Nghiên cứu ảnh hưởng của tá dược lên chủng probiotic bacillus clausii JCM 9138 dùng trong bào chế dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TÁ DƯỢC LÊN CHỦNG PROBIOTIC BACILLUS CLAUSII JCM 9138 DÙNG TRONG BÀO CHẾ DƯỢC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TÁ DƯỢC LÊN CHỦNG PROBIOTIC BACILLUS CLAUSII JCM 9138 DÙNG TRONG BÀO CHẾ DƯỢC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết định giao đề tài: 551/QĐ-ĐHNT ngày 21/06/2017 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN HOÀNG KHUÊ TÚ PGS TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: Phòng đào tạo sau đại học KHÁNH HÒA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng tá dược lên chủng probiotic Bacillus clausii JCM 9138 dùng bào chế dược phẩm” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Huỳnh Thị Thanh Thảo iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này, trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường Khoa Sau đại học kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Mơi trường tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt khóa học Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho cô PGS TS Nguyễn Hoàng Khuê Tú – Phó Trưởng khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Quốc tế TP HCM thầy PGS.TS Nguyễn Văn Duy – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn, động viên hỗ trợ cho tơi suốt q trình thực luận văn Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo Công ty Cổ phần Vắc xin Sinh phẩm Nha Trang tạo điều kiện cho tơi học để nâng cao trình độ Xin cám ơn anh chị em đồng nghiệp tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi trình nghiên cứu Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ gia đình bạn bè luôn chia sẻ kịp thời suốt thời gian qua Tác giả luận văn Huỳnh Thị Thanh Thảo iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC SƠ ĐỒ xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Giới thiệu probiotic 1.1.2 Tiêu chuẩn chất lượng probiotic 1.1.3 Ưu điểm probiotic từ bào tử 1.1.4 Tính an toàn bào tử tạo chế phẩm probiotic 1.1.5 Chế phẩm probiotic từ bào tử 1.1.6 Công nghệ sản xuất probiotic 1.2 Xu hướng phát triển dạng bào chế sản phẩm probiotic 11 1.2.1 Dạng thực phẩm probiotic 11 1.2.2 Dạng bào chế dược phẩm probiotic 13 1.2.3 Ưu nhược điểm dạng bào chế sản phẩm probiotic đường uống 15 1.2.4 Sơ đồ công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic dạng lỏng 18 1.3 Ứng dụng probiotic 19 1.3.1 Ứng dụng thực phẩm 19 1.3.2 Ứng dụng y học 19 1.3.3 Ứng dụng chăn nuôi 20 1.3.4 Ứng dụng nuôi trồng thủy sản 20 1.3.5 Ứng dụng nông nghiệp 21 1.4 Quy trình đánh giá sản phẩm probiotic 22 v 1.5 Bacillus clausii 23 1.5.1 Danh pháp 23 1.5.2 Đặc điểm B.clausii 23 1.5.3 Ứng dụng B.clausii 24 1.5.4 Một số nghiên cứu B.clausii 26 1.6 Tá dược bào chế dược phẩm probiotic 28 1.6.1 Các thông tin tá dược dược phẩm 28 1.6.2 Một số tá dược thường dùng cho dược phẩm probiotic 29 1.7 Một số nghiên cứu ảnh hưởng tá dược lên chủng probiotic dùng bào chế dược phẩm 31 1.8 Cơ chế sử dụng loại đường vi khuẩn 34 1.8.1 Chất dinh dưỡng có nguồn carbon 34 1.8.2 Cơ chế sử dụng loại đường 35 1.9 Mục tiêu sử dụng tá dược cho nghiên cứu 37 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 2.2 Vật liệu nghiên cứu 38 2.2.1 Hóa chất 38 2.2.2 Chủng vi sinh 39 2.