Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tống hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib - combretastatin

Tubulin, là một protein thành phần cấu tạo lên các vi ống và là mục tiêu hấp dẫn để phát triển các loại thuốc trị liệu ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư. Tác dụng chống tăng sinh [r]

-o0o -

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –

COMBRETASTATIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM, KHÁNG UNG THƢ CÁC HỢP CHẤT LAI COXIB –

COMBRETASTATIN

Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số : 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1 PGS TS Ngô Quốc Anh PGS.TS Vũ Đình Hồng

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Quốc Anh PGS.TS Vũ Đình Hồng người thầy tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, bảo truyền động lực, niềm đam mê nhiệt huyết khoa học cho suốt thời gian thực luận án

Tôi xin trân thành cảm ơn thầy cô giảng dạy hướng dẫn suốt thời gian học tập làm việc

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Học viện Khoa học Cơng nghệ, phịng chun mơn, cán nghiên cứu phòng Nghiên cứu phát triển dược phẩm – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ủng hộ, giúp đỡ thời gian thực luận án

Cuối xin gửi lời tri ân tới gia đình, người thân, bạn bè ln bên, động viên tơi hồn thành luận án

Nghiên cứu sinh

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái niệm hợp chất lai

1.2 Tổng quan chất lai chống ung thƣ

1.2.1 Các hợp chất lai chống ung thư dựa chất ức chế tubulin 3

1.2.2 Các chất lai chống ung thư dựa hợp chất isatin 4

1.2.3 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất coumarin 5

1.2.4 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất steroid 5

1.2.5 Các chất lai chống ung thư dựa pyrrolo benzodiazepin 6

1.2.6 Một số chất lai theo chế khác 7

1.3 Khái niệm vai trò tubulin

1.4 Các chất lai chống ung thƣ dựa chất ức chế tubulin

1.4.1 Hợp chất lai dựa cấu trúc combretastatin (1) 9

1.4.2 Thuốc lai dựa cấu trúc colchicin (2) 10

1.4.3 Thuốc lai dựa cấu trúc podophyllotoxin 11

1.4.4 Hợp chất lai dựa cấu trúc chalcon 12

1.4.5 Thuốc lai dựa cấu trúc taxol 13

1.4.6 Thuốc lai dựa cấu trúc vinca alkaloid 14

1.5 Các hợp chất lai combretastatin 15

1.5.1 Tổng quan hợp chất combretastatin 15

1.5.2 Các chất lai combretastatin 21

1.6 Tổng quan chế COX2 pyrazol 25

1.6.1 Tổng quan chế COX2 25

1.6.2 Các hợp chất pyrazol 26

1.7 Mục tiêu luận án 29

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 31

2.1 Hóa chất thiết bị 31

2.1.1 Hóa chất dung mơi 31

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31

2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu 31

2.2.2 Tinh chế xác định cấu trúc 32

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32

2.3 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestatin 32

2.3.1 Tổng hợp dẫn chất este chất lai este coxib - combretastatin 32

2.3.1.1 Con đường tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestatin 32

2.3.1.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib- combrestatin33 Phản ứng tổng hợp theo sơ đồ sau: 33

2.3.1.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib - combrestatin 33

2.3.1.4 Kết quy trình tổng hợp 34

2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3 35

2.3.2.1 Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 35

2.3.2.2 Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 36

2.3.2.3 Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 36

2.3.2.4 Kết quy trình tổng hợp 36

2.3.3 Tổng hợp dẫn chất axit hợp chất lai coxib - combretastatin 37

2.3.3.1 Con đường tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combrestatin 37

2.3.3.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combrestatin 38

2.4.1.1 Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 40

2.4.1.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide 40

2.4.2 Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2 42

2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis 43

2.5.3.1 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342 43

2.5.3.2 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua Flow cytometry 43

2.5.3.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis caspase 44

2.4 Nghiên cứu docking phân tử 44

CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Thiết kế cấu trúc hoạt tính sinh học phân tử lai 47

3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai 47

3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai 48

3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin 49

3.3 Hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin 72

3.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin 73

3.3.2 Nghiên cứu chế kháng viêm kháng ung thư 78

3.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 78

3.3.2.2 Phân tích chu kỳ tế bào 79

3.3.2.3 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hai chất 82 và 102 81

3.4 Nghiên cứu docking phân tử 88

3.5 Thảo luận 95

KẾT LUẬN 96

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 98

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ

viết tắt

Tiếng Anh Tiếng Việt

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

CC Column Chromatography Sắc ký cột

HRMS High resolution Mass

Spectroscopy Phổ khối lượng phân giải cao

ESI-MS Electrospray Ionization Mass

Spectroscopy Phổ khối ion hóa phun điện

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

s Singlet Tín hiệu đơn

d Doublet Tín hiệu đơi

dt Triplet Tín hiệu ba

m Multiplet Cụm tín hiệu

dd Doublet doublet Tín hiệu đơi

dt Doublet triplet Tín hiệu đơi ba

MW Microwave Vi sóng

MeCN Acetonitril Et3N Trietylamin

EtOH Ethanol

AcOH Acetic acid Axit Acetic

L-Pro L-Propine

DMF Dimetyl focmamit t-BuOH tert-Butanol i-PrOH Iso Propanol BnNH2 Benzylamin

PPh3 Triphenyl phosphin MeOH Methanol

EtOAc Etyl acetate

(DHQ)2PH ALHydroquinin 1,4-phthalazinediyl diete

Et3SiH Trietyl silan

BF3.OEt2 Bo triflo etyl ete

Et2O Dietyl ete

NaH Natri hydrua Kiềm NaH

LiAlH4 Liti aluminium hydride Liti nhôm hydrua

CBr4 Carbon tetrabromide

Pd(PPh3)4 triphenylphosphine)palladium

NaCO3 Natri cacbonat Kiềm cacbonat

DME Dimethyl Ether

TBDMSCl tert-Buty (chloro)

dimethylsilane Ac2O Acetic anhydrit

SRB Sulforhodamine B DMSO Dimethylsulfoxide DMSO-d6 Dimethylsulfoxide-d6

UV Ultraviolet Tia cực tím

OD Optical Density Mật độ quang học

SRB Sulforhodamine B CA4 Combretastatin A4

AND Deoxiribonucleic acid Axit deoxiribonucleic

ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic

IC50 The half maximal inhibitory concentration

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú HT -29 Human breast carcinoma Ung thư đại tràng người DNA deoxyribonucleic acid đơn vị nucleotide

NO Nitric oxid oxit nitric

ROS Reactive oxygen species COX Cyclooxygenase enzyme PGE2 Prostaglandin E2

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Vị trí nhóm chất lai dạng este coxib - combretastatin 34

Bảng 2.2. Thống kê chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 37

Bảng 2.3. Vị trí nhóm chất lai dạng axit coxib - combretastatin 38

Bảng 3.1 Kết tổng hợp chất este từ chất 79 đến chất 98 50

Bảng 3.2. Kết tổng hợp chất 65, 102 62

Bảng 3.3 Kết tổng hợp dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122 62

Bảng 3.4 Tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng este ba dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 ức chế sản xuất NO 73

Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào hợp chất lai hóa dạng axit dạng este tế bào ung thư MCF-7 ức chế sản xuất NO 76

Bảng 3.6 Các chất lai có hoạt tính sinh học trội gây độc tế bào MCF7 78

Bảng 3.7. Ảnh hưởng hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 đại thực bào RAW 264.7 kích thích LPS 79

Bảng 3.8 Phần trăm tế bào theo pha hợp chất thử nghiệm với MCF7 80

Bảng 9. Phần trăm ngưng tụ phân mảnh nhân tế bào hợp chất 102 82 gây 82

Bảng 3.10 Hoạt tính caspase - 102 82 84

Bảng 3.11 Tỉ lệ tế bào apoptosis 85

Bảng 3.12. Lựa chọn mơ hình cấu trúc COX-2 tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình docking 88

Bảng 3.13 Tập hợp hợp chất thiết kế với điểm kết nối tương ứng hai mơ hình protein (kcal/mol) 90

Hình 1.4. estradiol (13) số hợp chất lai

Hình 1.5. PBD số hợp chất lai

Hình 1.6. Một số hợp chất lai theo chế khác

Hình 1.7. a) Các vị trí liên kết với tubulin

b) Cấu trúc trình trùng hợp, phân rã microtubule [30]

Hình 1.8 Cấu trúc số chất phân lập từ C caffrum

Hình 1.9. Cấu trúc số chất lai combretastatin 10

Hình 1.10. Cấu trúc số chất lai 11

Hình 1.11. Cấu trúc số chất lai 12

Hình 1.12. Cấu trúc số chất lai 13

Hình 1.13. Cấu trúc số chất lai taxol 13

Hình 1.14. Cấu trúc số chất lai vinca alkaloid 15

Hình 1.15 Cấu trúc stilben 15

Hình 1.16 Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1 phosphate (43) 16

Hình 1.17 Tổng hợp hợp chất mơ combretastatin 17

Hình 1.18 Các thành viên đại diện nhóm combretastatin 18

Hình 1.19 Cấu trúc khung combretastatin (55) cấu trúc isocombretastatin (56) 18

Hình 20 Combretastatin độc tế bào theo chế tubulin 20

Hình 1.21. Mơ hình liên kết CA4 (đỏ) COL (xanh dương) với tubulin 20

Hình 1.22 Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22) 22

Hình 1.23. Lamellarrin T combretstatin A-4 23

Hình 1.24. Lamellarrin D (62) combretstatin A-4 (1) 24

Hình 1.25. Lai Combretastatin-isocombretastatin (30) 24

Hình 1.27. hợp chất lai pyrazole - imidazopyrazole 28

Hình 1.29. Chất lai quinoline–pyrazole (73) 29

Hình 1.30. Chất lai pyrazole–thiadiazole (74) 29

Hình 2.1. Con đường tổng hợp hợp chất lai ghép dạng este 33

Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin 33

Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo hợp chất 79-98 35

Hình 2.4. Con đường tổng hợp hợp chất lai 36

Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin dang triflo 36

Hình 2.6 Công thức cấu tạo hợp chất 43, 102 37

Hình 2.7. Con đường tổng hợp hợp chất lai ghép dạng axit 37

Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit 38

Hình 2.9 Cơng thức cấu tạo hợp chất 103-122 40

Hình 3.1 Cấu trúc celecoxib, Combretastatin A4 hợp chất lai coxib - combretastatin 47

Hình 3.2 Đánh giá mức độ biểu PGE-2 hợp chất 102, 96, 81, 82, 94, Celecoxib nồng độ 20 µM đại thực bào RAW-264,7 sau 48 xử lý 79

Hình 3.3 Phân tích chu kỳ tế bào hợp chất thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 nồng độ 10 µM Celecoxib (65) nồng độ 30 µM MCF-7 81

Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 nhuộm Hoechst 33342 tác động mẫu nghiên cứu nồng độ khác 83

Hình 3.5. Tác động mẫu nghiên cứu đến q trình apoptosis tế bào thơng qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit Các mẫu thử phân tích hệ thống flowcytometry Trục x thể mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log 86

Hình 3.6. Các dạng liên kết hydro hợp chất với protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) chất 102 với COX-2; (B) Chất lượng 102 với tubulin; (C) chất 82 với COX-2; (D) Hợp chất 82 với tubulin 91

Hình 3.7. Vị trí gắn kết 2D hợp chất thiết kế với protein COX-2 PDB ID: 3LN1) tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) hợp chất 102 với COX-2; (B) hợp chất 102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX-2; (D) hợp chất 82 với tubulin 93

MỞ ĐẦU

Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào cách vơ tổ chức tế bào có khả xâm lấn mơ khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nhiều vị trí khác (di căn) Theo thống kê tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 nước có 300.000 người sống chung với ung thư, có 164.671 ca mới, 114.871 người tử vong bệnh Tồn cầu có khoảng 23 triệu người mắc, năm có 14 triệu người mắc triệu trăm nghìn người tử vong Tổ chức Y tế giới (WHO) xếp Việt Nam nằm 50 nước thuộc top đồ ung thư

