Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận án tiến sĩ: Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

Để tăng tính tương hợp sinh học và khả năng hướng đích cũng như giảm độc tính của dendrimer PAMAM với tế bào nhưng vẫn giữ được những đặc tính nổi bật của PAMAM dendrimer với vai trò ch[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA CHẤT

MANG NANO DENDRIMER

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 44 01 25

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

1

Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Nguyễn Cửu Khoa Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Trần Ngọc Quyển

Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …

Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:

2 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án

Dendrimer lần tổng hợp từ năm 1970-1990 hai nhóm khác (Buhleier cộng sự; Tomalia cộng sự) Các dendrimer kiểm soát chặt chẽ cấu trúc có nhóm chức bề mặt biến tính dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng Các dendrimer thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học phân phối sinh học thuốc tăng cường khả hướng đích thuốc Dendrimer tương tác với phân tử thuốc cách hấp phụ bề mặt, tương tác tĩnh điện liên kết với nhóm chức bề mặt liên kết hóa trị cách bao gói thuốc vào khoang trống dendrimer Các khoang trống bên thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với loại thuốc hòa tan Với số lượng lớn nhóm chức bề mặt dendrimer (như amine -NH2 nhóm carboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn loại thuốc khác tương tác tĩnh điện vận chuyển chúng đến đích

Cisplatin từ lâu dùng điều trị lâm sàng loại bệnh ung thư khả gây chết tế bào ung thư thuốc Tùy thuộc vào loại tế bào nồng độ Cisplatin gây độc tế bào Ngoài ra, Cisplatin làm tổn thương khối u thông qua việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo phương thức khác Mặt khác, nghiên cứu Cisplatin gây nhiều tác dụng phụ thần kinh, độc tính với thận ức chế tủy xương Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein enzyme gây việc điều chỉnh chế sinh hóa chúng Quá trình điều trị ung thư Cisplatin dẫn tới tế bào ung thư trở nên kháng Cisplatin làm giảm khả điều trị thuốc Nhiều chế kháng Cisplatin nghiên cứu bao gồm thay đổi hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế trình chết tế bào apoptosis tăng sửa chữa DNA

Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin giảm độ gây độc tế bào Cisplatin nhiều giải pháp nghiên cứu chứng minh tính hiệu điều trị bệnh ung thư Một giải pháp việc sử dụng PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin

Kế thừa phát triển nội dung mà nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng thực hiện, nội dung nghiên cứu luận án này, tiếp tục cải thiện khả mang thuốc Cisplatin PAMAM dendrimer sở tăng cường nhóm chức bề mặt dendrimer nhằm tăng khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang

2 Mục tiêu nghiên cứu luận án

Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu mang thuốc Cisplatin

3 Các nội dung nghiên cứu luận án

- Điều chế dẫn xuất PAMAM dendrimer: (PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid)

- Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa

- Đánh giá khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ chất mang PAMAM dendrimer tạo dẫn xuất bao gồm PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid

- Phân tích cấu trúc phức chất hệ chất mang - Cisplatin đánh giá hiệu suất mang thuốc Cisplatin hệ chất mang

3

CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dendrimer

1.1.1 Khái niệm phân loại

Khái niệm dendrimer Donald A Tomalia cộng đưa vào năm 1985 Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa nhánh Từ đến có nhiều cơng trình nghiên cứu cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp ứng dụng dendrimer nhiều lĩnh vực khác Dendrimer nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt so với polymer mạch thẳng Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer

- Một lõi (nhân core) trung tâm dendrimer bao gồm (i) ngun tử phân tử có hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát từ lõi, lặp lặp lại có nhiệm vụ liên kết nhóm ngồi với nhân; (iii) nhiều nhóm bên ngồi (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, nhóm ưa nước hay kỵ nước) cịn gọi nhóm bề mặt hoạt động

Dendrimer, đặc biệt PAMAM dendrimer với cấu trúc khơng gian có nhiều khoảng trống bên nhóm chức hoạt động amine, ester nằm phía bên ngồi tảng cho việc hình thành hệ chất mang thuốc chống ung thư đa chức hướng đích đến tế bào ung thư theo chế hướng đích thụ động hướng đích chủ động

1.1.2 Tính tương hợp sinh học dendrimer

Các dendrimer xem chất mang thơng minh chúng có khả mang thuốc vào nội bào, vượt qua rào cản sinh học, lưu thông thể thời gian cần thiết để gây hiệu ứng lâm sàng nhắm tới mục tiêu cụ thể Độc tính dendrimer chủ yếu gây nhóm bề mặt Nhóm amine (-NH2) bề mặt PAMAM PPI dendrimer gây độc tính chứng huyết tan (hemolysis) tùy theo nồng độ chúng nhóm ngồi nhóm trung tính anion có độc tính thấp khơng độc Để tăng tính tương hợp sinh học khả hướng đích giảm độc tính dendrimer PAMAM với tế bào giữ đặc tính bật PAMAM dendrimer với vai trò chất mang, giải pháp đưa tiến hành biến tính bề mặt PAMAM dendrimer cách tạo liên kết với cấu tử khác khơng có khả tích điện nhằm gia tăng tính tương hợp sinh học hướng đích hệ chất mang PAMAM dendrimer

4

Cisplatin, cịn gọi cis-diamminedichloroplatinum (II), phức chất có cấu trúc tứ diện với ion trung tâm Pt Cisplatin M Peyrone tổng hợp lần vào năm 1844 cấu trúc hóa học Alfred Werner chứng minh vào năm 1893 Tuy nhiên, năm 1960 giới khoa học bắt đầu quan tâm đến việc sử dụng hợp chất việc điều trị ung thư sau Cisplatin ý đặc biệt cho thấy hoạt tính chống ung thư nhiều khối u bao gồm ung thư buồng trứng, tinh hoàn khối u rắn đầu cổ Các đặc tính gây độc tế bào Cisplatin biết đến vào năm 1960 đến cuối năm 1970 xem thành phần quan trọng việc điều trị hệ thống tế bào mầm ung thư Đây hợp chất Pt (II) FDA chấp thuận điều trị ung thư vào năm 1978 Điều thu hút quan tâm nhà khoa học đến hợp chất Pt (II) kim loại khác thuốc chống ung thư tiềm Tuy nhiên, tính kháng thuốc phản ứng phụ đáng kể Cisplatin, phác đồ điều trị kết hợp Cisplatin với loại thuốc ung thư khác áp dụng xem phương pháp điều trị cho nhiều loại bệnh ung thư người

CHƯƠNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Các hóa chất cung cấp từ hãng Acros, Sigma Aldrich, Merck với chất lượng cao phù hợp mục đích sử dụng cho tổng hợp hóa học phân tích

