hệ vi sinh - vật hạt kefir gồm nhiều vi khuẩn lactic làm giảm pH xuống 4-5 cịn có enzym renin sinh Kl lactis [33], thành phần hệ vi sinh vậ đông tụ sữa ần nhƣ không thay đổi 6-7 điều chứng tỏ nấm men giống Kl ơng tụ lactis đƣợc dự đốn diện nấm men tạo vitamin kích thích tăng trƣởng vi khuẩn lactic [18] Tuy nhiên, điều kiện quan sát mắt thƣờng đo pH thị vạn nên có hạn chế khơng đánh giá đƣợc tác động khác nấm men kefir S cerevisiae lên vi khuẩn lactic L acidophilus khơng có hạt điều khơng có diện L kefiranofaciens đƣợc xác định sản xuất polysaccharide chính, nằm sâu bên hạt, định đến hình thành hạt kefir  probiotic : B subtilis nên L acidophilus, Tuy nhiên, L acidophilus 40 CO2 S cerevisiae Nghiên cứu subtilis B ên E coli L acidophilus, Định tên chủng nấm men kefir phân lập đƣợc - m, tr 74-82 138 Lê Thu Hƣơng (1997), Phân lập tuyển chọn nấm men Việt Nam có tác dụng kháng khuẩn Trần Việt Hƣng & Diệu Phƣơng (2010), “Dƣợc chất từ nấm men”, 24-39 men, - Trần Thị Ánh Nguyệt (2006), Bước đầu nghiên cứu khả nhân sinh khối hạt kefir ứng dụng hạt kefir chế biến kefir sữa dừa, Luận văn kỹ sƣ nghành Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Lƣơng Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, 5, 32-40, 69, 50,103, 300 10 Lê Xuân Phƣơng (2006), 57-61 11 tr 37-40, 50-51, 42-47, 12 Nguyễn Kim Minh Tâm (2003), Xây dựng qui trình ni cấy thử tác dụng trị loạn khuẩn nấm men Saccharomyces boulardii, Trƣờng ĐH Y dƣợc TPHCM 13 Lâm Xn Thanh (2008), Giáo trình cơng nghệ sản phẩm sữa, r 132 14 Đặng Thị Cẩm Tú (2005), Nghiên cứu chế biến sữa Kefir, Luận văn kỹ sƣ ngành Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học An Giang 15 Thanh Xuân (2011), , 16 Anine Schoevers and Trevor J Britz (2003), “Influence of different culturing conditions on kefir grain increase”, International Journal of Dairy Technology, 56(3), pp 183-187 17 Ch.Tchomakov (2010),“Bulgarian sour milk – a unique probiotic”, Chemical Engineering Institute in Sofia 18 Edward Franworth (2006), “Kefir- a complex probiotic”, Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, 2(1), pp 1-17 19 F P Rattra, M J O‟Connell (2011), “Kefir”, Encyclopedia of Dairy Science, pp 518-524 20 Gorsek A., Zajsek K (2010), “Influence of temperature variations on ethanol production by kefir grains – mathematical model development”, Chemical engineering transactions, 20, pp 181-186 21 His-Chia Chen, Sheng-Yao Wang, Ming-Ju Chen (2008), “Microbiologica study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and cultureindependent methods”, Food Microbiology, 25( 3), pp 492-501 22 Jillian Elizabeth Powell (2006), Bacteriocins and bacteriocin producer prensent in kefir and kefir grains, Master of science in food science, University of Stellenbosch, South Africa 23 Jyoti Prakash Tamang & Kasipathy Kailasapathy (2010), Fermented Foods and Beverages of the World, Taylor & Francis Group, USA, pp 16,18,53 24 Karina Teixeira Magalhães, Gilberto Vinícius de Melo Pereira, Cássia Roberta Campos, Giuliano Dragone, Rosane Freitas Schwan (2011), “Brazilian kefir: structure, microbial communities and chemical composition”, Braz J Microbiol, 42(2) 25 Liu Hui, Li Ping-Lan, Gong Pin, Wang Lei (2005), “Study on the Isolation Method and Yeast Fermentation Capability of Kefir Grains”, Food Science, 26(5), pp 97-100 26 M.G.C.P Miguel, P.G Cardoso, K.T Magalhães-Guedes, R.F Schwan (2013), “Identification and assessment of kefir yeast potential for sugar/ethanol-resistance”, Braz J