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh 39 2.2.4 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng 40 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 2.4 Chuẩn bị lô chủng làm việc B.clausii JCM 9138 (Working seed lot – WSL) 42 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 42 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần tá dược lên B.clausii JCM 9138 q trình ni cấy 49 2.5.1 Bố trí thí nghiệm 49 2.5.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thành phần tá dược lên B.clausii JCM 9138 q trình ni cấy 50 2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần tá dược lên B.clausii JCM 9138 trình bảo quản 52 vi 2.6.1 Bố trí thí nghiệm 52 2.6.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng tá dược lên B.clausii JCM 9138 trình bảo quản 53 2.7 Xử lý số liệu 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1 Kết chuẩn bị lô chủng làm việc B.clausii JCM 9138 - WSL 59 3.1.1 Kết đánh giá hình dạng bên ngoài, tiêu vật lý định lượng lô chủng B.clausii JCM 9138 – WSL sau đông khô 59 3.1.2 Kết đánh giá đặc tính sinh học lơ chủng B.clausii JCM 9138WSL đông khô 60 3.1.3 Kết xác định vi khuẩn dựa vào phương pháp sinh học phân tử: 65 3.2 Ảnh hưởng thành phần tá dược lên B.clausii JCM 9138 q trình ni cấy mơi trường lỏng 70 3.2.1 Ảnh hưởng tá dược lên sinh trưởng B.clausii JCM 9138 70 3.2.2 Ảnh hưởng tá dược lên tính chất sinh hóa hoạt tính enzyme B.claussi JCM 9138 76 3.2.3 Ảnh hưởng tá dược lên hoạt tính sinh học B.clausii JCM 9138 76 3.3 Đánh giá ảnh hưởng thành phần tá dược sản phẩm bào chế chứa bào tử B.clausii JCM 9138 80 3.3.1 Đánh giá chất lượng sản phẩm bào tử B.claussi JCM 9138 sau bào chế 80 3.3.2 Đánh giá độ ổn định sản phẩm chứa bào tử B.clausii JCM 9138 theo thời gian bảo quản 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 82 KẾT LUẬN 82 ĐỀ XUẤT 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU Ký hiệu 16S rRNA Tên đầy đủ Giải thích Trình tự gen để xác định, phân RNA ribosome 16 S loại vi khuẩn CV Coefficient of variaton Hệ số phân tán DĐVN V Dược điển Việt nam V Dược điển Việt Nam, xuất lần thứ DE Dextrose equivalent Mức tương đương dextrose EFSA European Food SafetyAuthority Tổ chức An toàn Thực phẩm Châu Âu FAO Food and Agriculture Tổ chức lương thực Nông Organization of the United nghiệp Liên hiệp quốc Nations American Food and Drud Cục quản lý Thực phẩm Dược Administration phẩm Hoa kỳ GM Geometric Giá trị trung bình GRAS Generally Regarded As Safe Chứng nhận an tồn FDA PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase, kỹ FDA thuật khuếch đại gen Qualified Presumption of Safety Chứng nhận An toàn EFSA SD Standard deviation Độ lệch chuẩn WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới WSL Working seed lot Lô chủng làm việc QPS RH viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số sản phẩm thuốc probiotic từ B clausii thị trường Việt Nam 25 Bảng 1.2 Nguồn carbon vi sinh vật sử dụng .35 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi Sub F/R .38 Bảng 2.2 Tiêu chuẩn chất lượng chủng B.clausii