Thiết bị sử dụng bao gồm: Tủ sấy, bể siêu âm, máy khuấy từ gia nhiệt, tủ sấy chân không, Máy cô quay chân không Eyala, bể gia nhiệt memmert, máy đông khô chân không TT Công nghệ Việt Đức, trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) chụp máy JEOL JEM 1400 140 KV, Nhật Bản Phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR máy Equinox 55 Bruker HPLC đo máy Agilent 1260, Hoa Kỳ Phổ 1H-NMR đo máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 Hàm lượng Pt đo máy ICP-MS-7700x/Agilent (VILAS) Đánh giá độc tế bào đo PTN-SHPT- BM Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine (EDA)

Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ G4.5 qua 11 giai đoạn (hình 2.1), bắt đầu giai đoạn tổng hợp hệ G-0.5 từ ethylenediamine (EDA) phản ứng với methyl acrylate (MA) thực đến hệ G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0 G4.5 Cấu trúc khối lượng phân tử sản phẩm tạo thành xác định phổ 1H-NMR

2.2.2 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin

Cisplatin hòa tan H2O khuấy liên tục nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 điều chỉnh đến pH 7-8 HCl Nhỏ từ từ dung dịch PAMAM dendrimer vào dung dịch Cisplatin, khuấy liên tục 24 đánh siêu âm nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột

2.2.3 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin

PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 thủy phân NaOH để tạo nhóm chức bề mặt -COO- thực phản ứng tạo phức thực mục 2.2.2

5

Cisplatin thủy phân trước AgNO3 để chuyển dạng monoaqua [cis-(NH2)2PtCl(H2O)] diaqua [cis-(NH2)2Pt(H2O)2] khuấy liên tục nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 thủy phân NaOH cho từ từ vào dung dịch Cisplatin thủy phân, khuấy liên tục 24 đánh siêu âm nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đơng khơ để thu dạng bột

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer

2.2.5 Biến tính PAMAM dendrimer G 3.0 với Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)

PNIPAM với nhóm chức đầu cuối -COOH kích hoạt pnitrophenyl chloroformate (NPC) N-Hydroxysuccinimide (NHS) sau cho phản ứng với nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G 3.0, khuấy liên tục 24 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR

2.2.6 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM

Sản phẩm PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM cịn nhóm -NH2 chưa phản ứng cho phản ứng với methyl acrylate mơi trường khí N2 96h để tạo PAMAM dendrimer G 3.5-PNIPAM Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR

2.2.7 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin

Thực phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin tương tự mục 2.2.4

2.2.8 Biến tính PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với poly (acrylic acid) (PAA)

PAA kích hoạt 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) sau đem phản ứng với nhóm chức bề mặt -NH2 PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa phổ 1H-NMR

2.2.9 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin Thực phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin tương tự mục 2.2.4

6

5-FU hòa tan nước khử ion (DI) sau cho từ từ vào dung dịch chứa PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin Đánh siêu âm 1h khuấy dung dịch 24h nhiệt độ phòng Sản phẩm lọc túi thẩm tách đông khô để thu dạng bột Sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá khả nang hóa giải phóng thuốc 5-FU hệ chất mang

2.2.11 Xác định hàm lượng Cisplatin sản phẩm ICP-MS

Phép đo ICP thực hệ thống ICP-MS-7700x/Agilent Hàm lượng Pt xác định dựa khối phổ Pt 195, nội chuẩn Luterium khối phổ 175

2.2.12 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro

Tiến hành khảo sát khả giải phóng thuốc khỏi hệ chất mang theo thời gian môi trường đệm pH 7,4 pH 5,5

2.2.13 Động học dược động học giải phóng thuốc

Chọn lựa mơ hình động học giải phóng thuốc Cisplatin dựa mơ hình động học phổ biến mơ hình bậc 0, bậc 1, Higuchi, Kormeyer-Peppas, Hixson-Crowell Mơ hình động học phù hợp với giải phóng thuốc chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) R2hc (R2 hiệu chỉnh) tính tốn phần mềm R

Dự đốn mơ hình dược động học tính tốn thông số dược động học hệ chất mang Cisplatin 2.2.14 Kiểm tra độc tính tế bào in vitro

Sử dụng phương pháp nhuộm SRB để đánh giá độc tính tế bào dịng tế bào ung thư phổi NCI-H460 dòng tế bào ung thư vú MCF-7

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp PAMAM Dendrimer hệ G-0.5 đến G4.5 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

Độ dịch chuyển hóa học cho proton đặc trưng dendrimer PAMAM ghi nhận theo nhiều báo cáo trước Trong kết phổ 1H NMR tương ứng với proton điển hình cấu trúc dendrimer: -CH2CH2N< (a) δH = 2,60 ppm; -CH2CH2CO- (b) δH = 2,80-2,90 ppm; -CH2CH2CONH- (c) δH = 2,30 - 2,40 ppm; -CH2CH2NH2 (d) δH = 2,70 -2,80 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) δH = 3,20 - 3,40 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) δH = 2,40 - 2,50 ppm -COOCH3 (h) δH = 3,70 ppm

Kết 1H-NMR dendrimer PAMAM hệ sau:

1H-NMR PAMAM G-0.5: δH = 2,47 - 2,50 ppm (a), δH = 2,77-2,80 ppm (b), δH = 2,54 ppm (g) δH = 3,68 ppm (h)

1H -NMR PAMAM G0.0: δH = 2,56 - 2,57 ppm (a), δH = 2,77 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 2,71 -2,75 ppm (d) δH = 3,25 - 3,27 ppm (e)

1H -NMR PAMAM G0.5: δH = 2,54 -2,57 ppm (a), δH = 2,76 - 2,82 ppm (b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 3,24 - 3,26 ppm (e), δH = 2,45 - 2,48 ppm (g) δH = 3,66 ppm (h)

1H -NMR PAMAM G1.0: δH = 2,59 - 2,60 ppm (a), δH = 2,80 -2,82 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,73 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 - 3,28 ppm (e)

1H -NMR PAMAM G1.5: δH = 2,58 - 2,59 ppm (a), δH = 2,78 - 2,86 ppm (b), δH = 2,39 - 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3,29 ppm (e), δH = 2,47 -2,50 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h)

7

1H -NMR PAMAM G2.5: δH = 2,57 - 2,64 ppm (a), δH = 2,84 - 2,86 ppm (b), δH = 2,40 -2,42 ppm (c), δH = 3,27 -3,30 ppm (e), δH = 2,48 - 2,46 ppm (g) δH = 3,68 - 3,69 ppm (h)

1H -NMR PAMAM G3.0: δH = 2,61 - 2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,74 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,29 ppm (e)