Hiện nay, thuốc sử dụng thường theo chế tác dụng đơn lẻ, nhiều tác dụng phụ bắt đầu có biểu kháng thuốc, dẫn đến cần thiết tiếp tục nghiên cứu phát triển loại thuốc ung thư Gần việc phát triển thuốc chống ung thư có nhiều đích tác dụng vấn đề thời nhờ hiệu vượt trội so với mục tiêu [1-2] Hơn nữa, nghiên cứu lâm sàng ra, kết hợp nhiều loại thuốc với nhiều chế tác dụng khác thu hiệu cao cho bệnh nhân kháng thuốc [3] Do đó, thiết kế hợp chất lai kháng ung thư với nhiều đích tác dụng xu hướng Các hợp chất lai có khả tác động đồng thời lên nhiều đích tác dụng nhờ cấu trúc chúng có kết hợp nhiều phân tử thuốc riêng lẻ đặc điểm cấu trúc hóa học phân tử thuốc

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm hợp chất lai

Những đặc điểm trội kết hợp đa đích tác dụng điều trị lâm sàng bệnh nhân không đáp ứng thuốc dẫn đến hợp chất lai quan tâm nghiên cứu [3] Sự lai hóa phân tử hiểu theo nghĩa khái quát chiến lược thiết kế phối tử cách hợp lý để làm xuất cấu trúc chất mẫu dựa nhận biết đơn vị dược lý chất mẫu phát huy bảo tồn nguyên dẫn đến hợp chất lai thu giữ đặc tính tiêu biểu phiên gốc theo mục tiêu thiết kế ban đầu [6] Đây khái niệm thiết kế phát triển thuốc nhằm tạo hợp chất lai lực hiệu so với thuốc gốc đơn lẻ Sự lựa chọn đối tác lai ghép dựa đặc tính cấu trúc hoạt tính sinh học chất gốc Phân tử lai thu kết hợp hai dược chất phân tử với mục đích khuếch đại tác dụng thơng qua tác dụng đồng thời lên mục tiêu đơn lẻ đối vận tác dụng phụ chất gốc dẫn đến làm giảm tác dụng phụ phân tử lai [7-8]

1.2 Tổng quan chất lai chống ung thƣ

Sự không đồng khối u khả kháng thuốc dẫn đến hạn chế điều trị hóa xạ trị, địi hỏi phương pháp tiếp cận nhằm kích hoạt nhiều mục tiêu để tăng tính hiệu thuốc điều trị Chiến lược hợp chất lai

đã bước đầu đáp ứng hạn chế mơ hình in vitro thể qua

nhiều cơng trình nghiên cứu Nhiều chế tác dụng cấu trúc mẫu sử dụng làm chất gốc Tuy nhiên phân loại chất lai dựa số nhóm chất tiêu biểu liệt kê sau đây:

1.2.1 Các hợp chất lai chống ung thư dựa chất ức chế tubulin

Hình 1.1 Các chất ức chế tubulin sử dụng thuốc lai chống ung thư 1.2.2 Các chất lai chống ung thư dựa hợp chất isatin

Isatin (7) hợp chất khung indol, thân isatin dẫn xuất có nhiều đặc tính sinh học kháng u, kháng khuẩn, chống viêm, giảm đau, chống vi khuẩn [9] Isatin lai hóa với nhiều chất khác uracil [10], triazol [11]

và thu chất lai uracil – isatin (8) [12], isatin – triazol (9) [12] hợp

Hình 1.2. Isatin số hợp chất lai 1.2.3 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất coumarin

Coumarin (10) lần phân lập từ đậu tonka cỏ ba vào năm 1820 [13] Coumarin biết đến với khả chống ung thư, kháng viêm, kháng virus [14] Một số sản phẩm lai coumarin coumarin - pyrazolin (11) [15], coumarin-stilben (12) [16] thể mạnh khả chống ung thư hoạt chất coumarin đồng thời thu nhận thêm hoạt tính đối tác lai

Hình 1.3. Coumarin số hợp chất lai 1.2.4 Các chất lai chống ung thư dựa nhóm chất steroid

Hình 1.4. estradiol (13) số hợp chất lai 1.2.5 Các chất lai chống ung thư dựa pyrrolo benzodiazepin

Pyrrolo [2,1-c] [1,4]-benzodiazepin (16) (PBD) nhóm kháng sinh, kháng

ung thư tự nhiên có hiệu lực mạnh tạo từ loài Streptomyces khác

Nhiều hợp chất tương tự PBD tổng hợp nhằm tăng hiệu lực tác dụng chống lại tế bào ung thư [21] số hợp chất lai benzothiazol - pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepin - - one (17) [22], bisindol - pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepin (18) [23] thể hoạt tính trội kháng ung thư chất đầu PBD chất đối tác

1.2.6 Một số chất lai theo chế khác

Một số chất lai chưa thống kê theo chế cụ thể psorospermin/ quinobenzoxazin (19) [24], norindenoisoquinolin - camptothecin [25], benzofuran - imidazol (20) [26] (Hình 1.6) quan tâm thu nhiều kết hoạt tính thú vị

Hình 1.6. Một số hợp chất lai theo chế khác

Tuy nhiên, định hướng mục tiêu luận án, nhóm nghiên cứu tâp chung phát triển chất lai chống ung thư dựa chế ức chế tubulin

1.3 Khái niệm vai trò tubulin

Tubulin, protein thành phần cấu tạo lên vi ống mục tiêu hấp dẫn để phát triển loại thuốc trị liệu ức chế tăng sinh tế bào ung thư Tác dụng chống tăng sinh chúng chủ yếu cách ngăn chặn trình nguyên phân can thiệp vào trình động học vi ống Các phân tử protein sinh học tubulin hình

thành thơng qua q trình trùng hợp dị phân tử α- β-tubulin Sự phá vỡ

các trung tâm khác tubulin Có trung tâm hoạt động tubulin: trung tâm colchicin, trung tâm vinca - alkaloid, trung tâm taxoid Các hợp chất combretastatin cho tác động lên trung tâm colchicin [28-29] Colchicin loại thuốc chống phân bào, tác dụng ức chế phân bào kì nguyên phân liên kết với tubulin để tạo thành phức hợp tubulin - colchicin sau liên kết với đầu vi ống để ngăn chặn kéo dài polymer vi ống Ở nồng độ thấp, colchicine ngăn chặn tăng trưởng vi ống nồng độ cao hơn, colchicin thúc đẩy trình phân rã vi ống Colchicin định dạng chất gốc dùng để so sánh đưa chế tác dụng lên miền liên kết tubulin chất

a

b

Hình 1.7. a) Các vị trí liên kết với tubulin

b) Cấu trúc trình trùng hợp, phân rã tubulin [30] 1.4 Các chất lai chống ung thƣ dựa chất ức chế tubulin

mục tiêu tubulin có nhiều chất ức chế tubulin sử dụng để tổng hợp phân tử lai như: combretastatin, colchicin, podophyllotoxin, chalcon, taxol, vinca alkaloid

1.4.1 Hợp chất lai dựa cấu trúc combretastatin (1)

Combretastatin (21) thuộc nhóm hợp chất phân lập từ vỏ rễ

thân Combretum caffrum Nam Phi Các phần tử phân lập vào

năm 1982 (Hình 1.8) Các thực vật họ Combretaceae bao gồm 600 loài

phân chia thành 20 chi [31] Họ bụi Combretaceae phổ biến rộng rãi sử dụng y học cổ truyền Châu Phi Ấn Độ theo nhiều công dụng khác làm thuốc trị tim mạch, băng bó vết thương, điều trị bệnh tâm thần, bọ cạp cắn Loài

Combretum latifolium dùng để điều trị ung thư [32-33]

Hình 1.8 Cấu trúc số chất phân lập từ C caffrum

Một số hợp chất tự nhiên phân lập từ C caffrum có hoạt tính sinh học

đáng ý ức chế ngưng kết tubulin, ức chế dòng tế bào ung thư người [34-36] Trong combretastatin A-4 (1), chất thể độc tính tế bào mạnh lại có cấu trúc đơn giản

Hình 1.9. Cấu trúc số chất lai combretastatin 1.4.2 Chất lai dựa cấu trúc colchicine (2)

Colchicin (2) alkaloid tự nhiên phân lập từ Colchicum autumnale

Hình 1.10. Cấu trúc số chất lai colchicine

1.4.3 Chất lai dựa cấu trúc podophyllotoxin

Podophyllotoxin (3) lignan, lần phân lập Podwyssotzki

vào năm 1880 từ hỗn hợp nhựa gọi Podophyllin Hỗn hợp thu từ rễ

khô thân rễ thân thảo Bắc Mỹ lâu năm loài Podophyllum như P

podophyllotoxin cụ thể chất lai bisepipodophyllotoxins (34) [49], acrylamidopodophyllotoxin (35) [50]

Hình 1.11. Cấu trúc số chất lai podophyllotoxin

1.4.4 Hợp chất lai dựa cấu trúc chalcone

Chalcone (4) loạt propenon biaryl thuộc họ flavonoid thể số đặc tính sinh học thú vị chống oxy hóa, độc tính mạnh số dòng tế bào ung thư, kháng khuẩn Chalcon thể ức chế tăng sinh tế bào thơng qua tương tác với tubulin vị trí liên kết colchicin [51] Xoay quanh cấu trúc chalcon nhiều nhóm nhà khoa học giới tiếp tục tìm kiếm sàng lọc hoạt tính [52-54] Một lớp chất lai chalcon – dihydrobenzofuran (36) nghiên cứu thu kết trội hoạt tính số dịng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

PC -3, ung thư ruột kết HT -29 ung thư đại tràng B -16 [53], hay chalcon –

Hình 1.12. Cấu trúc số chất lai chalcone

1.4.5 Thuốc lai dựa cấu trúc taxol

Các hợp chất taxol (5) bắt nguồn từ Taxus brevifolia sản phẩm bán

tổng hợp sử dụng lâm sàng để điều trị ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt ung thư phổi tế bào nhỏ, có tác dụng

gây ổn định vi ống bắt giữ chu kỳ tế bào dẫn đến chu trình chết apoptosis [55]

Wittman cộng (2001) với báo cáo mẫn cảm dòng tế bào kháng paclitaxel - cisplatin (38) dẫn tới mục tiêu thiết kế phân tử chất lai kết hợp tác nhân alkyl hóa với paclitaxel để mở rộng cơng dụng điều trị paclitaxel tới kháng khối u [56], discodermolid - Paclitaxel (39) thể hoạt tính gấp hai đến tám lần so với phân tử gốc với dòng tế bào ung thư A549 MCF-7 [57] nhiều chất lai dựa cấu trúc thu kết lý thú [58-61]

những lớp chất chống ung thư quan trọng thử nghiệm lâm sàng Vinca alkaloid có tác dụng ức chế vi ống cách liên kết chéo giao diện dimer, chúng bóp méo cách mạnh mẽ sợi protofilament làm cho tubulin hình thành polyme xoắn ốc thay [62-63] Hiện có vinca alkaloid

chính sử dụng lâm sàng cho bệnh nhân ung thư như: vinblastin, vinorelbin,

Hình 1.14. Cấu trúc số chất lai vinca alkaloid 1.5 Các hợp chất lai combretastatin

1.5.1 Tổng quan hợp chất combretastatin

Combretastatin thuộc lớp chất cis - stilben, nguồn phong phú hợp

chất dẫn đường việc tìm kiếm loại thuốc mới, hợp chất điển resveratrol combretastatin A-4 phosphate thử nghiệm để điều trị bệnh Alzheimer ung thư lâm sàng Các stilbene phân lập gần cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét, gây độc tế bào, bảo vệ gan chống viêm