JCM 9138 -WSL đông khô .44 Bảng 2.3 Công thức thành phần sản phẩm bào chế chứa bào tử B.clausii 53 Bảng 2.4 Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm thuốc chứa bào tử B.clausii JCM 9138 .54 Bảng 3.1 Kết đánh giá tiêu vật lý định lượng chủng B.clausii JCM 9138 - WSL sau đông khô 59 Bảng 3.2 So sánh trình tự gen 16S rRNA chủng B.clausii JCM 9138 với trình tự gần GenBank .67 Bảng 3.3 Tóm tắt kết kiểm nghiệm xác định đặc tính lơ chủng B.clausii JCM 9138 – WSL đông khô 69 Bảng 3.4 Tóm tắt kết kiểm tra tính chất sinh hóa hoạt tính enzyme bào tử B.clausii JCM 8138 .76 Bảng 3.5 Kết kiểm tra chất lượng sản phẩm chứa bào tử B.clausii JCM 9138 .80 Bảng 3.6 Kết kiểm tra độ ổn định độ sống vi khuẩn sản phẩm chứa bào tử B.clausii JCM 9138 .81 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số sản phẩm chứa bào tử B clausii Công ty CP Vắc xin Sinh phẩm Nha Trang sản xuất lưu hành thị trường Việt Nam 26 Hình 1.2 Độ sống chủng probiotic bảo quản 50C 60 ngày 32 Hình 1.3 Cơ chế sử dụng loại đường vi khuẩn 36 Hình 3.1 Canh cấy chủng B.clausii JCM 9138- WSL mơi trường TSB .60 Hình 3.2 Khuẩn lạc chủng B.clausii JCM 9138 môi trường TSA 61 Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn B.clausii JCM 9138 tiêu nhuộm Gram .62 Hình 3.4 Kết kiểm tra tính di động B.clausii JCM 9138 nuôi cấy thạch mềm .63 Hình 3.5 Kết thử phản ứng catalase vi khuẩn B.clausii JCM 9138 .63 Hình 3.6 Kết thử hoạt tính enzyme protease B.clausii JCM 9138 64 Hình 3.7 Kết thử hoạt tính enzym amylase B.clausii JCM 9138 65 Hình 3.8 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16s rRNA từ chủng B.clausii JCM 9138 cặp mồi Sub 66 Hình 3.9 Cây phát sinh lồi Bacillus clausii 68 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ D-glucose lên sinh trưởng B.clausii JCM 9138 .70 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ lactose lên sinh trưởng B.clausii JCM 9138 72 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ maltodextrin lên sinh trưởng B.clausii JCM 9138 .74 Hình 3.13 Ảnh hưởng axit ascorbic (pH3) lên sinh trưởng B.clausii JCM 9138 .75 Hình 3.14 Tỷ lệ sống bào tử B.claussi JCM 9138 sau tiếp xúc với pH khác 77 Hình 3.15 Tỷ lệ sống bào tử B.claussi JCM 9138 sau tiếp xúc với muối mật .78 Hình 3.16 B.clausii JCM 9138 ức chế vi khuẩn gây bệnh sau 48h .79 x 45 Rautray, K A., Patra, Sardar K.K and Sahoo G (2011), "Potential of probiotics in livestock production", Exploratory Animal and Medical Research, 1, pp 20-28 46 Rodrigues D., Rocha-Santos T., Sousa S., Gomes A.M., Pintado M.M., Xavier Malcata F., Sousa Lobo J.M., Silva J.P., Costa P., Amaral M.H and Freitas A.C (2011), "On the viability of five probiotic strains when immobilised on various polymers", International Journal of Dairy Technology, 64(1), pp 137-144 47 Silva J.P.S.e and Freitas A.C (2014), Probiotic Bacteria: Fundamentals, Therapy, and Technological Aspects, Pan Stanford Publishing 48 Spinosa M.R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G and Oggioni M.R (2000), "On the fate of ingested Bacillus spores", Research in Microbiology, 151(5), pp 361-368 49 Sreeja V., Prajapati J., Thakkar V., Gandhi T and Darji V (2016), "Effect of Excipients on