1H -NMR PAMAM G3.5: δH = 2,57 -2,64 ppm (a), δH = 2,84-2,85 ppm (b), δH = 2,38 -2,43 ppm (c), δH = 3,27 -3,37 ppm (e), δH = 2,48 -2,51 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h)

1H -NMR PAMAM G4.0: δH = 2,59 -2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm (b), δH = 2,39 – 2,40 ppm (c), δH = 2,74 – 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,28 ppm (e)

1H -NMR PAMAM G4.5: δH = 2,57 - 2.65 ppm (a), δH = 2,84 – 2,85 ppm (b), δH = 2,39 – 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3.31 ppm (e), δH = 2,47 - 2.50 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h)

So sánh tỷ lệ proton vị trí (a), (e) phân tử dendrimer χLT) tỉ lệ diện tích peak proton vị trí (a), (e) thể phổ 1H-MNR (χ

NMR) lập cơng thức tính khối lượng phân tử

dendrimer thông qua phổ 1H-NMR sau:

8 M(NMR) = χNMR

χLT MLT =

SH(-CH (e)2-) SH(-CH (a)2-) ∑H(-CH

2-)

(e)

∑H(-CH 2-)

(a)

.MLT

Trong đó:

SH(-CH (e)2-), SH(-CH (a)2-) : Diện tích peak proton vị trí (e) (a) xuất phổ 1 H-NMR

∑H(-CH 2-)

(e) , ∑H

(-CH2-)

(a) : Tổng số proton vị trí (e)

và (a) tính cơng thức phân tử PAMAM Dendrimer

MLT : Khối lượng phân tử Dendrimer tính theo lý thuyết

Kết tính tốn sau:

Bảng 3.1 Kết tính tốn KLPT Dendrimer theo 1H-NMR

H (e)(-CH2-) H (a)(-CH2-) χLT M(LT) χNMR M(NMR) Sai lệch

G-0.5 (vị trí b) 404 2,01 405,62 0,40%

G0 2,00 517 1,99 515,02 0,32%

G0.5 12 0,67 1205 0,67 1205,42 0,06%

G1.0 24 12 2,00 1430 1,95 1396,18 2,36%

G1.5 24 28 0,86 2808 0,81 2668,19 4,96%

G2.0 56 28 2,00 3257 1,95 3181,78 2,30%

G2.5 56 60 0,93 6012 0,90 5774,30 3,95%

G3.0 120 60 2,00 6910 1,90 6556,70 5,11%

G3.5 120 124 0,97 12420 0,92 11809,71 4,91%

G4.0 248 124 2,00 14216 1,90 13510,97 4,96%

G4.5 248 252 0,98 25237 0,90 23103,55 8,45%

Các phân tử PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 tổng hợp thành cơng có cấu trúc tương đối đồng ổn định nên ứng dụng làm chất mang thuốc

3.2 Phổ FTIR sản phẩm phức PAMAM dendrimer với Cisplatin

3.2.1 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5-CisPt

Phổ FTIR PAMAM G2.5, G3.5 có tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh tín hiệu có cường độ trung bình yếu vị trí 1731 cm-1, 1045 cm-1 (G2.5); 1736 cm-1, 1646 cm-1 (G3.5) tương ứng với νC=O, νC-O nhóm chức ester Một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh, mũi bầu rộng đặc trưng cho dao động nối –OH 3294 cm-1 (G2.5); 3302 cm-1 (G3.5); 3426 cm-1 (G4.5), tín hiệu hấp thu amide nằm vùng bị tín hiệu nối –OH che khuất Tín hiệu đặc trưng cho dao động bất đối xứng nhóm –CH2, CH3, tín hiệu đặc trưng cho dao động nối –CH3 2952 cm-1, 2832 cm-1 (G2.5); 2952 cm-1, 2830 cm-1 (G3.5), tín hiệu dao động biến dạng ngồi mặt phẳng nhóm CH3 1360 cm-1 (G2.5), 1359 cm-1 (G3.5), 1399 cm-1 (G4.5) Các mũi với tín hiệu dao động đặc trưng phù hợp với nhóm có cơng thức sản phẩm PAMAM dendrimer G2.5, 3.5, 4.5

9

cường độ tín hiệu hấp thu tăng lên liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin Kết cho thấy có hình thành liên kết phối trí ion Pt2+ với nhóm carboxylate -COO- PAMAM dendrimer

3.2.2 Phổ FTIR phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin

Phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0 G3.0-Cisplatin; G4.0 G4.0-Cisplatin cho thấy có dịch chuyển peak dao động biến dạng -NH 1643 cm-1 thành 1639 cm-1 (G3.0, G3.0-Cisplatin); 1643 cm-1 thành 1642 cm-1 (G4.0, G4.0-Cisplatin) Điều cho thấy có hình thành phức chất sở liên kết phối trí cation Pt2+ nhóm NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 Ngồi ra, phổ FTIR cho thấy suy giảm cường độ dịch chuyển peak dao động kéo căng đối xứng bất đối xứng nhóm -CH2 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM dendrimer G3.0 thành 2944 cm-1 2899 cm-1 phức G3.0-Cisplatin); 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM G4.0 thành 2975 cm-1 2884 cm-1 phức G4.0-Cisplatin, peak hấp thu dạng mũi nhọn 3437 cm-1 (G3.0-Cisplatin) 3427 cm-1 (G4.0-Cisplatin) liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin

10 3.3 Phổ FTIR phức G3.0-PAA với Cisplatin

Phổ FTIR cho thấy dịch chuyển nhẹ peak dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH G3.0-PAA 1644 cm-1 1571 thành 1642 cm-1 1565 cm-1 G3.0-PAA-Cisplatin Các peak có cường độ thấp dao động kéo dao động uốn -CH2 CH-CO G3.0-PAA 1454 cm-1 1409 cm-1 dịch chuyển tới 1453 cm-1 1406 cm-1 G3.0-PAA-Cisplatin Peak hấp thu mũi nhọn 3435 cm-1 liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin Kết phổ cho thấy có tương tác cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- G3.0-PAA

11 3.4 Phổ FTIR phức G4.0-PAA-Cisplatin

Phổ FTIR cho thấy dịch chuyển nhẹ peak dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH G4.0-PAA 1572 cm-1 thành 1564 cm-1 1635 cm-1 G4.0-PAA-Cisplatin Các peak có cường độ thấp dao động kéo dao động uốn -CH2 CH-CO G4.0-PAA 1454 cm-1 1407 cm-1 thành 1447 cm-1 1400 cm-1 G4.0-PAA-Cisplatin Peak 3619 cm-1 liên quan đến dao động nối -O-H nhóm -COOH G4.0-PAA Kết phổ cho thấy có tương tác cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- G4.0-PAA