Về mặt cấu trúc, stilben có dạng cấu hình trans-stilben cis-stilben, dạng

trans-stilben không bị cản trở không gian, cis-stilben bị cản trở mạnh Dạng

cấu hình cis cho thường ổn định tồn dạng trans Đối với

stilben dạng cho thấy nhiệt độ nóng chảy cấu hình chênh

lệch rõ rệt, (E) -Stilben có điểm nóng chảy khoảng 1250C, điểm nóng chảy

của (Z) -stilben 60C

Hình 1.15 Cấu trúc stilben

Hợp chất combretastatin A-4 (CA4) (1) chất chống phân bào mạnh, xem đích tác dụng, ức chế trùng hợp tubulin Tuy nhiên, có độc tính nhiều hoạt tính tubulin, lý chưa biết rõ, nhanh chóng ưu tiên

phá vỡ q trình tế bào trong nội mơ chu trình trùng hợp tubulintrên mơ

Hình 1.16 Cấu trúc combretastatin A-4 phosphate (42), combretastatin A-1 phosphat (43)

Nhiều hợp chất (Hình 1.17) tổng hợp mô cấu trúc

combretastatin có CA4 CA1 [34, 65, 67] Một loạt dẫn chất combretastatin tổng hợp dựa thay đổi nhóm chức vịng A B

đã thiết kế giữ nguyên cầu ethylen Với xuất nhóm

như nitro, amino, muối amino acid, chất dẫn xuất thay 2-nitơ, 3-azido, dẫn xuất 4-methylenedioxy-3-amino, 3-fluoro, 4-methyl, 3, 4,5-trimethyl

[70-76] Nhiều dẫn chất combretastatin dựa ý tưởng biến đổi cấu trúc từ khung

Hình 1.17 Tổng hợp hợp chất mô combretastatin

Tương quan gữa cấu trúc hoạt tính sinh học

Các combretastatin chia thành bốn nhóm sở đặc điểm cấu

trúc nó: Dãy A (cis - stilben) cụ thể chất combretastatin A ví dụ CA1 (8),

Dãy B (diaryl-ethylen) điển combretastatin B ví dụ CB1 (25), Dãy C –

phenanthren điển combretastatin C ví dụ hydro-2,3,6-

trimethoxylphenantherene -1,4-dion (53) , Dãy D (lacton vịng lớn) điển combretastatin D ví dụ cobretastatin D-2 (CD2) (54) Các thành viên đại diện

Hình 1.18 Các thành viên đại diện nhóm combretastatin

Hình 1.19 Cấu trúc khung combretastatin (55) cấu trúc isocombretastatin (56)

Theo cấu trúc mơ hình 1.19, thay đổi cấu trúc vị trí nhóm vịng A, B hay cầu C làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học hợp chất:

Vòng A: Các thay đổi vịng A nhìn chung làm giảm hoạt tính kháng ung thư, nhóm trimethoxybenzen cần thiết cho tác dụng độc tế bào Khi thay 4-metoxy phenol dẫn đến làm giảm hoạt tính, ức chế trùng hợp tubulin khơng thay đổi Thậm chí tăng kích thước ether vị trí dẫn đến phá hủy khả độc tế bào giảm khả ức chế trùng hợp tubulin Có thể thấy nhóm - methoxy dường quan trọng khả thể hoạt tính chất, cụ thể giải thích ảnh hưởng mạnh mẽ đến tương tác với đầu colchicin tubulin

Vòng B: Vòng B nhân phenyl mang nhóm OH, NH2, NO2,

NHCOR, F, Cl, Br, OCH3, N3 dị vòng pyridin, indol, quinolin, naphtalen,…

methoxy xung quanh vòng thay nhóm halogenua, alkyl- chứa nitơ làm giảm hoạt tính nghiêm trọng khung chất Việc đảo ngược nhóm methoxy hydroxy tạo isocombretastatin (56) làm cho nhóm chất thay đổi tương tác vị trí colchicin [80] Các isocombretastatin thể khả hòa tan nước tăng gấp 30 lần so sánh với CA4 (1), ức chế mạnh trình trùng hợp tubulin gây độc tế bào chống lại số dịng tế bào ung thư người khơng phụ thuộc vào kích thước vịng B Mặt khác, thay ortho thành nitơ gây giảm hiệu lực quan trọng Những kết cho thấy việc thay đổi cấu trúc thiết kế phối tử vị trí colchicin glycosyl hóa vị trí dẫn đến làm tăng giảm rõ rệt chọn lọc hoạt tính hợp chất [81]

Cầu C: liên kết đơi có cấu dạng hình học E cần thiết cho hoạt tính kháng ung

thư, liên kết đơi mang nhóm khác thay nhóm carbonyl, amit, sulfonat, dị vòng pyrazol, thiazol, triazol, tetrazol, imidazol, furanzan, arylcourmarin, …

Cơ chế tác dụng combretastatin

Hình 20 Combretastatin độc tế bào theo chế tubulin

Cơ chế gây độc tế bào combretastatin dãy A (cis-stilben) dãy B (diaryl

-ethylen) liên quan đến cấu hình cis Hoạt tính dãy C (quinon) dãy D (lacton

vòng lớn) mà khơng cịn cấu hình cis yếu nhiều lần so với dãy A B Cấu

trúc biến đổi combretastatin vòng benzen khác ảnh hưởng khơng đáng hoạt tính

Hình 1.21. Mơ hình liên kết CA4 (đỏ) COL (xanh dương) với tubulin

Một số hợp chất Combretastatin thử nghiệm lâm sàng

với carboplatin paclitaxel; ung thư đại trực tràng, kết hợp với iodine - kháng thể A5B7 [84-89]

Combretastatin A-4 (CA4) xem tác nhân gây độc tế bào tiềm ức chế mạnh trùng hợp vi ống cách gắn vào điểm gắn kết colchicin tubulin CA-4 có độc tính cao nhiều mơ hình tế bào ung thư, cấu

trúc mục tiêu quan tâm Từ kết nghiên cứu in vitro ban

đầu, CA4 (được đặt tên hoạt chất fosbretabulin, biệt dược ZYBRESTAT) phát triển [90] thử nghiệm lâm sàng Công ty Oxigene việc điều trị số bệnh ung thư ung thư tuyến giáp, ung thư buồng trứng kháng Platinum ung thư phổi không tế bào nhỏ

1.5.2 Các chất lai combretastatin

Nhiều chất lai combretastatin nghiên cứu với mục tiêu giữ lại độc tính tế bào trội combretastatin thu nhận thêm hoạt tính đối tác lai đồng thời giảm tác dụng phụ chất gốc

Cụ thể với cấu trúc lai combretastatin với steroid độc tính mạnh với tế bào ung thư thể chất lai có tác dụng kháng viêm hợp chất steroid Parihar cộng tổng hợp thành công chất lai combretastatin – estradiol

(28), estradiol (57) nhóm aryl thứ hai combretastatin (Hình 1.22)

[91-92] Các chất lai đánh giá độc tính tế bào chống lại dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7 & MDA-MB 231) Các hợp chất thể hoạt động chống ung thư đáng kể chống lại tế bào ung thư vú ER dương tính ER âm tính hiển thị giá trị

IC50 7.5µM 5.5 µM với MCF-7 MDA-MB-231 cho thấy tác dụng ức

Hình 1.22 Lai Combretstatin A-4 – Steroid (21, 22)

Các alkaloid lamellarin có tác dụng kháng virus kháng ung thư cho theo chế topoisomerase I [93] Banwellet cộng (2006) thiết kế loạt hợp chất lai combretastatin với alkaloid lamellarin (59) Sản phẩm thu 4, – diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylate thể mạnh hoạt tính chống phân bào

combretastatin A-4 (1) alkaloid lamellarin (Hình 1.23) [94] Nhóm tác giả giải

thích đặc tính chống phân bào độc tế bào lớp chất lai thể mạnh cấu trúc lai có liên kết miền colchicin tubulin Nhóm tác giả với cấu trúc lai thu giữ nhóm -trimethoxyaryl (các dẫn xuất 29, 60) tương tự combretastatin có hoạt tính độc tế bào mạnh tương đương

combretastatin Riêng dẫn xuất khơng cịn chứa –trimethoxyaryl (như chất 61)

Hình 1.23. Lamellarrin T combretstatin A-4

Lamellarrin D (62) biết đến chất ức chế topoisomerase I mạnh gây apoptosis thông qua đường ty thể [93] Các chất lai combretstatin A-4 với Lamellarrin D với mong muốn lai ghép hợp chất đem đầy đủ đặc tính chất gốc này, nhóm nhà khoa học Shen cộng (2010) lai hóa thành cơng hợp chất lai combretstatin A-4 (1) - Lamellarrin D (62) Sản phẩm chất lai thu

được (chất 63) thể hoạt tính chống lại dịng tế bào ung thư người ung

Hình 1.24. Lamellarrin D (62) combretstatin A-4 (1)

Rasolofonjatovo cộng (2010) tổng hợp loạt giống lai

triarylolefin mang cấu trúc CA4 - isoCA4 (30) (Hình 25) với mục đích kết hợp

tác dụng chống ung thư CA4 (1) isocombretastatin A-4 (isoCA4) (56) cấu trúc đơn lẻ [40] Các chất thu thể hoạt tính gây độc tế bào chống lại dịng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết người (HCT-116) Việc sử dụng isoCA4 (56) CA4 (1) hợp chất tham chiếu cho thấy hoạt tính kháng tubulin sản phẩm thu

Có thể thấy nhiều nghiên cứu hợp chất lai bước đầu thu kết hoạt tính phong phú khẳng định xu hướng lai hóa phân tử lựa chọn cho tiền đề phát triển thuốc kháng ung thư hiệu

1.6 Tổng quan COX2 pyrazol

1.6.1 Tổng quan chế COX2

Cyclooxygenase-2 enzym đóng vai trị quan trọng nhiều chức sinh học khác nhau, đặc biệt chế giảm đau, viêm nhiều vai trò khác làm cho trở thành phân tử quan tâm mục tiêu Enzyme COX2 tạo q trình viêm ung thư mà khơng có mặt tổ chức bình thường Do đó, ức chế chọn lọc COX2 làm giảm đáng kể tác dụng phụ bao gồm tổn thương đường tiêu hóa tác dụng độc gan NSAID truyền thống aspirin, ibuprofen, v.v Những phát triển gần chất ức chế COX2 chủ yếu tập trung vào việc cải thiện số chọn lọc thuốc chế ức chế COX2 với việc nâng cao hiệu lực thuốc cách sửa đổi thành phần [95]

Pyrazol dị vịng có năm cạnh tạo thành nhóm hợp chất đặc biệt hữu ích tổng hợp hữu Chúng nhóm hợp chất nghiên cứu nhiều họ azol Rất nhiều phương pháp tổng hợp báo cáo nhiều năm, diện nhân pyrazole cấu trúc khác dẫn đến ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực công nghệ, y học nông nghiệp Đặc biệt, chúng mô tả chất ức chế trình glycation, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống trầm cảm, chống viêm, chống lao, chống oxy hóa chất kháng virus [97-98]

Hình 1.26. Phương pháp tiếp cận thiết kế pyrazol chất ức chế chọn lọc COX2

được sử dụng chất khung để thiết kế phân tử với mục tiêu điều trị viêm Trong celecoxib chất thương mại bán rộng rãi thị trường chứa nhóm pyrazol chất ức chế mạnh chọn lọc COX2 [99]

Celecoxib

Celecoxib (65) (Celebrex®, Onsenal®), chứng minh với tác dụng chống viêm giảm đau Đây tác dụng nghiên cứu ứng dụng lâm sàng nhờ đặc tính an tồn tác dụng phụ

Cơ chế tác dụng Celecoxib

Celecoxib (65) thuốc ức chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động prostaglandin gây q trình viêm đau mà khơng tác dụng lên prostaglandin COX1 có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa

Thử nghiệm tiền lâm sàng chứng minh hoạt tính chống khối u celecoxib

trên người Celecoxib ức chế tăng sinh mơ hình in vitro tế bào ung thư vú

người MCF-7 MDAMB-231 Ngoài ra, celecoxib hợp chất liên quan gây bắt giữ chu kỳ tế bào giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu trình apotosis, ức chế phát triển khối u ngăn chặn hình thành mạch khối u khơng có diện COX2 [4-5]

Hai tác dụng dược lý, ức chế COX2 ức chế phát triển khối u đồng thời tìm thấy khía cạnh cấu trúc khác phân tử celecoxib Những phát làm cho celecoxib trở thành hợp chất hàng đầu hấp dẫn để phát triển chất chống ung thư

1.6.3 Các hợp chất lai pyrazol

Hình 1.27. hợp chất lai pyrazol - imidazopyrazol

Surendra R cộng (2018) tổng hợp thành cơng chất KSS-19 (72) (Hình

1.28), dạng lai hóa celecoxib - combretastatin thể liên kết chặt chẽ với vị trí hoạt động COX2 ức chế tubulin miền colchicin Nhóm chất KSS-19 (72) cho thấy hoạt động chống tăng sinh mạnh mẽ chống lại dòng tế bào ung thư HT29 [101]

Hình 1.28. Tổng hợp KSS-19 (72)

Hình 1.29. Chất lai quinolin – pyrazol (73)

Hợp chất lai pyrazol – thiadiazol (73) biết đến với hoạt động chống viêm mạnh mẽ thông qua chế chọn lọc COX2 [103] Các sản phẩm lai thể tốt ức

chế COX2 với giá trị IC50 tương ứng 1.33-17.5 μM

Hình 1.30. Chất lai pyrazol – thiadiazol (74) 1.7 Mục tiêu luận án

Luận án có mục tiêu cụ thể sau:

1 Thiết kế cấu trúc hợp chất lai coxib - combretastatin Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin

CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất thiết bị

2.1.1 Hóa chất dung mơi

Các hóa chất cung cấp cơng ty hóa chất thương mại (Merck, Sigma Aldrich, Chemleader Biomedical, Xilong Scientific) Các hóa chất sử dụng: Deoxybenzoin (2-Phenylacetophenone), 4′-Chloro-2-phenylacetophenone, Desoxyanisoin, Benzyl 4-bromophenyl ketone, Benzyl 4-hydroxyphenyl ketone, Benzyl 2,4-dihydroxyphenyl ketone, 1-(4-Fluorophenyl)-2-phenyl-ethanone, Diethyl oxalate, Ethyl chlorooxoacetate, 4-Methoxyphenylhydrazine hydrochloride,

2′-Hydroxy-2-phenylacetophenone, 4-Methoxyphenylhydrazine hydrochloride,

2-Fluorophenylhydrazine hydrochlorid, 4-Chloro-3-nitroaniline, acid tetroic… hãng

Chemleader Biomedical Các aldehyde , benzadehy,…., NaH, LiAlH4, NaBH4,

3,5-imethoxyaniline từ Sigma Aldrich THF Merck làm khan phương pháp cất lại sử dụng Na/Benzophenone, Dioxane xuất xứ Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức) đo 1H-NMR

(500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), HSQC, HMBC Thiết bị phân tích phổ khối lượng

MS HRMS X500R-QTOF MS hãng SCIEX Các phép đo thực Viện hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Cơng Nghệ Việt nam Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tổng hợp hữu

Sử dụng phản ứng tổng hợp hữu phương pháp khử hợp chất hữu

cơ sử dụng: LiAlH4, Pd/C/HCOOH-NEt3, CoCl2/NaBH4, Ni2B/NaBH3CN, Khử

Sắc ký lớp mỏng: Silica gel 60 F254 nhôm từ hãng Meck Các chất phát ánh sáng tia cực tím bước sóng 254 nm 365 nm Sắc ký cột: Sắc ký cột thực với silica gel 60 cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm/70 – 230 mesh ASTM từ MACHEREY – NAGEL Chiều dài đường kính cột silica gel phụ thuộc vào số lượng chất độ khó tách biệt Phương pháp xác định cấu trúc: Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phương pháp khối phổ MS, HR-MS

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học hợp chất nghiên cứu theo phương pháp gây độc tế bào Monks (1991) [169] ba dòng tế bào ung thư vú MCF7, ung thư đại trực tràng HT29 ung thư gan HepG2 phép thử ức chế sản sinh NO phịng thử hoạt tính Sinh học, Viện Hóa học Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phép thử thử nghiệm apoptosis thực Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Tại Khoa Dược Trường Đại học Perugia, Italy, Cộng Hịa Liên Bang Đức [104] Phương pháp mơ hình mơ phân tử docking thực Viện Hợp chất thiên nhiên, viên Hàn Lâm KHCN Việt Nam

2.3 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin -

2.3.1 Tổng hợp dẫn chất este chất lai este coxib - combretastatin

Hình 2.1. Con đường tổng hợp hợp chất lai ghép dạng este

2.3.1.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib- combrestatin

Phản ứng tổng hợp theo sơ đồ sau:

Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este hợp chất lai hóa coxib - combrestastatin

(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetat (1 mmol,

1 eq) (77), ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, ml C2H5OH khan;

phenylhydrazin (1 mmol, eq) (78)

2.3.1.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất este chất lai coxib - combretastatin

Mô tả quy trình chung:

Sản phẩm thu qua hai giai đoạn phản ứng

Giai đoạn 1: Tổng hợp muối lithium hợp chất trung gian

Cho vào bình phản ứng chất đầu 76 (1 mmol), thêm Ethyl chlorooxoacetat (1,2

mmol), 240 mg t-BuOLi (3 mmol) (77), ml THF Phản ứng đun hồi lưu

dịch phản ứng thêm vào 0,34 ml dung dịch HCl (4 mmol, đương lượng) khuấy nhiệt độ thường 10 phút Thực phản ứng với hydrazin (1 mmol, đương lượng) (78): Methoxyphenylhydrazine hydrochlorid, (Trifluoromethyl) phenylhydrazin, Cyanophenylhydrazin hydrochloride, 4-Nitrophenylhydrazin, 4-sulfonamidophenylhydrazin hydrochlorid vào hỗn hợp tiếp tục khuấy 10 phút nhiệt độ Sau phản ứng đun hồi lưu

Hỗn hợp phản ứng sau chiết CH2Cl2, làm khan, phần hữu đem lọc qua

bột celite cô đuổi dung môi áp suất thấp 200C thu sản phẩm rắn thô

Sản phẩm (79-98) tinh chế sắc ký cột hệ dung môi ethyl acetate : n

-hexan

2.3.1.4 Kết quy trình tổng hợp

Sản phẩm thu 20 hợp chất lai với vị trí nhóm cụ thể thống kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Vị trí nhóm chất lai dạng este coxib - combretastatin

STT Ký hiệu chất R’ R’’ R

1 79 H H OCH3

2 80 H H CF3

3 81 H H NC

4 82 H H NO2

5 83 H H NH2SO2

6 84 OCH3 OCH3 OCH3

8 86 OCH3 OCH3 NC

9 87 OCH3 OCH3 NO2

10 88 OCH3 OCH3 NH2SO2

11 89 H Br OCH3

12 90 H Br CF3

13 91 H Br NC

14

92

H Br NO2

15 93 H Br NH2SO2

16 94 H OH NH2SO2

17 95 H 2OH NH2SO2

18 96 H F NH2SO2

19 97 H Cl NH2SO2

20 98 H OCH3 NH2SO2

Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo hợp chất 79-98 2.3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3

2.3.2.1 Con đường tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Hình 2.4. Con đường tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 2.3.2.2 Phản ứng tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 (a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) NaH (2,5 eq) THF (5 mL),

6 h (b), EtOH (5 mL), axit (1.0 eq); arylhydrazin hydrochlorid 78 (1.0 mmol)

thêm liên tiếp vào cặn hồi lưu Chất 102 phân lập qua sắc ký cột

2.3.2.3 Quy trình tổng hợp chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

Mơ tả quy trình chung:

Trong thí nghiệm tiến hành với chất 100 (1,0 mmol), etyl trifluoroacetat (99) (1,2 đương lượng) NaH (2,5 đương lượng) THF khan (5 mL) (b) 8, EtOH (5 mL), axit (1,0 đương lượng) arylhydrazin hydroclorid 78 (1,0 mmol) thêm liên tiếp vào cặn hồi lưu Sản phẩm 102 phân lập qua sắc ký cột

Hình 2.6 Cơng thức cấu tạo hợp chất 65, 102

Bảng 2.2 Thống kê chất lai coxib - combretastatin chứa nhóm CF3

STT Ký hiệu chất R1 R2 R3 R

1 Celecoxib(65) H CH3 H SO2NH2

2 102 OCH3 OCH3 OCH3 SO2NH2

2.3.3 Tổng hợp dẫn chất axit hợp chất lai hóa coxib - combrestatin

2.3.3.1 Con đường tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combrestatin

Con đường tổng hợp thiết kế theo sơ đồ sau:

Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép coxib - combretastatin dạng axit

(i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetat (1 mmol,

eq), ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, ml C2H5OH khan; phenylhydrazin (1

mmol, eq) (78) Sản phẩm thu sau phân lập qua sắc ký cột hòa tan

hệ dung môi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau NaH (1,2 eq) thêm vào hỗn hợp

Thực phản ứng 3h thu chất lai hóa dạng axit 103-122

Bảng 2.3 Vị trí nhóm chất lai dạng axit coxib - combretastatin

STT Ký hiệu chất R’ R’’ R

1 103 H H OCH3

2 104 H H CF3

3 105 H H NC

4 106 H H NO2

5 107 H H NH2SO2

6 108 OCH3 OCH3 OCH3

8 110 OCH3 OCH3 NC

9 111 OCH3 OCH3 NO2

10 112 OCH3 OCH3 NH2SO2

11 113 H Br OCH3

12 114 H Br CF3

13 115 H Br NC

14

116

H Br NO2

15 117 H Br NH2SO2

16 118 H OH NH2SO2

17 119 H 2OH NH2SO2

18 120 H F NH2SO2

19 121 H Cl NH2SO2

20 122 H OCH3 NH2SO2

2.3.3.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất axit chất lai coxib - combretastatin

Mô tả quy trình chung:

Sản phẩm thu qua ba giai đoạn phản ứng:

Giai đoạn 1: Cho vào bình phản ứng chất đầu 76 (1 mmol), thêm chất Ethyl

chlorooxoacetat (1,2 mmol), 240 mg t-BuOLi (3 mmol), ml THF Phản ứng đun

hồi lưu Kiểm tra phản ứng sắc ký mỏng Hỗn hợp phản ứng thu loại bỏ dung môi để thực cho phản ứng

Giai đoạn 2: Cho sản phẩm trung gian muối lithium (1 mmol, đương lượng) vào

bình phản ứng chứa ml C2H5OH khan, dung dịch phản ứng thêm vào 0,34 ml

4-dung môi áp suất thấp 200C thu sản phẩm rắn thô Sản phẩm (79-98)

được tinh chế sắc ký cột hệ dung môi ethyl acetat : n-hexan

Giai đoạn 3: Sản phẩm 79-98 hịa tan hệ dung mơi THF / MeOH /

H2O = 3: 1: , sau NaH (2,5 đương lượng) thêm vào Hỗn hợp phản

ứng tiếp tục khuấy nữa, sản phẩm trung hòa axit HCl 3N Hiệu suất thu qua sắc ký cột chất rắn, đem xác định cấu trúc

2.3.3.4 Kết quy trình tổng hợp

Hình 2.9 Cơng thức cấu tạo hợp chất 103-122

2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.4.1 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (HT-29, Hep-G2, MCF7 ) khả ức chế sản sinh NO