Disintegration, Viability and Activity of Fast Disintegrating Tablets Containing Probiotic and Starter Cultures", Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 10(2), pp 108-117 50 Stadler M and Viernstein H (2003), "Optimization of a formulation containing viable Lactic Acid Bacteria", International journal of pharmaceutics, 256, pp 117-22 51 Sudha M., Bhonagiri S and Kumar M (2013), "Efficacy of Bacillus clausii strain UBBC-07 in the treatment of patients suffering from acute diarrhoea", Beneficial microbes, 4, pp 211-6 52 USP 31 (2007), The United States pharmacopeia : USP 31 ; The national formulary : NF 26, United States Pharmacopeial Convention ; Stationery Office, Rockville, Maryland.; London 53 Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P and Verstraete W (2001), "Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture", Microbiology and molecular biology reviews : MMBR, 64, pp 655-71 54 Vyas U and Ranganathan N (2012), "Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics: Gut and Beyond", Gastroenterology research and practice, 2012, pp 872716 55 Yousten A.A and Rogoff M.H (1969), "Metabolism of Bacillus thuringiensis in relation to spore and crystal formation", Journal of bacteriology, 100(3), pp 12291236 87 56 Zárate G., Juárez Tomás M and Nader-Macías M (2005), "Effect of some pharmaceutical excipients on the survival of probiotic vaginal lactobacilli", Canadian journal of microbiology, 51, pp 483-9 88 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cách chuẩn bị môi trường, dung dịch đệm phương pháp nhuộm gram Pha môi trường dung dịch đệm ➢ Môi trường TSB, Merck Thành phần: − Pepton frome casein − Pepton frome soymeal 17 (g/l) (g/l) − NaCl5 (g/l) − Glucose monohydrate2.5 (g/l) − di-Potassium hydrogen phosphate1.5 (g/l) pH = 7,3 Cách pha: Cân 30 g môi trường TSB vào lít nước cất khử trùng Trộn hấp tiệt trùng 121oC 15 phút ➢ Môi trường TSA, Merck Thành phần: − Casein15 (g/l) − Soya bean5 (g/l) − NaCl5 (g/l) − Agar-agar15 (g/l) pH = 7,3 Cách pha: Cân 40 g môi trường TSA vào lít nước cất khử trùng Trộn khử trùng 121oC 15 phút ➢ Môi trường LB broth, Merck Thành phần: − Yeast extract 5.0 g (g/l) − Peptone from casein 10.0 g (g/l) − Sodium chloride 10.0 g (g/l) Cách pha: Hòa tan 25 g LB-Broth vào lit nước khử khoáng hấp tiệt trùng 121oC 15 phút pH: 7.0 ± 0.2 at 25 °C Canh thang chuẩn bị có màu nâu vàng suốt ➢ Mơi trường LB agar, Merck Thành phần: − Yeast extract 5.0 g − Peptone from casein 10.0 g − Sodium chloride 10.0 g − Agar-agar 12 g Cách pha: Hòa tan 37 g LB-Agar lit nước khử khoáng hấp tiệt trùng 121°C 15 phút pH: 7.0 ± 0.2 at 25 °C Đĩa thạch chuẩn bị có màu nâu vàng suốt ➢ Mơi trường Sabouraud 4% dextrose agar (SDA), Merck Thành phần: − Dextrose40 g/l − Peptone10 g/l − Agar15 g/l pH : 5.6 Cách pha: Cân 65 g vào 1l nước cất khử trùng, lắc Hấp tiệt trùng 121ºC 15 phút ➢ Môi trường Mossel broth, Merck Thành phần: − Enzymatic digest of animal tissuse, D(+)-Glucose 5.0 (g/l) − Ox bile dried 20.0 (g/l) − Brilliant green 0.0135 (g/l) − di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate 8.0 (g/l) − Potassium dihydrogen phosphate 2.0 (g/l) pH 7,2 ± 0,2 Cách pha: Cân 45 g vào