3.5 Kết phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 G 3.5 biến tính với PNIPAM

Quan sát phổ 1H-NMR G3-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) ta thấy peak đặc trưng PAMAM G3.0 cịn có peak đặc trưng PNIPAM-COOH peak nhóm –CH3 (f) vị trí từ 1,10-1,26 ppm, -(CH3)2CHNH- (l) vị trí 3,97 ppm Ngồi diện tích peak nhóm –CH2CH2CONH (c) tăng từ 2,0 lên 2,68 ppm cho ta thấy có hình thành liên kết CO-NH PAMAM G3.0 với nhóm –COOH PNIPAM-COOH Kết cho ta thấy việc tổng hợp chất mang nano nhạy nhiệt dendrimer thành công

12

Từ phổ 1H-NMR G3-PNIPAM ta tính hiệu suất số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 cơng thức:

Trong đó:

%X = SH(-CH

3)

(f)

SH(-CH (a)2-) ∑H(-CH (f)3) ∑H(-CH (a) 2-)

.100%

SH(-CH (a)2-),SH(-CH (f)3) : Diện tích peak peak (a) peak (f) xuất phổ 1H-NMR

∑H(-CH (a)2-), ∑H(-CH (f)3) : Tổng số proton vị trí peak (a) (f) phân tử dẫn xuất dendrimer tính theo lý thuyết

%X : Mức độ phản ứng amide hóa

Theo cơng thức ta tính %X 15,12 % số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 4,84 nhóm (hiệu suất 96,8 %) Tính tốn tương tự dựa phổ 1H-NMR với tỉ lệ mol G3.0: PNIPAM = 1:5 1:10, ta kết bảng 3.2

Bảng 3.2 Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 ước lượng KLPT

Mẫu Số nhóm PNIPAM KLPT tính theo

1H-NMR

Nhiệt độ chuyển pha

G3.0-PNIPAM (1:5) 3,34 30.605 37,5 oC

G3.0-PNIPAM (1:8) 4,84 40.776 34 oC

G3.0-PNIPAM (1:10) 7,00 55.880 33 oC

Kết phân tích GPC mẫu G3.0-PNIPAM (1:8) cho thấy KLPT sản phẩm 39.600 gần giống với kết tính toán dựa phổ 1H-NMR.Kết phổ 1H-NMR của chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM cho thấy peak đặc trưng PNIPAM-COOH, xuất thêm peak đặc trưng PAMAM dendrimer hệ G3.5 peak –COOCH3 (h) (3,73-3,78 ppm); peak – CONHCH2CH2N- (e) (3,26-3,36 ppm); peak –CH2CH2N (a) (2,57-2,63 ppm) Từ cho thấy có hình thành liên kết nhóm –COOCH3 với nhóm amin bề mặt phân tử G3.0-PNIPAM Kết cho thấy việc tổng hợp nên chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM thành cơng

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8)

13 3.6 Kết 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA

Phổ 1H-NMR G3.0-PAA cho thấy peak đặc trưng PAMAM dendrimer G3.0 như: peak –CH2CH2N (a) (2,63ppm), peak –CONHCH2CH2N- (e) (3,30 ppm) cịn có peak đặc trưng acid polyacrylic >CHCOOH (b) (2,07 ppm) >CHCH2CH< (c) (1,61 ppm) Như vậy, khẳng định có hình thành liên kết -CO-NH nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 với nhóm -COOH PAA Kết cho thấy tổng hợp thành công chất mang G3.0-PAA

Từ kết phổ 1H-NMR G3.0-PAA, ta tính số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 6,01 nhóm (hiệu suất 50,1%) Thực phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G3.0: PAA 1:6 cho kết số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 nhóm (hiệu suất 83,3%)

3.7 Kết 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA

Tương tự hệ G3.0-PAA, kết phổ 1H-NMR cho thấy tổng hợp thành công chất mang G4.0-PAA Từ kết phổ 1H-NMR G4.0-PAA, ta tính số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer G4.0 15,16 nhóm (hiệu suất 94,7%) Thực phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA 1:8 cho kết số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 7,28 nhóm (hiệu suất 91,0%) Tiến hành thực thí nghiệm khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA 1: 24 phản ứng không thành công (xảy tượng đóng rắn bình phản ứng)

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:12)

14 3.8 Kết đo hàm lượng Pt

3.8.1 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ chẵn-Cisplatin

Bảng 3.3 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân)

TT Tên mẫu %Cisplatin

1 G3.0-Cisplatin 9,63  1,47 G4.0-Cisplatin 16,95  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

3.8.2 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ lẻ– Cisplatin (không thủy phân)

Bảng 3.4 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân)

TT Tên mẫu %Cisplatin

1 G2.5-Cisplatin 15,89 ± 1,41 G3.5-Cisplatin 7,90 ± 1,92 G4.5-Cisplatin 5,90 ± 0,68

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

Đối với PAMAM dendrimer G lẻ hàm lượng Cisplatin bị giảm hệ dendrimer tăng Khả mang thuốc thấp PAMAM dendrimer G lẻ hệ cao giải thích cản trở khơng gian nhóm carboxylate bề mặt, nhóm có xu hướng co cụm lại dẫn đến giảm khả mang thuốc Cisplatin Ngược lại với PAMAM dendrimer hệ lẻ, hàm lượng Cisplatin PAMAM dendrimer hệ chẵn G4.0 tăng khoảng 1,7 lần so với PAMAM dendrimer G3.0

3.8.3 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.5 Hàm lượng Pt phức G2.5-Cisplatin,

G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin

TT Tên mẫu %Cisplatin

1 G2.5-Cisplatin 28,99  2,01 G2.5-Cisplatin (SA) 31,82  1,39 G3.5-Cisplatin 30,23  1,29 G3.5-Cisplatin (SA) 33,01  1,56 G4.5-Cisplatin 31,11  1,48 G4.5-Cisplatin (SA) 34,03  1,96

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3; SA: có sử dụng siêu âm

Kết cho thấy, hiệu gắn Cisplatin thu cao so với kết nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu với kết hàm lượng Cisplatin phức G2.5-Cisplatin G3,5-Cisplatin 10,33% 2,3% Sự khác biệt lớn tiến hành thủy phân trước Cisplatin với AgNO3 Bằng cách này, Cisplatin gần thủy phân hoàn toàn thành cation [Pt(NH3)2(H2O)]2+ nên hiệu gắn Cisplatin vào PAMAM dendrimer hệ lẻ tăng lên nhiều Khi hệ PAMAM dendrimer tăng lên số nhóm bề mặt tăng số phân tử Cisplatin gắn vào PAMAM dendrimer tăng lên Tuy nhiên, so với gia tăng nhóm bề mặt hiệu gắn Cisplatin vào PAMAM giảm hệ dendrimer tăng Kirkpatrick cho hệ dendrimer tăng việc chuyển nhóm ngồi PAMAM dendrimer thành nhóm carboxylate khó khăn hiệu ứng không gian tăng làm giảm khả phản ứng Cisplatin với nhóm amine amide bên PAMAM dendrimer