2.4.1.1 Nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro thực theo phương

với lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) giá trị OD lớn Phép thử thực điều kiện cụ thể sau:

 Chất thử pha thành dải nồng độ thích hợp

 Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào đếm buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

 Chất thử pha nồng độ vào giếng đĩa 96 giếng, thêm tế bào

điều chỉnh nồng độ phù hợp vào giếng cho nồng độ chất thử

trong giếng 100 g/ml; 20 g/ml; g/ml 0.8 g/ml

 Ủ đĩa thí nghiệm tủ ấm 48 370C Giếng khơng có chất thử có

TBUT (180l) sử dụng làm đối chứng ngày Sau giờ, giếng đối

chứng ngày tế bào cố định Trichloracetic acid – TCA

 Sau 48 giờ, tế bào cố định TCA giờ, nhuộm SRB

trong 30 phút 370C, rửa lần acetic acid để khơ nhiệt độ phịng

 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ 10 phút

Đọc kết OD bước sóng 515-540 nm máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

 Phần trăm ức chế phát triển tế bào có mặt chất thử xác định

thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) - OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) - OD (ngày 0)

 Phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Ellipticine nồngđộ

10 g/ml; g/ml; 0.4 g/ml; 0.08 g/ml sử dụng chất đối chứng

dương;

 DMSO 10% sử dụng đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%

sự phát triển) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

kích thích sản sinh yếu tố NO LPS (1μg/mL) 24h Một số giếng không ủ mẫu sử dụng dung dịch pha mẫu coi đối chứng âm Trong đối chứng dương sử dụng NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) nồng độ 100; 20; 0.8 μg/ml

 Nitrite (NO2-), xem tiêu chí đánh giá NO xác định nhờ thử

Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) chuyển sang đĩa 96 giếng thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide 5% (v/v) phosphoric acid 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha nước

 Hỗn hợp ủ tiếp nhiệt độ phòng 10 phút, hàm lượng nitrite

được đo máy microplate reader bước song 540 nm Môi trường DMEM không FBS sử dụng giếng trắng (blank) Hàm lượng nitrite

mẫu thí nghiệm xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2

được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS)

 Khả ức chế sản sinh NO mẫu xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lượng NO sample/hàm lượng NOLPS]*100

 Phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Giá trị IC50 (nồng độ ức

chế 50% hình thành NO) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.4.2 Nghiên cứu hoạt tính ức chế PGE2

Tế bào RAW 274.7 đưa vào đĩa 96 giếng nồng độ x 105 tb/giếng

nuôi tủ ấm 370C 5% CO2 24h sau ủ với mẫu thí nghiệm

Theo dịch ni cấy hoạt chất 50 μl đưa vào giếng ủ 1h nhiệt

độ phòng Tiếp theo 50 µl PGE2 đưa vào giếng ủ tiếp h trước

giếng rửa lần dung dịch đệm Sau đó, 200 μl dung dịch đưa vào giếng ủ tiếp 30 phút Sau dừng phản ứng 100 μl dung dịch dừng, giá trị OD giếng xác định thông qua máy đọc microplate reader bước sóng 450/540 nm

2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis

2.4.3.1 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342

Khả gây apoptosis hoạt chất xác định thông qua phương pháp

nhuộm Hoechst 33342 sau: Tế bào MCF-7 nuôi đĩa petri 24 370C

sau ủ với mẫu thí nghiệm nồng độ khác Camptothecin dùng làm đối chứng tham khảo, DMSO 10% sử dụng làm đối chứng âm Sau 24 h ủ mẫu, tế bào cố định formandehyde 4% Sau 30 phút, tế bào rửa lại PBS nhuộm thuốc nhuộm Hoechst 33342 (0,5µg/ml) 10 phút Tế bào quan sát kính hiển vi huỳnh quang bước sóng Excitation⁄Emission (nm) 350⁄461 Xác định số lượng tế bào apoptosis 200 tế bào quan sát qua kính hiển vi Apoptosis xác định tế bào có nhân sáng (do nhiễm sắc chất bị cô đặc) hay nhân bị phân chia thành mảnh nhỏ

2.4.3.2 Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis qua trắc lưu tế bào

Thí nghiệm thực theo Kit Anexin V/cell dead apoptosis

Invitrogen sau: 1x106

tế bào ủ với mẫu thử dung môi pha mẫu 24h thu vào ống falcon Sau ly tâm loại bỏ môi trường, tế bào rửa lại PBS Cặn tế bào hịa lại 100 µl dung dịch đệm liên kết bổ sung thêm 5µl

Anexin V 1µl PI (100 µg/ml) Tiếp tục ủ tế bào 15 phút 370C sau thêm

protein dịch tế bào Protein pha loãng với nồng độ 50 μg 50μl dung dịch đệm ly giải, cho 50 μl dung dịch đệm phản ứng μl chất DEVD-pNA (nồng

độ 200 μM) ủ 370C h Tiến hành đọc kết máy microplate reader

bước sóng 405 nm

2.5 Nghiên cứu docking phân tử

Docking phương pháp tính tốn dựa phần mềm dùng để nghiên cứu khả gắn kết hay nhiều phân tử (hay cấu tử, ligand) lên điểm tác động cấu trúc không gian chiều đại phân tử protein (receptor, enzym, …) ADN…Các nghiên cứu docking phân tử sử dụng để xác định tương tác hai phân tử tìm định hướng tốt phối tử hình thành phức hợp với lượng tối thiểu Các phân tử nhỏ gọi phối tử thường phù hợp hốc protein dự đốn thuật tốn tìm kiếm Các hốc protein trở nên hoạt động tiếp xúc với hợp chất bên gọi điểm tác động

Các kết phân tích chức tính điểm thống kê chuyển lượng tương tác sang giá trị số gọi điểm docking lượng tương tác tính tốn Hình dạng 3D phối tử bị liên kết hình dung cách sử dụng công cụ khác Pymol, Rasmol… giúp suy luận phù hợp phối tử Dự đoán chế độ tương tác protein-ligand giả thiết vị trí hoạt động phân tử protein giúp thích protein tốt [107] Hơn nữa, việc gắn kết phân tử có ứng dụng việc phát minh thiết kế dược phẩm

Docking phân tử.

a) Thuật tốn tìm kiếm - Các thuật tốn xác định tất cấu hình tối ưu cho phức hợp định (protein-protein, protein-ligand) mơi trường, tức vị trí hướng hai phân tử tương ứng với Chúng tính tốn lượng phức hợp tương tác riêng lẻ [107-108]

Các loại thuật tốn khác sử dụng để phân tích docking đưa đây:

- Động lực học phân tử,

- Phương pháp Monte Carlo

- Thuật toán di truyền

- Các phương pháp phân mảnh

- Các phương pháp bổ sung điểm

- Phương pháp hình học khoảng cách

- Tìm kiếm có hệ thống

b) Điểm số chức năng - Đây phương pháp toán học sử dụng để dự đoán cường độ tương tác khơng cộng hóa trị gọi liên kết ràng buộc hai phân tử sau chúng docking Điểm số chức phát triển để dự đoán cường độ kiểu tương tác liên phân tử khác, ví dụ hai protein protein DNA protein thuốc Các cấu hình đánh giá cách sử dụng điểm số chức để phân biệt chế độ liên kết thử nghiệm từ tất chế độ khác khám phá thơng qua thuật tốn tìm kiếm

d) Các bước docking phân tử:

Bước – chuẩn bị protein: Trong bước này, cấu trúc 3D thụ thể tải xuống từ ngân hàng liệu protein PDB (Protein data bank) Sau cấu trúc thu nên xử lý trước Điều phải chấp nhận loại bỏ phân tử nước, ion, ổn định điện tích,…theo thơng số có sẵn

CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

Những ưu điểm việc sử dụng phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ cải thiện hạn chế phản ứng phụ kháng thuốc [107] Tuy có hoạt tính trội, combretastatin cịn nhiều tác dụng khơng mong muốn Đây lý nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, hợp chất kháng ung thư, celecoxib, chất kháng viêm theo chế COX2, chất bắt nguồn cho hợp chất lai với hy vọng tìm chất mang đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú kháng ung thư kháng viêm chất gốc đồng thời gây tác dụng phụ

3.1 Thiết kế cấu trúc hoạt tính sinh học phân tử lai 3.1.1 Thiết kế cấu trúc phân tử lai

được khẳng định mặt hoạt tính gây độc tế bào ức chế tubulin [108] Các hợp chất

bị khóa dạng cấu hình cis thể số lợi ích ngăn chặn q trình đồng

phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng độ đặc hiệu hoạt chất với mục

tiêu tế bào cải thiện tiềm điều trị Sự diện nhóm trimethoxybenzene CA4 cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76] Chúng tơi đặc biệt quan tâm đến việc trì nhóm sulfonamid đặc điểm liên quan đến celecoxib điều dường dẫn đến việc bảo tồn tính chọn lọc COX-2 chất lai thu [109] Tác dụng ức chế COX2 có góp phần vào tổng thể hoạt động chống khối u phân tử lai

3.1.2 Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai

Trong trình viêm nhiễm, tế bào miễn dịch kích hoạt đại thực bào tiết số chất trung gian gây viêm cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) prostaglandin E2 (PGE2) Hơn nữa, có mối liên quan rõ ràng mức độ prostaglandin khối u vú người với phát triển di khả sống sót [115] Prostaglandin E2 tồn với nồng độ cao khối u vú thể trạng ung thư di căn, thiếu thụ thể estrogen progesterone [116-117] Do đó, khả ức chế sản xuất PGE2 coi chiến lược tốt việc thiết kế chất chống ung thư Tuy nhiên, tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 thấp theo báo cáo khác [109] Do đó, hiệu lực hoạt tính hợp chất lai thử nghiệm đáp ứng viêm gây LPS thay ức chế PGE2 MCF7 [118]

Do vậy, dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 khả ức chế sản sinh NO lựa chọn công cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm lớp chất nghiên cứu Và để xác định chế kháng viêm kháng ung thư chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V PI Sau cùng, chất chọn lọc nghiên cứu chế sinh học thử nghiệm tương tác với đích tác dụng tubulin COX2 phương pháp docking phân tử để khẳng định độ xác hoạt tính sinh học mơ hình in vitro

3.2 Tổng hợp hợp chất lai coxib - combretastatin

sau tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, chất có cấu trúc tương tự celecoxib

Theo quy trình phản ứng mơ tả Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin tổng hợp thành công, phản ứng thực lần độc lập để đưa hiệu suất trung bình Sản phẩm thu đạt hiệu suất từ 64 – 83% với sản phẩm lai coxib – combretastatin dạng este (Bảng 3.1), 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất 95% 78% (bảng 3.2), 20 hợp chất dạng axit chất lai coxib - combretastatin với hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); Qua thấy hiệu xuất sản phẩm lai thu qua giai đoạn phản ứng cao Các chất tiến hành xác định cấu trúc phương pháp tinh chế phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D

Bảng 3.1 Kết tổng hợp chất este từ chất 79 đến chất 98

TT

Chất 76(khối lƣợng)

76

(ii)

(mg)

Chất 78 Sản phẩm (ký hiệu)

Lƣợng (mg)

Hiệu suất (%)

1 196 mg 136 174 mg 79 330 83%

2 196 mg 136 176 mg 80 331 76%

3 196 mg 136 169 mg 81 270 69%

4 196 mg 136 189 mg 82 268 73%

5 196 mg 136 223 mg 83 330 75%

6 256 mg 136 174 mg 84 380 83%

8 256 mg 136 169 mg 86 316 70%

9 256 mg 136 189 mg 87 283 60%

10 256 mg 136 223 mg 88 395 78%

11 275 mg 136 174 mg 89 367 77%

12 275 mg 136 176 mg 90 355 69% 13 275 mg 136 169 mg 91 306 65% 14 275 mg 136 189 mg 92 329 67%

15 275 mg 136 223 mg 93 393 75%

16 215 mg 136 223 mg 94 338 73%

17 228 mg 136 223 mg 95 204 66%

18 214 mg 136 223 mg 96 312 67%

19 230 mg 136 223 mg 97 360 75%

20 256 mg 136 223 mg 98 324 64%

10H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 55.5; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0

(2C); 127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9;

132.6; 141.2; 142.2; 159.2; 162.5 HRMS, m/z = 399.1710 ([M+H]+, C25H23N2O3+;

calc 399.1703).

Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (80; 76%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.20－7.27 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.58 (d, J

＝8.3, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.1; 125.4; 125.5 (2C); 126.1;

127.0 (2C); 127.3 (2C); 127.7 (2C); 128.6 (3C); 128.9; 130.3 (2C); 130.6 (2C); 131.4;

142.1; 142.3; 142.5; 162.2 HRMS, m/z = 437.1476 ([M+H]+, C25H20F3N2O2+; calc

437.1471)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.30 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.61 (d, J

＝8.3, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.6; 117.9; 125.6 (2C);

125.7; 127.4; 127.7 (2C); 128.4;128.7 (2C); 129.1; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.1;

132.8 (2C); 142.3; 142.7; 142.9; 162.1 HRMS, m/z = 394.1551 ([M+H]+,

C25H20N3O2+; calc 394.1550)

Ethyl 1-(4-nitrophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (82; 65%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2),

7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.33 (m, 8H, Ph); 7.50 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 8.18 (d, J

＝8.3, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 61.2; 121.3 (2C); 125.5 (2C);

125.8; 127.4; 127.7 (2C); 128.4; 128.8 (2C); 129.2; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.0;

142.5; 143.1; 144.2; 146.6; 162.0 HRMS, m/z = 414.1449 ([M+H]+, C24H20N3O+; calc

414.1448)

Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (83; 85%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

Ethyl 1,4,5-tris(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (84; 83%)

H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.73 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

6H, 2OMe); 4.31 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.68 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 6.81- 6.83 (m, 4H,

Ph); 6.87 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.8, 2H, Ph); 7.20 (d, J＝8.8, 2H, Ph) 13C

NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 55.47; 60.78; 113.2; 113.7 (2C); 113.9

(2C); 121.3; 123.9 (2C); 124.3; 127.0 (2C); 131.6 (2C); 131.8 (2C); 132.8; 141.1;

142.0; 158.6; 159.1; 159.4; 162.6 HRMS, m/z = 459.1914 ([M+H]+, C27H27N2O5+;

calc 459.1914)

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (85; 78%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

6.90 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.57 (d, J

＝8.2, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 61.0;113.2 (2C);

114.1 (2C);120.8; 123.7 (2C); 124.8 (2C); 125.5 (2C); 126.0 (4C); 131.6; 131.7; 142.1;

142.3; 142.4; 158.8; 159.8; 162.4 HRMS, m/z = 497.1683 ([M+H]+, C27H24F3N2O4+;

calc 497.1683)

Ethyl 1-(4-cyanophenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (86; 70%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1,29 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

3H, OMe); 4.33 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.75 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.81 (d, J＝8.3, 2H,

Ph); 6.90 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.60

(d, J＝9.0, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 111.4;

113.3 (2C); 114.2; 118.2 (2C); 120.6; 123.4 (2C); 125.1; 125.6 (2C); 131.5 (2C); 131.7

(2C); 132.8; 142.1; 142.8; 142.9; 158.8; 160.0; 162.2 HRMS, m/z = 454.1765

([M+H]+, C27H24N3O4+; calc 454.1761)

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (87;

(d, J＝9.0, 2H, Ph) C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 113.4

(2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.3 (2C); 124.3 (2C); 125.3 (2C); 131.1 (2C); 131.6 (2C);

142.3; 143.0; 144.4; 146.5; 158.8; 160.0; 162.2 HRMS, m/z = 474.1659 ([M+H]+,

C26H24N3O6+; calc 474.1660)

Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (88;

78%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.25 (t, J＝7.0, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s,

3H, OMe); 4.30 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.73 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.80 (d, J＝8.3, 2H,

Ph); 6.89 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.42 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.82

(d, J＝9.0, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.1; 55.2; 61.1; 113.2

(2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.5 (2C); 125.6 (2C); 127.2(2C); 131.6 (2C); 131.7 (2C);

141.1; 142.2; 142.6; 142.7; 158.8; 159.9; 162.3 HRMS, m/z = 508.1540 ([M+H]+,

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate

(89; 77%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.80 (s, 3H, OMe); 4.32 (q, J

＝7.1, 2H, CH2); 6.82- 6.85 (m, 4H, Ph); 7.19－7.21 (m, 4H, Ph); 7.25－7.30 (m, 5H,

Ph) 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.6; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0 (2C);

127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9; 132.6;

141.2; 142.2; 159.2; 162.5 HRMS, m/z = 477.0813 ([M+H]+, C25H22BrN2O3+; calc

477.0808)

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (90; 69%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.32 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

6.85 (m, 2H, Ph); 7.10－7.20 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.35－7.36 (m,

2H, Ph); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.3 (d, J＝7.6, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz,

CDCl3): δ 14.0; 61.1; 125.5 (2C); 125.6; 126.2 (3C); 127.5 (3C); 127.9 (3C); 130.5

(2C); 131.0 (2C); 131.7 (2C); 132.0; 141.9; 142.0; 142.6; 162.0 HRMS, m/z =

6.87 (d, J＝6.86, 2H, Ph); 7.17－7.18 (m, 2H, Ph); 7.26-7.29 (m, 3H, Ph); 7.38 (d, J＝

7.3, 2H, Ph) ); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.65 (d, J＝7.6, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz,

CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.9; 117.8; 123.7; 125.7 (2C); 125.9; 127.3; 127.6; 127.9 (2C);

130.4 (2C); 130.8; 131.6 (2C); 132.1 (2C); 133.0 (2C); 141.1; 142.4; 143.0; 161.9

HRMS, m/z = 472.0661 ([M+H]+, C25H19BrN3O2+; calc 472.0655)

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-nitrophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (92; 67%)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.34 (q, J＝7.1, 2H, CH2),

6.88 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.17－7.19 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.39 (d, J

＝8.2, 2H, Ph); 7.5 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 8.2 (d, J＝9.3, 2H, Ph); 13C NMR (125 MHz,

CDCl3): δ 14.2; 61.2; 111.8; 117.8; 123.7; 125.6 (2C); 125.9; 127.5; 127.6; 127.9 (2C);

130.9 (2C); 130.8; 131.1 (2C); 132.4 (2C); 133.0 (2C); 141.2; 142.2; 143.1; 161.9

Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

(93; 75%)

1H NMR (500 MHz, CDCl

3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2);

4.91 (s, 2H, NH2); 6.87 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.17－7.29 (m, 2H, Ph); 7.28－7.30 (m,

3H, Ph); 7.36 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.47 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7,91 (d, J＝9.1, 2H, Ph)

13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.4; 123.7; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ;

127.5(2C); 127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4;

142.4; 142.6; 142.8; 162.0 HRMS, m/z = 526.0429 ([M+H]+, C24H21BrN3O4S+; calc

526.0431)

Ethyl 5-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

(94; 73%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.14 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.22 (q, J＝7.0, 2H, CH

2);

6.64 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.93 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.20 (m, 2H, Ph); 7,27 (m, 3H, Ph);

7,45 (s, 2H, NH2); 7.49 (d, J＝8.5, 2H, Ph); 7.83 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 9.72 (s, 1H,

OH); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.3; 60.8; 111.9; 115.9 (2C); 124.5 (2C);

126.0 (2C); 127.4 ; 128.0 (2C); 130.8 (2C); 132.0 (2C); 132.2 (2C); 141.9; 142.0;

143.1; 143.8; 158.3; 162.2 HRMS, m/z = 464.1276 ([M+H]+, C24H22N3O5S+; calc

Ethyl 5-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (95; 66%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.22 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.08 (q, J＝7.0, 2H, CH

2);

6.93 (d, J＝8.3, 2H); 6,98-7.11 (dd, J＝8.4, 2H, Ph); 7.23 – 7.25 (m, 4H, Ph); 7.40 –

7.41 (m, 6H, Ph, NH2); 7.95 (d, J＝7.0, 2H, Ph) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ

14.5; 62.5; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8;

129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 480.1200

([M+H]+, C24H22N3O6S+; calc 480.1224)

Ethyl 5-(4-fluorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

(96; 67%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.18 (q, J＝7.0, 2H, CH

2);

6.93 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.11- 7.17 (dd, J＝8.4, 3H, Ph); 7.48 – 7.51 (m, 2H, Ph); 7.52

– 7.53 (m, 2H, Ph); 7.84 (d, J＝7.0, 2H, Ph).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.1;

61.4; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9;

130.2 (3C); 132.1; 141.3; 142.3; 162.0; HRMS, m/z = 466.1230 ([M+H]+,

Ethyl 5-(4-chlorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate

(97; 75%)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.27 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 5.2

(s, 2H, NH2); 6.9 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.20 (m, 2H, Ph); 7.26－7.29 (m, 3H,

Ph); 7.41 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.43 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.85 (d, J＝9.1, 2H, Ph) 13C

NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 126.6; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ; 127.5(2C);

127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 141.6;

142.7; 162.0 HRMS, m/z = 482.0935 ([M+H]+, C24H21ClN3O4S+; calc 482.0936)

Ethyl 5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (98; 64%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.25 (m, 3H, Me); 3.84 (s, 3H, OMe); 3.88 (s, 3H,

OMe); 4.27 (s, 2H, CH2); 6.44 (d, J＝3.1, 1H, Ph); 6,50 (dd, J＝8.3, 1H, Ph); 7.20 –

7.22 (m, 4H, Ph); 7.25 – 7.28 (m, 5H, Ph); 7.78 (d, J = 8.0, 1H, Ph) 13C NMR (125

MHz, DMSO-d6): δ 14.4;55.6 (C); 61.2 (2C); 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C);

128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1;

1 134 mg 170 208 65 360 95

2 210 mg 170 208 102 355 78

4-(3-(trifluoromethyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-pyrazol-1-yl)benzenesulfonamide

(102; 78%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.69 (s, 6H, 2OMe, Ph); 3.87 (s, 3H, OMe, Ph);

4.99 (s, 2H, NH2); 6.44 (s, 2H, Ph); 6,76 (s, 1H, Ph); 7.50 (d, J = 8.0, 2H, Ph); 7.92 (d,

J = 8.0, 2H, Ph).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 56.2 (2C); 61.3; 102.4 (3C);

123.8; 125.5 (3C); 127.4 (3C); 141.5; 145.0; 153.5 (3C) HRMS, m/z = 458.0962

([M+H]+, C19H18F3N3O5S+; calc 458.0992)

Bảng 3.3 Kết tổng hợp dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122

TT

Chất M chất đầu (mg)

NaH

(mg)

Sản phẩm (ký hiệu)

Lƣợng thu (mg)

Hiệu suất (%)

1 79 165 24 103 114 74%

3 81 135 20 105 82 65%

4 82 134 18 106 81 65%

5 83 165 22 107 111 67%

6 84 190 24 108 132 74%

7 85 193 22 109 127 70%

8 86 158 20 110 94 63%

9 87 141 18 111 75 54%

10 88 197 22 112 131 70%

11 89 183 22 113 119 69%

12 90 177 20 114 106 62%

13 91 153 18 115 83 58%

14 92 164 20

116

93 60%

15 93 196 22 117 125 67%

16 94 169 22 118 110 69%

17 95 102 12 119 57 59%

18 96 156 20 120 94 64%

19 97 180 22 121 115 67%

20 98 162 18 122 88 57%

1-(4-methoxyphenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (103; 74%)

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.0 (s, 3H); 6.16 (d, J＝8.8 Hz, 2H); 6.81 (dd, J＝