l nước cất khử trùng, lắc đều, hút vào ống Khử trùng 121ºC phút đun cách thủy 100ºC 30 phút, làm lạnh ➢ Môi trường Violet red bile dextrose agar (VRBD), Merck Thành phần: − Peptone from gelatine 7.0 (g/l) − Yeast extract 3.0 (g/l) − Sodium chloride 5.0 (g/l) − D(+)Glucose 10.0 (g/l) − Bile salt mixture 1.5 (g/l) − Neutralred 0.03 (g/l) − Crystal violet 0.002 (g/l) − Agar-agar 13.0 (g/l) pH 7,4 ± 0,2 Cách pha: Cân 39,5 g vào 1l nước cất khử trùng Đun cách thủy thường xuyên lắc đều, tan hồn tồn Sau đó đun nóng khơng q phút Không hấp triệt trùng, không đun nóng ➢ Môi trường Rappaport Vassiliadis, Merck Thành phần: − Peptone from soymeal4.5 (g/l) − Magnesium chloride-hexahydrate29.0 (g/l) − Sodium chloride8.0 (g/l) − di-Potassium hydrogen phosphate0.40 (g/l) − Potassium dihydrogen phosphate0.60 (g/l) − Malachite green oxalate0.036 (g/l) pH : 5.0 - 5.4 Cách pha: Cân 42.5 g vào 1l nước cất khử trùng, lắc Hấp tiệt trùng 121ºC 15 phút ➢ Môi trường Xylose - lysine - desoxycholate agar (XLD), Merck Thành phần: − Yeast extract3.0 (g/l) − Sodium chloride 5.0 (g/l) − D (+) Xylose3.75 (g/l) − Lactose7.5 (g/l) − Sucrose7.5 (g/l) − L (+) Lysin5.0 (g/l) − Sodium deoxycholate1.0 (g/l) − Sodium thiosulfate6.8 (g/l) − Ammonium iron (III)- citrate0.8 (g/l) − Phenol red0.08 (g/l) − Agar- agar14.5 (g/l) pH 7,4 ± 0,2 ➢ Cách pha: Cân 55 g vào 1l nước cất khử trùng Đun cách thủy thường xuyên lắc đều, tan hồn tồn Khơng hấp triệt trùng Kết tủa hình thành khơng ảnh hưởng đến hiệu suất môi trường nuôi cấy ➢ Môi trường MacConkey broth, Merck Thành phần: − Peptone from Gelatine 20.0 (g/l) − Lactose 10.0 (g/l) − Ox bile dried 5.0 (g/l) − Bromcresol purple 0.01 (g/l) pH: 7.1 - 7.5 Cách Pha: Cân 35g vào l nước cất khử trùng, lắc Hấp tiệt trùng 121ºC 15 phút ➢ Môi trường MacConkey agar, Meck Thành phần: − Peptone17 (g/l) − Proteose peptone3 (g/l) − Lactose10 (g/l) − NaCl5 (g/l) − Crystal Violet1.0 (mg) − Neutral Red30.0 (mg/l) − Muối mật1.5 (g/l) − Thạch13.5 (g) Cách pha: Cân 50 g MC vào 500ml nước cất khử trùng, lắc đều, thêm nước đủ 1000ml, Trộn khử trùng 121oC 15 phút ➢ Môi trường Cetrimide agar, Merck Thành phần: − Enzymatic Digest of Gelatin20 (g/l) − Magnesium Chloride1.4 (g/l) − Potassium Chloride10 (g/l) − Cetrimide0.3 (g/l) − Glycerol10 (ml/l) − Thạch Agar13.6 (g/l) pH: 7.2 ± 0.2 Cách pha: Cân 45 g vào 1l nước cất khử trùng, lắc Hấp tiệt trùng 121ºC 15 phút ➢ Môi trường thạch muối Manitol, Merck Thành phần: − Pancreatic Digest of Casein5 g/l − Peptic Digest of Animal Tissue5 g/l − Beef Extract1 g/l − D-Mannitol10 g/l − Sodium Chloride75 g/l − Phenol Red0.025 g/l − Agar 15 g/l pH : 7.4 Cách pha: Cân 111 g vào 1l nước cất khử trùng, lắc Hấp tiệt trùng 121ºC 15 phút ➢ Nước muối sinh lý Thành phần: NaCl g/l Cách pha: Hoà tan g NaCl lít nước cất Phân phối vào ống nghiệm, đậy nút giấy bạc hấp khử trùng nhiệt độ 12oC 15 phút ➢ Dung dịch đệm phosphate pH 7,2 Thành phần: Kali dihydrophosphat 34 g/l pH = 7,2 Cách pha: Cân 34 g Kali dihydrophosphat vào 500ml nước cất khử trùng Điều chỉnh pH 7,2 ± 0,2 natri hydroxyd , thêm nước đủ 1000ml, Trộn khử trùng 121oC 15 phút, dung dịch đệm gốc Pha lỗng dung dịch đệm gốc với nước tính khiết tỉ lệ 1:800 tiệt