3.8.4 Kết đo hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân)

Bảng 3.6 Hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) G4.0-PAA-G3.0-PAA-Cisplatin (thủy

phân)

TT Tên mẫu %Cisplatin

1 G3.0-PAA-Cisplatin

(1:6) 12,93  1,60

2 G3.0-PAA-Cisplatin

(1:12) 13,89  1,39

3 G4.0-PAA-Cisplatin

(1:8) 20,22  1,44

4 G4.0-PAA-Cisplatin

(1:16) 40,44  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

G4.0-15 PAA-Cisplatin ta thấy có mặt PAA làm tăng hàm lượng Cisplatin Điều giải thích PAA có nhiều nhóm -COOH nên tăng khả hình thành liên kết phức chất Pt-COO- tăng khả mang thuốc Cisplatin

3.9 So sánh khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang điều kiện không thủy phân có thủy phân Cisplatin

Bảng 3.7 Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM

dendrimer T

T

Hệ chất mang Số nhóm chức bề mặt

% Cisplatin NH2 COOH

1 G2.5-COOH 32 15,89  1,41 G3.5-COOH 64 7,90  1,92 G4.5-COOH 128 5,90  0,68 G4.0-PAA

(1:16)

49 405 19,06  1,44 G3.0-NH2 32 9,63  1,47 G4.0-NH2 64 16,95  1,29

Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer tóm tắt bảng 3.7 Kết cho thấy hệ chất mang không mang nhiều thuốc Cisplatin so với nghiên cứu trước Tuy nhiên, tiến hành thủy phân cách triệt để Cisplatin AgNO3 để tạo thành dạng [Pt(NH3)2(H2O)n]2+ khả tạo phức Pt2+ Cispaltin với nhóm bề mặt -COOH hệ chất mang PAMAM

dendrimer tăng lên làm tăng đáng kể khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang (bảng 3.8) Mặt khác, liên kết Pt2+ nhóm amine bề mặt -NH2 hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ chẵn (G3.0; G4.0) tương đối bền Cisplatin khó giải phóng khỏi hệ chất mang không tiến hành khảo sát khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) PAMAM dendrimer có nhóm amine -NH2 bề mặt Kết bảng 3.13 cho thấy Cisplatin thủy phân dễ dàng tạo phức với nhóm carboxylate -COOH bề mặt hệ chất mang Hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA (1:16) với số nhóm chức bề mặt -COOH vượt trội (405 nhóm) so với hệ chất mang khác mang lượng thuốc Cispaltin lên tới 40,44%

Bảng 3.8 Khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer T

T Hệ chất mang Số nhóm chức bề mặt Cisplatin %

NH2 COO

H

1 G2.5-COOH 32 31,82  1,39 G3.5-COOH 64 33,01  1,56 G4.5-COOH 128 34,03  1,96 G3.0-PAA

(1:6) 27 75 12,93  1,60 G3.0-PAA

(1:12)

26 90 13,89  1,39 G4.0-PAA

(1:8)

57 189 20,22  1,44 G4.0-PAA

(1:16) 49 405 40,44  1,29

3.10 Thử nghiệm khả mang đồng thời hai thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM

Hệ chất mang G3.5-PNIPAM tổng hợp từ PAMAM dendrimer G3.0 -PNIAM carboxylate hóa nhóm -COOCH3 ngồi thành nhóm -COO- có khả tạo phức với Cisplatin Hơn nữa, nhóm PNIPAM nhạy nhiệt bề mặt hệ chất mang thuộc loại polymer nhạy nhiệt có nhiệt độ tới hạn thấp (LCST, 320C) Ở điều kiện nhiệt độ điểm LCST, PNIPAM trương nở cực đại dung dịch thuốc mang phân tử thuốc vào bên mạng Khi nhiệt độ tăng lên điểm LCST, mạch polymer co ngót lại thuốc nhả bên ngồi mơi trường Trên sở nguyên lý này, thực việc mang thuốc 5-FU vào hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin

16

Bảng 3.9 Kết nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin

5FU khơng nang hóa 5-FU nang hóa

mg mg %DL % EE

PAMAM dendrimer

G3.5-PNIPAM-5FU-CisPt 4.32  0.26 25.68  0.26 20.43  0.17 85.61  0.88 PAMAM dendrimer

G3.5-PNIPAM-5FU 3.73  0.29 26.27  0.29 20.81  0.18 87.57  0.97 PNIPAM-CisPt-5FU 11.90  0.27 18.10  0.27 15.32  0.20 60.33  0.91

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

Phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin thể khả nang hóa 5-FU tạo thành hệ nano-gel nhạy nhiệt có khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU Cisplatin Phác đồ điều trị ung thư với Cispaltin thường kết hợp thêm thuốc khác để làm tăng hoạt tính giảm tác dụng phụ thuốc Do đó, hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU Cisplatin hệ mang thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn

3.11 Kết đo TEM, DLS zeta

Kích thước hạt nano phức PAMAM dendrimer hế hệ lẻ với Cisplatin tương đối đồng nằm khoảng 5-10 nm (hình 3.11)

Kết TEM cho thấy kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tồn dung dịch 190 nm (hình 3.12) So với kích thuớc ban đầu PAMAM dendrimer G3.0 (3-4 nm) kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tăng lên nhiều làm tăng khả mang thuốc hạt Kích thước hạt hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin dung dịch 184 nm lớn nhiều polymer PNIPAM bao bọc phía bên ngồi hạt PAMAM dendrimer G3.5 Ảnh TEM (hình 3.13) mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin cho thấy có khả Cisplatin tạo liên kết chéo với hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM

17

Hình 3.13 Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer Cisplatin DLS mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin mẫu PNIPAM-G3.5-PNIPAM-Cisplatin

Hình 3.12 Ảnh TEM mẫu G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM

Hình 3.14 Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA (C) DLS PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D)

18

Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 chứng minh hình thành hạt nano hình cầu đồng với đường kính khoảng 4,0 nm, gần giống với kết đo DLS 7,8 ± 2,4nm Kích thước hệ chất mang nano G4.0-PAA (28 nm) tăng gần 3,6 lần so với PAMAM dendrimer G4.0 Kích thước hạt tăng lên nhiều mang thuốc Cisplatin