Microbiol, ISSN 1678-4405 27 Marshall V.M, Cole W.M, Brooker B.E (1984), “Observations on the structure of kefir grains and the distribution of the microflora”, Applied Bacteriology, 57(3), pp 491- 497 28 Neda Habibi, Sabihe Soleimanian-Zad, Mahmoud Sheikh Zeinoddin (2011), “Optimization of Kefir Grains Production by Using Taguchi Technique and Mini-Fermentation”, World Applied Sciences, 12(5), pp 613-618 29 Parmjit S.Panesar (2011), ”Fermented Dairy Products: Starter Cultures and Potential Nutritional Benefits”, Food and Nutrition Sciences, 2(1), pp 47-51 30 Plessas S, Pherson L, Bekatorou A, Singh-Nee Nigam, Poonam & Koutinas, AA (2005), “Bread making using kefir grains as baker's yeast”, Food Chemistry, 93(4), pp 585-589 31 Semih Otles, Ozlem Cagindi (2003), “Kefir: A Probiotic Dairy-Composition, Nutritional and Therapeutic Aspects”, Pakistan Journal of Nutrition, (2), pp 54-59 32 Vardjan T, Rogelj I, Canžek Majhenič A (2013), “Characterization and stability of lactobacilli and yeast microbiota in kefir grains”, Dairy Science, 96(5), pp 2729 – 2736 Website 33 http://en.wikipedia.org/wiki/Rennin [29] STT Tên sản phẩm Nguồn sữa Thành phần vi sinh vật Lb lactis ssp lactis Lb delbrueckii ssp bulgaricus Lb plantarum, Str lactis S thermophilus, S cremoris Curd Sữa trâu/ bò Yogurt Sữa bò Cultured butter milk Sữa trâu/ bò S lactis ssp diacetylactis S cremoris Lassi Acidophilus milk Bulgarian butter milk Sữa trâu/ bò Lb bulgaricus Sữa bò Lb acidophilus Shrikhand Sữa trâu/ bò S thermophilus, Lb bulgaricus Kumiss Sữa ngựa/ lạc đà / lừa Lb acidophilus, Lb bulgaricus Saccharomyces, Micrococci Kefir Sữa cừu/ bò/ dê/ hỗn hợp S lactis, Leuconostoc sp S kefir, Torula kefir, Micrococci 10 Leben Sữa dê/ cừu S lactis, S thermophilus, Lb bulgaricus Nấm men lên men đƣợc đƣờng lactose Sữa bò/ trâu/ dê/ cừu Lb lactis ssp lactis, Lb lactis ssp cremoris, Lb lactis ssp diacetylactis, Lb delbueckii ssp bulgaricus, S thermophilus, Priopionibacterium shermanii, Penicillium roqueforti … 11 Pho mát Sữa bò Lb acidophilus S thermophilus Lb bulgaricus Lb delbrueckii ssp bulgaricus Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng kefir [31] Thành phần Năng lƣợng Chất béo (%) Protein (%) Lactose (%) Nƣớc (%) Acid sữa (g) Ethanol (g) Acid lactic (g) Cholesterol (mg ) Phosphat (mg) Amino acid thiết yếu (g) Tryptophan Phenylalanin+tyrosine Leucine Isoleucine Threonine Methionine+cystine Lysine Valine Vitamin (mg) A Carotene B1 B2 B6 100g 65kcal 3,5 3,3 4,0 87,5 0,8 0,9 13 40 0,05 0,35 0,34 0,21 0,17 0,12 0,27 0,22 0,06 0,02 0,04 0,17 0,05 Thành phần 100g Hàm lƣợng khoáng (g) Calci Phospho Magie Kali Natri Chlorid 0,12 0,10 12 0,15 0,05 0,10 Nguyên tố Sắt (mg) Đồng (µg) Molypden (µg) Mangan (µg) Kẽm (mg) 0,05 12 5,5 0,36 Hợp chất thơm Acetaldehyd Diacetyl Aceton B12 Niacin C D E 0,5 0,09 0,08 0,11 ] Fehling A: cân 34,66g CuSO4.5H2 - 2SO4 Fehling B: 2Cr2O7 Du 2S2O3 0,5N: cân 16g K2Cr2O7 0,1N: cân 25,0g Na2S2O3 2CO3 ... phân tử Dƣới số nghiên cứu giới thực nấm men hạt kefir: Liu Hui, Li Ping-Lan, Gong Pin, Wang Lei khả nấm men 14 Kết cho thấy nấm men đƣợc phân lập từ dịch lọc kefir điều kiện tối ƣu cho lên men. ..BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM MEN PHÂN LẬP TỪ HẠT KEFIR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng... cứu đƣợc cơng bố, hạt kefir có nhiều lo [19], [32] riêng nấm men từ hạt kefir khảo sát số thông số đặc điểm sinh lý nấm men nhằm tạo điều kiện cho q trình ni cấy nấm men từ hạt kefir Hà Lan Mụ