khuẩn ➢ Dung dịch đệm PBS − NaCl8 g/l − KCl 0,2 g/l − Na2HPO4 1,44 g/l − KH2PO4 0,24 g/l pH = 7,4 Nhuộm Gram • Thuốc nhuộm Gram, Merck − Crystal violet − Lugol − Decolorization − Safarin • Tiến hành − Dùng que cấy thu sinh khối từ canh trường chứa vi khuẩn, đưa lên lam kính sạch, dàn vi khuẩn, để khô tự nhiên hơ nhẹ đèn cồn, tránh để lâu nóng làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quan sát − Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để 30 giây đến phút − Nghiêng đổ rửa lại nước cất − Nhuộm màu tiêu thuốc nhuộm Liugol thời gian 30 giây đến phút, rửa nhẹ với nước cất − Rửa tiêu vừa nhuộm với Decolorization phiến kính hết màu khoảng 10-15 giây, rửa lại với nước cất − Nhuộm tiếp tiêu với Safarin thời gian 30 giây đến phút, rửa lại với nước cất − Dùng giấy thấm lau tiêu cho xung quanh vùng vi khuẩn, để khô tự nhiên sau đó đưa lên vật kính dầu X -1000 quan sát Phụ lục 2: Kết kiểm tra trọng lượng khô tốc độ tạo hỗn dịch sau hoàn nguyên chủng WSL vi khuẩn B.clausii JCM 9138 sau đông khô Lọ đông khô 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TB SD CV(%) *𝐶𝑉(%) = *𝑋 = 𝑆𝐷 𝑋 Trọng lượng khô (mg) 25 25 25 24 25 26 23 27 25 24 25 25 25 25 23 25 24 27 25 26 24.95 1.05 4.20 𝑥 100 ∑ 𝑋𝑖 𝑁 *𝑆𝐷 = √ ∑𝑁 𝑖=1(𝑋𝑖−𝑋) 𝑁−1 Trong đó:SD: Độ lệch chuẩn X: Giá trị trung bình Xi: Giá trị thứ i N: Tổng số mẫu CV: Độ chênh lệch trọng lượng lọ Tốc độ tạo hỗn dịch (giây) 30 30 28 30 29 32 30 30 30 31 30 30 30 30 32 30 28 30 30 29 29.95 / / Phụ lục 3: Kết xác định số lượng B.clausii mẫu thu từ môi trường bổ sung D-Glucose Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFUx103)/ml Nồng độ Glucose Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Ngày 14 0,5 3360 ± 365,5 1400 ± 15,6 650 ± 100 285 ± 62,5 125 ± 5,0 15 ± 2,0 2710 ± 294,5 1300 ± 200 630 ± 116 271,7 ± 35,5 83 ± 10,0 10 ± 1,0 1656,7 ± 75,0 1170 ± 185,5 556,7 ± 80,3 235 ± 50,2 62 ± 14,0 ± 1,0 1296,7 ± 166,7 1100 ± 125,4 480 ± 49,5 191,7 ± 33,5 57 ± 11,0 ± 1,0 668 ± 76,5 1100 ± 115,5 430 ± 24,5 171 ± 20,5 53 ± 9,0 ± 1,0 450,7 ± 25,0 26 ± 6,0 ± 1,0 1083,3 ± 125,5 433,3 ± 16,5 168,7 ± 16,5 Phụ lục 4: Kết xác định số lượng B.clausii mẫu thu từ môi trường bổ sung Lactose Nồng Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFU x 104)/ml độ Lactose Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Ngày 14 0,5 506,7 ± 35,1 573,3 ± 45,1 1126,7 ± 115,0 1386,7 ± 68,1 1760,0 ± 79,4 448,3 ± 18,9 436,7 ± 11,5 1056,7 ± 97,1 1066,7 ± 124,2 1046,7 ± 66,6 53,3 ± 5,8 173,0 ± 22,1 536,3 ± 16,0 920,0 ± 104,4 826,7 ± 56,9 199,3 ± 13,8 285,3 ± 15,3 338,3 ± 37,0 800,0 ± 85,4 996,7 ± 98,7 83,3 ± 10,4 214,7 ± 21,7 582,7 ± 40,2 1363,3 ± 118,5 1736,7 ± 55,1 46,3 ± 7,1 203,0 ± 11,4 684,0 ± 11,5 1396,7 ± 85,0 1710,0 ± 70,0 Phụ lục 5: Kết xác định số lượng B.clausii mẫu thu từ môi trường bổ sung Maltodextrin Nồng Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFU x 104)/ml độ Maltose Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Ngày 14 0,5 516,7 ± 25,2 383,3 ± 20,8 316,7 ± 30,6 113,3 ± 5,8 50,3 ± 9,1 370,0 ± 26,5 256,7 ± 25,2 280,0 ± 20,0 166,7 ± 25,2 201,3 ± 21,7 320,0 ± 26,5 313,3 ± 25,2 263,3 ± 25,2 240,0 ± 30,0 180,3 ± 18,1 410,0 ± 30,0 390,0 ± 36,1 246,7 ± 25,2 