Để khảo sát độ ổn định hệ chất mang, zeta dung dịch chứa hệ chất mang đo điều kiện khác Kết đo zeta hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12); G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) cho thấy zeta hệ chất mang phụ thuộc vào giá trị pH dung dịch Các hệ chất mang tương đối ổn định pH trung tính pH 7,4 Hệ G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 dễ bị kết tụ pH 5,5 với ζ= 7,3 mV Kết cho thấy không ổn định hạt dẫn đến khả hạt bị kết tụ kích thước hạt tăng nên hạt khơng thể khuếch tán vào hệ thống mạch bạch huyết lại gia tăng việc tích tụ mơi trường khối u pH 5,5 lượng Cisplatin giải phóng tăng làm tăng khả diệt khối u thuốc Ở pH 7,4, G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 có ζ= -58,6 mV cho thấy ổn định môi trường plasma nên làm tăng tính tuần hồn thuốc hệ thống mạch máu tăng khả thuốc vận chuyển đến khối u

0 20 40 60 80 100

2 10

Tr

an

sm

itt

an

ce

[%

]

pH

G3PAA 1:12 G4PAA 1:16 G4PAA 1:8

-13,9 mV -14,6 mV

19,0 mV b)

c)

a) a) b)

c)

-58,6 mV -19,2 mV

7,3 mV

Hình 3.16 Thế zeta hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12) a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5

Hình 3.17 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) tại: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5

a) b)

c)

-23,2 mV -17,2 mV

14,1 mV

Hình 3.18 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) tại: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5

19

Điểm đục hệ chất mang thay đổi pH dung dịch xác định Hình 3.19 cho thấy, độ hịa tan hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8 G4.0-PAA 1:16 phụ thuộc pH theo ba vùng pH: vùng pH thấp, vùng kết tủa (vùng trung gian) vùng pH cao Tại vùng trung gian pH 3,5 - 5,5 (hệ G4.0-PAA 1:16), pH 4,0 - 6,0 (hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8) hệ chất mang bị trung hịa điện tích pH dung dịch  pH đẳng điện gây tượng kết tụ hệ chất mang

3.12 Kết bàn luận khả giải phóng thuốc in vitro

3.12.1 Khả giải phóng thuốc phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) Bảng 3.10 Kết giải phóng thuốc in vitro phức PAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin,

G3.5-Cisplatin G4.5 - G3.5-Cisplatin

Thời gian (giờ)

G2.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin

%Cisplatin %Cisplatin %Cisplatin

pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4

0 0 0 0

6 30,42  1,20 22,78  0,81 31,72  1,00 27,17  0,91 34,96  1,08 28,23  0,81 12 37,18  1,48 28,35  1,01 39,04  1,25 35,12  1,12 45,52  1,30 33,12  1,03 24 43,10  1,70 31,84  1,14 44,94  1,41 38,64  1,16 47,86 1,04 43,48  1,20 48 45,98  1,82 34,61  1,23 47,93  1,50 41,35  1,18 53,18  1,47 48,03  1,51 60 48,18  1,90 36,29  1,29 50,24  1,62 43,76  1,28 55,07  1,51 48,91  1,54 72 51,05  2,02 36,54  1,30 53,24  1,67 45,69  1,37 55,49  1,54 49,19  1,54

Kết phân tích phương sai ANOVA cho thấy hàm lượng Cisplatin giải phóng khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer phụ thuộc vào thời gian, pH khảo sát hệ dendrimer dùng làm chất mang Trong hệ PAMAM dendrimer, lượng Cisplatin giải phóng pH 5,5 cao pH 7,4 khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Sau 60 lượng Cisplatin giải phóng khơng có khác biệt đáng kể mặt thống kê

Cisplatin giải phóng thuốc môi trường acid đệm ABS pH 5,5 cao mơi trường đệm PBS pH 7,4 giải thích mơi trường acid

các nhóm -COO- bề mặt PAMAM dendrimer bị proton hóa chuyển thành dạng -COOH làm giảm độ bền phức PAMAM dendrimer hệ lẻ - Cisplatin Lượng Cisplatin giải phóng 72 khỏi hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 51,05%, 53,24% 55,49%

3.12.2 Khả giải phóng thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAM-Cispaltin – 5FU

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%

0 12 24 36 48 60 72

% N th uố c C is pl at in

Thời gian (h)

pH 5.5 (G2.5cis) pH 7.4 (G2.5cis) pH 5.5 (G3.5cis) pH 7.4 (G3.5cis) pH 5.5 (G4.5cis) pH 7.4 (G4.5cis)

20

Bảng 3.11 Khảo sát khả giải phóng thuốc 5FU hệ chất mang G3.5-CisPt PNIPAM-CisPt

3.12.3 Khả giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Bảng 3.12 Kết giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA Thời gian

(giờ)

Cisplatin giải phóng (%) pH 5,5 pH 7,4

0 0

4 25,17  1,08 11,21  0,69 12 34,42  1,51 21,40  0,62 24 40,97  0,92 28,75  0,84 32 44,96  0,88 32,93  0,97 48 52,02  0,94 42,72  1,29 55 56,51  0,84 45,46  1,38 72 59,13  0,96 48,32  1,48

So sánh với hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5, lượng Cisplatin giải phóng từ PAMAM dendrimer G4.5 tăng nhanh khoảng thời gian 24 (đạt 43,48%) Cisplatin tích lũy đệm PBS pH 7,4 (49,19 %) gần tương tự đệm ABS pH 5,5 lúc 72 Trong đó, Cisplatin giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G4.0-PAA 28,75% (trong 24h) thấp gần lần so với hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5 Qua cho thấy khác biệt cấu trúc nhóm chức bề mặt gây xu hướng nhả thuốc khác PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA

3.13 Động học trình giải phóng thuốc Cisplatin

Mơ hình động học phù hợp với giải phóng thuốc chọn lựa dựa theo tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) R2hc (R2 hiệu chỉnh) tính tốn phần mềm R

Bảng 3.13 Giá trị AIC R2hc theo mơ hình động học hệ mang thuốc Cisplatin pH 5,5 pH 7,4

G2.5-CisPt G3.5-CisPt G4.5-CisPt G4.0-PAA-CisPt

pH 5,5

Bậc R2hc 0,527 0,523 0,465 0,759

AIC 58,397 59,032 60,893 62,509

Bậc R2hc 0,638 0,641 0,585 0,875

AIC -15,041 -14,256 -11,745 -22,971

Higuchi R2hc 0,804 0,801 0,756 0,95

AIC 52,236 52,915 55,397 49,911

Korsmeyer-Peppas R2hc 0,964 0,961 0,9056 0,992 Thời gian (giờ)