9.4 Hz, J＝1.4 Hz, 2H); 6.4－6.5 (m, 10H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.3;

113.9 (2C); 123.4; 126.7; 126.9(3C); 127.4 (2C); 128.2 (3C); 128.5; 128.8; 130.3 (3C);

131.9; 132.1; 142.0; 158.7; 163.2 HRMS, m/z = 371.1403 ([M+H]+ C23H19N2O3+,

calc 370.13)

4,5-diphenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (104; 68%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.13(d, J＝8.2 Hz, 2H); 7.19－7.32 (m, 8H); 7.5 (d,

J＝8.2 Hz, 2H); 7.77 (d, J＝8.2 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.2;

125.7 (2C); 126.1(3C); 126.9 (2C); 127.5 (2C); 128.4 (2C); 128.9 (3C); 130.3 (3C);

131.4; 142.1 (2C); 142.5; 163.0 HRMS, m/z = 409.1194 ([M+H]+ C23H15F3N2O2+

calc 408.3802)

1H NMR (500 MHz,

DMSO-d6) δ 7.13 (m, 2H); 7.18－7.30 (m, 10H); 7.46 (dd, J＝

6.8 Hz, J＝2.0 Hz, 2H); 7.87 (d, J＝6.8 Hz, J＝2.0 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz,

DMSO-d6): δ 110.6; 117.9; 125.7 (2C); 126.9; 127.5 (2C); 128.3; 128.5 (2C); 129.0;

130.2 (3C); 130.3 (2C); 131.3; 133.2 (2C); 142.2; 142.4; 142.7; 162.9 HRMS, m/z =

366.1270 ([M+H]+, C23H16N3O2+, calc 366.1238)

1-(4-nitrophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (106, 65%)

1H NMR (500 MHz,

DMSO-d6) δ 7.15－7.34 (m, 10H); 7.55 (dd, J＝7.0 Hz, J＝2.2

Hz, 2H); 8.2 (dd, J＝7.0 Hz, J＝2.2 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 120.4

(3C); 125.8 (3C); 127.0; 127.5 (2C); 128.2; 128.5 (2C); 129.2; 130.2 (2C); 130.4 (2C);

131.4; 142.3; 143.8; 146.3; 162.9; HRMS, m/z = 386.1174 ([M+H]+, C22H15N3O4+,

calc 386.1136)

4,5-diphenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (107; 67%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.15 (d, J＝8.2 Hz, 2H); 7.2－7.33 (m, 8H); 7.46

(m, 4H); 7.81 (d, J＝9.2 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.7; 126.9

(3C); 127.4 (3C); 128.0; 128.9 (2C); 129.4; 130.8 (2C); 132.0; 141.8; 142.7; 142.9;

1,4,5-tris(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (108,74%)

1H NMR (500 MHz,) δ 3.68 (s, 3H); 3.71 (s, 3H); 3.75 (s, 3H); 6.78 - 6.81 (m, 4H);

6.92 (d, J＝8.6 Hz, 2H); 6.98 (d, J＝8.6 Hz, 2H); 7.01 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.20 (d, J＝

8.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 55.4 (2C); 55.8; 113.5; 114.2 (2C); 114.4

(2C); 121.5; 123.4; 124.6; 127.4 (2C); 131.9 (2C); 132.2 ; 132.8; 141.6; 142.3; 158.5;

159.2; 159.5; 163.9 HRMS, m/z = 429.1424; ([M+H]+ C25H21N2O5- calc 430.4600)

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(109; 70%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.71 (s, 3H); 3.73 (s, 3H); 6.82 - 6.86 (m, 4H); 7.06

(d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.11 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.5 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.78 (d, J＝9.0

Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4; 55.5; 113.5 (2C); 114.5 (2C);121.0;

124.1; 124.3 126.2 (2C); 126.6 (4C); 128.4; 128.6; 131.9; 132.2; 142.4; 142.9; 143.0;

1-(4-cyanophenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (110; 63%,)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.72 (s, 3H); 3.73 (s, 3H); 6.82 – 6.87 (m, 4H); 7.0

(d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.11 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.74 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.89 (d, J＝9.00

Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4 (2C); 110.9; 113.5 (2C); 114.5;

118.5; 120.9; 124.1 ; 124.5; 126.2 (2C); 131.9 (2C); 132.2 (2C); 133.7; 142.5; 143.1;

143.3; 158.8; 160.0; 163.7 HRMS, m/z = 426.1372 ([M+H]+ C25H20N3O4+, calc

425.4440)

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (111; 54%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.72 (s, 3H); 3.74 (s, 3H); 6.68 (m, 4H); 7.08 (m,

4H); 7.54 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.82 (d, J＝9.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz,

DMSO-d6): δ 55.4 (2C); 110.9; 113.5 (2C); 114.5; 118.5; 120.9; 124.0 ; 124.5; 126.1 (2C);

131.9 (2C); 132.0 (2C); 133.2; 142.5; 143.0; 143.3; 158.8; 160.1; HRMS, m/z =

4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (112;

70%,)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.73 (s, 6H); 6.82 (m, 4H); 7.05 (m , 4H); 7.45 (m,

4H); 7.81 (d, J＝7.7 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4 (2C); 113.5

(2C); 114.5 (2C); 121.1; 124.5; 125.9 (2C); 126.9 (2C); 131.9 (2C); 132.3; 142.0;

142.4; 143.6; 158.6; 159.8; HRMS, m/z = 480.1126 ([M+H]+ C24H22N3O6S+; calc

479.1151)

5-(4-bromophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(113; 69%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.76 (s, 3H); 6.94 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.0 (d, J＝8.4

Hz, 2H); 7.17 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 7.23 – 7.26 (m, 5H); 7.45 (d, J＝8.4 Hz, 2H); 13C

NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 55.4; 114.0 (2C); 127.0 (2C); 127.5; 128.3 (2C); 130.3

(2C); 131.2 (2C); 132.4 (2C); 159.2; HRMS, m/z = 447.0359 ([M-H]-; C23H16BrN2O3-,

5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-(trifluoromethyl) phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (114; 62%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.08 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.21 (m, 2H); 7.25－7.30

(m, 3H); 7.74 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.82 (d, J＝7.4 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz,

DMSO-d6): δ 123.2 (2C); 125.0; 126.4 (3C); 126.8 (3C); 127.6; 128.1 (2C); 130.8;

131.0; 132.0 (2C); 132.9; 141.5; 142.4; 143.1; 163.4 MRMS, m/z = 487.0092 ([M-H]

-C23H13BrF3N2O2- calc 487.2762)

5-(4-bromophenyl)-1-(4-cyanophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (115, 58%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.07 (d, J＝7.4 Hz, 2H); 7.20 (m, 2H); 7.27－7.29

(m, 3H); 7.49 – 7.52 (m, 4H); 7.92 (d, J＝7.4 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz,

DMSO-d6): δ 111.3; 111.8; 123.2; 125.2; 126.4; 127.6; 128.1; 130.8 (2C); 131.6; 132.1 (2C);

132.9; 133.8; 141.6; 142.8; 143.3; 163.7 HRMS, m/z = 444.0161 [M-H]

-

(C23H13BrN3O2- calc 444.2880)

HRMS, m/z = 466.0131 ([M+H]+ C22H15BrN3O4+ calc 464.2750)

5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(117; 67%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.0 (d, J＝8.7 Hz, 2H); 7.18－7.20 (m, 2H); 7.24－

7.27 (m, 3H); 7.46 (s, 2H); 7.4 – 7.51 (dd, J＝3.2 Hz, J＝8.4 Hz, 4H) 7.8 (d, J＝8.5

Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 123.1; 125.0; 126.2 (2C); 127.1 (2H);

127.6 (2C); 128.1 (2C); 128.2; 130.8 (2C); 131.7 (2C); 132.0 (2C); 132.9 (2C) 141.6;

143.1; 144.1; 163.6 HRMS, m/z = 499.9993 ([M+H]+ C22H17BrN3O4S+ calc

498.3510)

5-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(118; 69%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.65 (d, J＝8.6 Hz, 1H); 6.76 (d, J＝8.6 Hz, 1H);

1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 115.8 (2C); 123.5 (2C); 125.0; 128.0 (2C);

130.8 (2C); 132.0 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 142.6; 142.8; 162.0; HRMS, m/z =

436.0873 ([M+H]+, C22H17N3O5S+, calc 436.0962)

5-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (119; 59%)

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.91 (d, J＝3.2 Hz, 2H); 6,96- 6.98 (dd, J＝8.6 Hz,

J＝3.2 Hz 2H); 7.25 – 7.27 (m, 3H); 7.35 – 7.39 (m, 5H); 7.92 (d, J＝8.3 Hz, 2H) 13C

NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 102.6; 116.4 (2C); 127.7; 128.1 (2C); 130.4 (3C);

132.4 (2C); 157.7; 157.3; 162.8; 163.7; 175.9; HRMS, m/z = 452.1200 ([M+H]+

C22H18N3O6S+, calc 451.4530)

5-(4-fluorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(120; 64%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.10 – 7.28 (m, 9H); 7.45 – 7.48 (m, 2H); 7.50 (d, J

＝8.3 Hz, 2H);7.84 (d, J＝8.3 Hz, 2H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 116.0;

116.2; 124.9; 125.4; 126.1 (2C); 127.0 (2C); 127.5; 128.1; 129.3; 130.2; 130.8; 131.9;

133.2; 133.3; 141.7; 141.8; 142.8; 143.9; 163.5; 163.6; HRMS, m/z = 436.0768 ([M -

5-(4-chlorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid

(121; 67%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.15 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.20 (d, J＝7.0 Hz, 2H);

7.25－7.28 (m, 3H); 7.36 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.47 (s, 2H); 7.50 (d, J＝7.9 Hz, 2H); 7.8

(d, J＝7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 124.9; 126.1 (2C); 127.1 (2C);

127.5; 127.9; 128.1 (2C); 129.1 (2C); 130.8 (2C); 131.8; 132.7; 132.8; 134.3; 141.2;

141.7; 143.9; 146.7; 162.0 HRMS, m/z = 454.0538 ([M+H]+ C22H16ClN3O4S+ calc

453.8970)

5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylic acid (122; 57%)

1

H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.9 (d, J＝7.0 Hz, 2H); 7.20 – 7.22 (m, 4H); 7.25 –

7.28 (m, 5H); 7.78(d, 1H) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 116.4; 125.5; 127.8

(2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4;

164.1; 175.7; HRMS, m/z = 480.1570 ([M+H]+ C24H21N3O6S+, calc 479.1151)

3.3.1 Sàng lọc hoạt tính sinh học hợp chất lai coxib - combretastatin

Sàng lọc hoạt tính 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este 02 chất lai chứa nhóm CF3

Độc tính tế bào 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este 02 hợp chất chứa nhóm CF3 đánh giá tỷ lệ ức chế phát triển tế bào ba dòng HT-29,

Hep-G2 MCF-7 phương pháp phát triển Monks cộng [120] Kết tóm tắt Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần Các hoạt tính chống tăng sinh celecoxib thể tế bào ung thư người ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT-29) công bố [121-123] Trong phạm vi công trình nghiên cứu 12 hợp chất lai hóa 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể độc tính tế bào dòng MCF-7 mạnh celecoxib năm hợp chất 102, 96, 81, 82, 94 có IC50 < 10 µM Trong số hợp chất

như 102, 96, 94, 93 97 cũng có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc celecoxib (65) Hơn nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả chống lại tế bào HT-29 mạnh 3-6 lần so với chất gốc celecoxib hợp chất 90 có IC50 10