250,0 ± 20,0 222,7 ± 6,5 468,0 ± 40,6 396,7 ± 40,4 350,0 ± 26,5 296,7 ± 11,5 306,7 ± 20,8 dextrin 516,3 ± 30,0 450,0 ± 20,0 403,3 ± 20,8 383,3 ± 15,3 376,7 ± 20,8 Phụ lục 6: Kết xác định số lượng B.clausii JCM 9138 mẫu thu từ môi trường bổ sung axit ascorbic Axit Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFUx107)/ml ascorbic (pH 3) 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24 h Đĩa 44 65 54 55 51 22 143 Đĩa 45 66 55 56 50 23 144 Đĩa 46 64 56 57 52 24 145 TB 45 65 55 56 51 23 144 Phụ lục 7: Kết xác định vòng ức chế S.aureus B.clausii JCM 9138 Đường kính vịng ức chế (mm) Thời gian ni Số giếng cấy 24 h 48 h WSL L+A Đĩa Đĩa Đĩa Đĩa Giếng 10,00 8.90 9.90 11.00 Giếng 9,90 8.90 10.00 10.90 Giếng 10,10 9.20 10.10 11.10 TB 10,00 9,00 10,00 11,00 Lần 16,00 15.00 15.00 16.90 Lần 15,90 16.00 14.90 16.90 Lần 16,10 17.00 15.10 17.20 TB 16,00 16,00 15,00 17,00 WSL : Chủng B.clausii JCM 9138 - WSL L+A: Chủng B.clausii JCM 9138 nuôi cấy môi trường có bổ sung Lactose 5% axit ascorbic (pH 3) Phụ lục 8: Kết xác định tỷ lệ sống B.clausii JCM 9138 tiếp xúc với pH axit dày Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFUx106)/ml pH pH pH pH 1h 2h 3h 6h 12 h 24 h Đĩa 13,6 7,4 0 0 Đĩa 13,7 7,2 0 0 Đĩa 13,8 7,3 0 0 TB 13,7 7,3 0 0 Đĩa 61,5 37,4 25,2 19,7 9,0 3,6 Đĩa 61,2 37,2 25,4 19,6 9,0 3,8 Đĩa 61,2 37,3 25,3 19,8 9,0 3,7 TB 61,3 37,3 25,3 19,7 9,0 3,7 Đĩa 96,7 83,2 70,1 33,2 66,6 80,1 Đĩa 96,6 83,3 70,0 33,4 66,6 80,1 Đĩa 96,8 83,4 69,9 33,3 66,9 79,8 TB 96,7 83,3 70,0 33,3 66,7 80,0 Phụ lục : Kết xác định số lượng B.clausii JCM 9138 sau tiếp xúc với muối mật Số lượng B.clausii sau tiếp xúc với muối mật (CFUx107/ml) Nồng độ muối mật (%) Thời gian tiếp xúc Mẫu ĐC (0) 1h 2h 3h 0,5 1,0 1,5 2,0 Đĩa 31,0 29,6 30,4 27,4 28,2 Đĩa 32,0 29,2 30,6 27,5 28,8 Đĩa 30,0 29,7 30,5 27,6 28,5 TB 31,0 29,5 30,5 27,5 28,5 Đĩa 31,0 29,6 29,4 29,4 28,7 Đĩa 30,0 29,2 29,3 29,4 29,3 Đĩa 29,0 29,7 29,8 29,7 29,0 TB 30,0 29,5 29,5 29,5 29,0 Đĩa 29,2 28,7 30,5 29,0 27,9 Đĩa 29,0 27,5 30,3 28,8 27,9 Đĩa 28,8 27,8 30,7 29,2 28,2 TB 29,0 28,0 30,5 29,0 28,0 Phụ lục 10 : Kết xác định độ ổn định độ sống B.clausii JCM 9138 theo thời gian 48 tuần Số lượng vi khuẩn B.clausii (CFUx109)/ml Lô thử nghiệm Lô Lô Lô Tuần Tuần Tuần Tuần 12 Tuần 24 Tuần 48 Đĩa 3,25 2,97 3,11 2,94 2,98 2,84 Đĩa 3.23 2,98 3,12 2,96 3,00 2,85 Đĩa 3,24 2,99 3,13 2,95 3,02 2,86 TB 3,24 2,98 3,12 2,95 3,00 2,85 Đĩa 3,51 3,24 3,37 3,18 3,27 3,01 Đĩa 3,52 3,25 3,38 3,20 3,29 3,00 Đĩa 3,53 3,26 3,39 3,22 3,28 2,99 TB 3,52 3,25 3,38 3,20 3,28 3,00 Đĩa 3,36 3,15 3,19 3,01 2,95 2,89 Đĩa 3,37 3,14 3,20 3,00 2,94 2,90 Đĩa 3,38 3,16 3,21 2,99 2,96 2,91 TB 3,37 3,15 3,20 3,00 2,95 2,90 ... CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng tá dược lên chủng probiotic Bacillus clausii JCM 9138 dùng bào chế dược phẩm? ?? công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TÁ DƯỢC LÊN CHỦNG PROBIOTIC BACILLUS CLAUSII JCM 9138 DÙNG TRONG BÀO CHẾ DƯỢC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh... Một số nghiên cứu B .clausii 26 1.6 Tá dược bào chế dược phẩm probiotic 28 1.6.1 Các thông tin tá dược dược phẩm 28 1.6.2 Một số tá dược thường dùng cho dược phẩm probiotic