% 5-FU giải phóng

G3.5-PNIPAM-CisPt PNIPAM-CisPt pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4

0 0 0

21

AIC -29,183 -28,682 -24,469 -38,636

Hixson Crowell R2hc 0,601 0,602 0,544 0,840

AIC 1,827 2,561 4,835 -3,071

pH 7,4

Bậc R2hc 0,493 0,506 0,577 0,892

AIC 54,611 57,251 57,843 54,069

Bậc R2hc 0,562 0,5986 0,675 0,943

AIC -19,490 -16,389 -15,440 -32,894

Higuchi R2hc 0,781 0,787 0,846 0,994

AIC 48,749 51,354 50,776 30,847

Korsmeyer-Peppas R2hc 0,953 0,929 0,948 0,994

AIC -28,110 -25,232 -24,412 -32,765

Hixson Crowell R2hc 0,539 0,5674 0,643 0,928

AIC -2,398 0,546 1,358 -12,494

Kết thực nghiệm cho thấy mô hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas phù hợp để giải thích chế giải phóng thuốc hệ chất mang Đây mơ hình đặc trưng cho q trình giải phóng thuốc từ hệ chất mang polymer

3.14 Dự đốn mơ hình dược động học hệ mang thuốc Hình 3.27 biễu diễn biến thiên nồng độ thuốc (dự đoán) máu theo thời gian, biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc đưa vào tuần hồn dạng cịn hoạt tính sau thời gian t Vùng đường cong nồng độ thuốc huyết tương (AUC) phản ánh mức độ phơi nhiễm thực tế thể với thuốc sau dùng liều thuốc biểu thị mg.giờ/L Kết tính tốn giá trị

AUC hệ mang thuốc Cisplatin khác (bảng 3.14) cho thấy hệ chất mang có khả giải phóng thuốc chậm dó làm tăng hiệu lực thuốc, giảm độ độc thuốc làm giảm tác dụng phụ thuốc

22

Bảng 3.14 Các thông số dược động học hệ mang thuốc Cisplatin

G4.0-PAA-CisPt G4.5-CisPt G3.5-CisPt G2.5-CisPt pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 Cmax (ng/mL) 15,92 13,75 19,19 16,46 16,51 14,80 15,86 11,92 AUC (mg.giờ/mL) 1,79 1,47 1,73 1,55 1,65 1,42 1,59 1,14

Tmax (giờ) 48-55 48-55 12 24 12-24 12 12-24 12

3.15 Kết bàn luận khả gây độc tế bào

3.15.1 Kết bàn luận khả gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5

PAMAM dendrimer carboxylate hóa tương thích tế bào, Cisplatin tự có độc tính cao giá trị IC50 1,00 ± 0,11 μg /mL ức chế 50% tăng trưởng tế bào Tuy nhiên, gắn vào hệ chất mang PAMAM dendrimer, độc tính tế bào Cisplatin giảm lần, giá trị IC50 3,23 ± 0,06 μg/mL trì hoạt động kháng tăng sinh đáng kể tế bào ung thư NCI-H460

Bảng 3.15 Độc tính tế bào in vitro Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5, Cisplatin phức chất PAMAM G4.5-Cisplatin

Mẫu Nồng độ

(g/mL)

Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460)

Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5 100 112,25  0,87% phát triển tế bào

Cisplatin 1,00 ± 0,11 Ức chế 50% phát triển tế bào

PAMAM G4.5-Cisplatin (34,01 %

Cisplatin) 3,23  0,06 Ức chế 50% phát triển tế bào 3.15.2 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang G4.0-PAA

Hình 3.22 Nồng độ Cisplatin (dự đoán) plamsa

0 10 15 20

0 50 100 150 200

C is pl at in tr on g pl as m a (n g/ m L )

Thời gian (giờ)

G2.5CisPt pH = 5,5 G3.5CisPt pH = 5,5 G4.5CisPt pH = 5,5

-2 13 18

0 50 100 150 200

C is pl at in tr on g pl as m a (n g/ m L )

Thời gian (giờ)

G2.5CisPt pH =7,4 G3.5CisPt pH =7,4 G4.5CisPt pH =7,4

0 10 15

0 40 80 120 160

C is pl at in tr on g pl as m a (n g/ m L )

23

Bảng 3.16 Độc tính tế bào in vitro PAMAM G4.0-PAA, Cisplatin phức chất PAMAM G4.0-PAA-Cisplatin

Mẫu Nồng độ (g/mL) Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460) PAMAM G4.0-PAA 100 115,40  3,57% phát triển tế bào

Cisplatin 0,98 ± 0,09 Ức chế 50% phát triển tế bào Phức G4.0-PAA-Cisplatin

(40,44 % Cisplatin) 2,88  0,08 Ức chế 50% phát triển tế bào

Hình 3.23 cho thấy khả gây độc tế bào PAMAM dendrimer G4.0 cao đáng kể so với PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0 với nhóm amine (-NH2) bề mặt có độ gây độc tế bào cao PAMAM dendrimer G4.5 với nhóm carboxylate (-COO-) bề mặt Nhìn chung, PAMAM dendrimer G4.5 khơng gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 khoảng nồng độ 30-150 ppm Ngược lại, tỷ lệ ức chế phát triển tế bào MCF-7 tăng tuyến tính với gia tăng nồng độ PAMAM dendrimer G4.0 Ngược lại, PAMAM dendrimer G4.0 nồng độ 92,15 ± 0,15 g/mL gây ức chế 50% phát triển tế bào Hình ảnh dịng tế bào ung thư vú MCF-7 chụp sau 48 ủ với PAMAM dendrimer G4.0 có tế bào màu cam với chấm nhân tế bào màu đỏ khơng có giếng nuôi cấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.5 nồng độ thử nghiệm (100 g/mL)

Tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào nguyên bào sợi cho số hệ chất mang nồng độ 100ppm để đánh giá mức độ tương hợp sinh học PAMAM dendrimer G4.0-PAA dùng làm hệ mang thuốc Trong đầu tiên, tất hệ chất mang dường không gây độc nguyên bào sợi (Hình 3.24) Tuy nhiên, sau 48 ni cấy mơi trường có chứa chất mang, PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA nồng độ 100 ppm cho kết tương tự thử nghiệm dòng tế bào MCF-7 Dendrimer cation (PAMAM dendrimer G4.0) thể độc tính dendrimer anion (PAMAM dendrimer G4.5 G4.0-PAA không gây độc nguyên bào sợi Khi có mặt PAMAM

24

dendrimer G4.0, tỉ lệ sống (%) nguyên bào sợi giảm mạnh 9,32 ± 1,07% tỷ lệ chết 100% ghi nhận vào thời điểm 168 Ngược lại, nguyên bào sợi nuôi cấy môi trường chứa G4.0-PAA PAMAM dendrimer G4.5 trì tỉ lệ sống 100%

Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) hoại tử (necrosis) sau xử lý với hệ mang thuốc khảo sát dựa phương pháp nhuộm kép AO/EB Hình ảnh quan sát kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang (hình 3.30) nhân màu vàng-xanh đỏ cam cho thấy PAMAM dendrimer G4.0 gây chết lượng lớn tế bào theo chương trình (apoptosis) Mức độ apoptosis PAMAM dendrimer G4.0 gây tương tự so với kiểm sốt dương tính Các ngun bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.0 có dạng hình cọc sợi ngắn hơn, mật độ thấp độ bám dính thấp so với tế bào ủ với kiểm sốt âm tính Hơn nữa, kết nối nguyên bào sợi biến có mặt PAMAM dendrimer cation G4.0 mơi trường ni cấy Mặt khác, nguyên bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA có hình thái đồng hiển thị huỳnh quang màu xanh tương tự kiểm sốt âm tính Những tế bào có hình dạng cọc sợi dài ổn định Các nguyên bào sợi cho thấy độ bám dính tốt kết nối tốt Như vậy, PAMAM dendrimer cation G4.0 gây hại cho tế bào MCF7 nguyên bào sợi Việc biến tính PAMAM dendrimer G4.0 với PAA làm giảm đáng kể độc tính PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.0-PAA không gây apoptosis tế bào MCF-7 ác tế bào thường Đặc điểm cho thấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA có ưu điểm vượt trội so với PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.5 ứng dụng làm chất mang thuốc điều trị ung thư

Hình 3.24 Tỷ lệ sống sót nguyên bào sợi người xử lý với hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, PAMAM dendrimer G4.0-PAA, Camptothecin

25

3.15.3 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang hai thuốc cispaltin 5-FU

Bảng 3.17 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 mẫu

Mẫu Nồng độ thử Tỉ lệ (%) gây độc tế bào

Lần Lần Lần TB ± ĐLC G3.5-NIPAM-5FU 100 µg/mL 68,17 69,57 68,41 68,72 ± 0,75 G3.5-NIPAM-CisPt-5FU 100 µg/mL 78,78 79,57 76,59 78,32 ± 1,55

PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5-FU có khả gây độc cho tế bào tương đối cao, khoảng 68,72% Không thế, việc mang đồng thời hai thuốc phức PAMAM dendrimer

26

5FU giúp cho hoạt lực ức chế tế bào tăng mạnh (78,78%) lượng Cisplatin PAMAM cao (35,22%) Điều chứng tỏ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU có hoạt tính chống ung thư hiệu

Bảng 3.18 Độc tính tế bào in vitro PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, 5-FU PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU

Mẫu Nồng độ (g/mL) Hoạt động tăng sinh

(dòng tế bào NCI-H460) PAMAM dendrimer G3.5 100 110,22 0,85% phát triển tế bào PAMAM G3.5-PNIPAM 100 115,22  0,98% phát triển tế bào

5-FU 2,6 ± 0,31 Ức chế 50% phát triển tế bào

G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU 1,625 ± 0,419 Ức chế 50% phát triển tế bào KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ kết nghiên cứu hoàn thành nội dung luận án, rút kết luận sau:

- Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến hệ G4.5 Sản phẩm PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 xác định cấu trúc phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR tính tốn khối lượng phân tử sở liệu phổ 1H-NMR

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin (9,63% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin (16,95% Cisplatin)

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (28,99% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (30,23% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (31,11% Cisplatin) Kết phân tích hàm lượng Pt ICP-MS cho thấy, phương pháp tổng hợp có hỗ trợ siêu âm hàm lượng Cisplatin phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (31,82% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (33,01% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (34,03% Cisplatin) cao so với phương pháp tổng hợp không sử dụng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ làm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin Sản phẩm dạng bột màu vàng nhạt

(4) Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành cơng hệ chất mang G3.5-PNIPAM Tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất mang G3.0-PNIPAM cho thấy khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20.43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác

27

(6) Kết chụp TEM đo DLS cho thấy hệ chất mang tổng hợp có kích nano phân bố đồng dung dịch

(7) Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc chậm ổn định điều kiện in vitro

(8) Các hệ chất mang phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU G4.0-PAA-Cisplatin làm giảm độc tính thuốc chống ung thư Cisplatin thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư

KIẾN NGHỊ

Khảo sát hoạt tính hệ Carboxylate PAMAM G3.5-PNIPAM, G4.0-PAA mang thuốc chống ung thư Cisplatin thể chuột mang khối u ung thư phổi Khảo sát khả gây độc chúng số dòng tế bào ung thư khác in vitro lẫn in vivo, đặc biệt dòng tế bào ung thư kháng Cisplatin

Khảo sát in vivo dược động học hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin Khảo sát khả mang đồng thời thuốc chống ung thư chứa Platin 5-FU hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM, PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, PAMAM dendrimer G4.0-PNIPAM PAMAM dendrimer G4.5-G4.0-PNIPAM

Đánh giá ảnh hưởng pH dung dịch lên khả gắn nhóm PAA vào PAMAM dendrimer G4.0

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.5-G3.5-Cisplatin có khơng có sử dụng sóng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ kết hợp với hỗ trợ siêu âmlàm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin

- Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM Đã tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20.43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác

- Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với tỉ lệ mol khác Đã tính tốn số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer tính KPLT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 15 nhóm thể khả mang thuốc Cisplatin tốt (40,44%) Phức G4.0-PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự (có IC50 cao gấp lần Cisplatin tự do) thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư thể khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5

28

- Các hệ chất mang phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU G4.0-PAA-Cisplatin làm giảm độc tính thuốc chống ung thư Cisplatin thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH

1 Ngoc Hoa Nguyen, Le Hang Dang, Dang Nam Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran,

Polyacrylic-conjugated polyamidoamine G4.0 dendrimer as a potetial nanocarrier for effectively delivery of Cisplatin, Bulletin of materials science (chấp nhận đăng: Nov 2020)

2 Phung Ngan Le, Ngoc Hoa Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Smart dendrimer-based nanogel for enhancing 5-fluorouracil loading efficiency against MCF7 cancer cell growth, Bulletin of Materials Science 39(6):1493-1500, 2016

3 Hoang Nguyen, Ngoc Hoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Improved loading method for Cisplatin in dendrimer carriers and behavior of the complex nanoparticles against NCI-H460 lung cancer cell, Int J Nanotechnology, Vol 15, N0 6, june 2015, pp 4106-4110 (5), 2015