µM Qua khẳng định, diện nhóm chứa nitơ, halogen vị trí para- hai vịng phenyl liền kề 96, 93, 91, 92, 97 góp phần làm tăng độc tính tế bào Hợp chất 102 mang đầy đủ đặc điểm cấu trúc khung celecoxib CA4 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào trội với dòng MCF-7 21 hợp chất celecoxib (65) thử tác dụng ức chế oxit nitric (NO) kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) đại thực bào RAW 264.7 [124] Điều thú vị là, ngoại trừ hợp chất 102 98 có hoạt tính kép mạnh trội việc ức chế sản xuất NO hoạt động gây độc tế bào dòng tế bào ung thư MCF-7, hợp chất khác nhóm thể hoạt động ức chế sản xuất NO yếu , nhấn mạnh chúng có tính an tồn tốt hệ thống tim mạch so với celecoxib [110]

1 102 3,4,5-triOMe

4-NH2SO2 1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59

2 96 H 4-F 4-NH2SO2 81.6 ± 10.6 18.7 ± 1.7 29.37± 1.90 7.97±0.51

3 81 H H 4-CN 116.83±7.7 37.6±3.5 >254 8.20± 0.93

4 82 H H 4-NO2 129.88±15.7 21.2±2.1 >242 9.67± 0.92

5 94 H 4-OH 4-NH2SO2 92.3 ± 7.2 18.8 ± 1.5 14.51±1.36 8.90± 0.79

6 93 H 4-Br 4-NH2SO2 73.7 ± 2.6 23.5 ± 1.8 35.48±2.85 19.27±0.27

7 91 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 32.6± 3.0 >211 20.16± 1.83

8 92 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 153.2± 10 >203 21.30± 1.40

9 89 H 4-Br 4-OMe 21.01±4.3 39.6±2.9 >209 21.51± 1.48

10 90 H 4-Br 4-CF3 > 233 10.0±0.7 75.87±4.41 21.65± 1.86

11 97 H 4-Cl 4-NH2SO2 122.2 ± 9.7 14.1 ± 37.04±4.95 23.79± 3.11

12 85 4-OM e

4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 107± 10 >201 29.80± 2.71

13 65 4-Me 4-NH2SO2 83.59 ± 5.0 58.4 ± 3.4 37.11±2.14 30.67±3.79

14 98 H 4,6-

diOMe

4-NH2SO2 4.41±0.17 136.0 ± 12

>197 39.93± 2.64

20 hợp chất axit tổng hợp thành công tiến hành sàng lọc hoạt tính với dịng tế bào ung thư vú MCF7 khả ức chế sản xuất NO đem so sánh với chất dạng lai hóa este Tuy nhiên kết hoạt tính thu chất gốc axit thấp đáng kể so với hoạt tính chất lai hóa dạng este Hoạt tính thể bảng 3.5 Theo kết sàng lọc thu bước đầu khẳng định chất lai coxib – combretastatin chuyển sang dạng lai có gốc axit hoạt tính giảm đáng kể, nhiên hai chất 116 111 thể khả ức chế sản sinh NO cao so với

16 79 H H 4-OMe 30.0±13.4 >251 21.43±1.93 43.19±4.86

17 87 4-OM e

4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 >211 >211 48.81± 2.62

18 86 4-OM e

4-OMe 4-CN 76.42±9.4 110.3±7.0 >220 48.86± 3.13

19 84 4-OM e

4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 160±15 >218 49.32± 1.72

20 80 H H 4-CF3 59.52±5.5 17.3±2.0 63.17± 3.01 50.66± 4.46

21 88 4-OM e

4-OMe 4-NH2SO2 103.4 ±10.5 99.0±6.3 58.57± 4.70 68.43± 7.05

22 98 H 4,6-diOH

4-NH2SO2 > 208.5 173.9 ±

12

64.03± 5.75 83.60± 3.44

L-NMMA 8.39±0.31

Ellipticine 0.18±

0.04

este tế bào ung thư MCF-7 ức chế sản xuất NO

STT R R’ R’’

IC50 (µM)

Este (NO) Axit (NO) Este (MCF-7)

Axit (MCF7)

1

3,4,5-triOMe 4-NH2SO2

1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59

2 H 4-F

4-NH2SO2

81.6 ± 10.6 194.5±7.6 7.97±0.51 187.7±9.5

3 H H 4-CN 116.83±7.7 256.7±22.1 8.20± 0.93 154.5±15.1

4 H H 4-NO2 129.88±15.7 >261.1 9.67± 0.92 187.6±10.4

5 H 4-OH

4-NH2SO2

92.3 ± 7.2 75.8±2.6 8.90± 0.79 34.6±2.6

6 H 4-Br

4-NH2SO2

73.7 ± 2.6 >202.0 19.27±0.27 149.5±7.3

7 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 97.9±9.4 20.16± 1.83 70.1± 4.6

8 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 111.2±8.7 21.30± 1.40 34.0±6.4

9 H 4-Br 4-OMe 21.01±4.3 >223.7 21.51± 1.48 >223.7

10 H 4-Br 4-CF3 > 233 80.0±6.3 21.65± 1.86 129.5±9.7

11 H 4-Cl

4-NH2SO2

Ghi chú: * : Cột thống kê hoạt tính chất este **: Cột thống kê hoạt tính chất axit

Các hợp chất lai 102, 96, 81, 82, 94 celecoxib thể hoạt tính vượt trội thống kê lại bảng 3.6. tiếp tục thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 nhằm sàng lọc kỹ hoạt tính kháng viêm lẫn kháng ung thư hoạt chất

12 4-OMe 4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 140.3±16.7 29.80± 2.71 136.0±8.4

13 4-Me

4-NH2SO2

83.59 ± 5.0 30.67±3.79 30.0±3.3

14 H 4,6-

diOMe 4-NH2SO2

4.41±0.17 >208.7 39.93± 2.64 94.0±6.4

15 H H

4-NH2SO2

> 233 >239.8 40.54±2.56 178.9±12.9

16 H H 4-OMe 30.0±13.4 >271.7 43.19±4.86 209.3 ± 20.0

17 4-OMe 4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 185.9±9.8 48.81± 2.62 31.8±3.7

18 4-OMe 4-OMe 4-CN 76.42±9.4 157.0±12.2 48.86± 3.13 83.0±10.3

19 4-OMe 4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 145.7±15.2 49.32± 1.72 75.7±6.9

20 H H 4-CF3 59.52±5.5 109.4±5.8 50.66± 4.46 203.8 ± 5.1

21 4-OMe 4-OMe

4-NH2SO2

103.4 ±10.5 >209 68.43± 7.05 150.0±14.7

22 H

4,6-diOH 4-NH2SO2

> 208.5 >222.0 83.60± 3.44 >222.0

L-NMMA 8.39±0.31

1 102 3,4,5-triOMe 4-NH2SO2 4.63± 0.59

2 96 H 4-F 4-NH2SO2 7.97±0.51

4 81 H H 4-CN 8.20± 0.93

6 82 H H 4-NO2 9.67± 0.92

8 94 H 4-OH 4-NH2SO2 8.90± 0.79

10 65 4-Me 4-NH2SO2 30.0±3.3

11 Ellipticine 0.36± 0.04

3.3.2 Nghiên cứu chế kháng viêm kháng ung thư

3.3.2.1 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2

ở nồng độ tế bào thử nghiệm × 10

/ giếng (Bảng 3.7) Vì vậy, tất hợp chất thử nghiệm cho thấy tính chọn lọc tế bào ung thư tế bào nành

Bảng 3.7 Ảnh hưởng hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2

đại thực bào RAW 264.7 kích thích LPS

PGE2 (pg/ml)

Nồng độ

(µM) 102 96 81 82 94 Nồng độ (µM) Celecoxib (43)

100 - - - 41.45

20 65.31 223.82 253.60 155.07 246.88 100 129.83

4 133.59 326.20 277.23 383.49 488.82 20 278.64

0.8 225.56 399.56 490.73 478.52 560.34 -

LPS 329.60

Hình 3.2 Đánh giá mức độ biểu PGE2 hợp chất 102, 96, 81, 82, 94, Celecoxib nồng độ 20 µM đại thực bào RAW-264,7 sau 48 xử lý

3.3.2.2 Phân tích chu kỳ tế bào

tương tự celecoxib Celecoxib hợp chất liên quan biết có khả ức chế phát triển khối u tạo trình apoptosis Sự bắt giữ tế bào pha G0 /G1 celecoxib xác định khơng có tham gia COX2 PGE2 [114] Mặt khác, hợp chất 102 tạo bắt giữ tế bào pha G2 /M đồng thời giảm tế bào pha S Việc bắt giữ tế bào Pha G2 /M dẫn đến ngăn cản tế bào khỏi q trình ngun phân, tính thể tác nhân ức chế vi ống giống colchicin combretastatin [4] Trong trường hợp hợp chất 102, thay liên kết đơi CA4 với vịng pyrazol celecoxib mà trì gốc trimethoxybenzen CA4 quan trọng để thu tính gây độc tế bào kháng phân bào chất gốc [108, 125]

Bảng 3.8 Phần trăm tế bào theo pha hợp chất thử nghiệm với MCF7

STT Hợp chất Phần trăm tế bào theo phase (%) % G0/G1 % S % G2/M

1 Đối chứng (-)

(DMSO 0,5%) 42.46 40.47 13.15

2 102 (10 µM) 40.72 35.09 21.04

3 96 (10 µM) 49.00 34.17 14.17

4 81 (10 µM) 45.22 34.46 17.45

5 82 (10 µM) 50.96 30.75 14.80

6 94 (10 µM) 49.55 34.50 14.34

Đối chứng 102 96

81 82 94

Celecoxib (65)

Hình 3.3 Phân tích chu kỳ tế bào hợp chất thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 nồng độ 10 µM Celecoxib (65) nồng độ 30 µM MCF7

Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342

Thúc đẩy trình chết tế bào ung thư dấu hiệu hoạt động chống khối u Apoptosis trình chết đặc trưng thay đổi hình thái tế bào, ngưng tụ chất nhiễm sắc, phân cắt DNA phân mảnh nhân Các đặc điểm hình thái điển hình tế bào apoptotic quan sát qua trình nhuộm Hoechst 33342 đọc kết nhờ kính hiển vi huỳnh quang [126] Trong nghiên cứu này, tế bào ung thư vú ủ với hợp chất 82 102 nồng độ µM, 10 µM 20 µM để xác định tính cảm ứng với apoptosis phương pháp nhuộm Hoechst 33342 kết trình bày Bảng 3.9 Hình 3.4.

Tại nồng độ nghiên cứu, mẫu 82 chưa thể rõ có khả gây cô đặc phân mảnh nhân tế bào với % tế bào có nhân đặc từ 2.42-5.33% Tại nồng độ 20 µM, mẫu 102 thể khả gây cô đặc phân mảnh nhân tế bào với % tế bào có nhân đặc đạt 12.38% Mẫu đối chứng tham khảo camptothecin nồng độ µM thể khả gây cô đặc phân mảnh nhân tế bào với % tế bào có nhân đặc đạt 22.71%.(P <0.01)

Bảng 3.9 Phần trăm ngưng tụ phân mảnh nhân tế bào hợp chất 102 82 gây ra

Tế bào Apoptosis (%)

82 (20 µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) 102 (20 µM) 102 (10 µM) 102 (5 µM) Camptothecin (5µM) (-) Đối chứng

5.33 ± 0.34 2.69± 0.22 2.42± 0.27 12.38± 0.96 5.18± 0.33

3.55±

Các mẫu nghiên cứu thu Hình ảnh tế bào MCF7 sau nhuộm Hoechst 33342 nồng độ khác nhau:

Đối chứng âm Camptothecin (5 µM)

102 (20 µM) 102 (10 µM)

82 (20 µM) 82 (10 µM)

Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 nhuộm Hoechst 33342 tác động mẫu nghiên cứu nồng độ khác

3.10)

Bảng 3.10 Hoạt tính caspase - 102 82

% Tế bào Apoptosis

Hợp chất

102 (20 µM)

102 (10 µM) 102 (5 µM) 82 (20µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) Camptothecin (5µM) (-) Đối chứng

Giá trị 1.36* 1.21* 1.01 1.08 1.12 1.11 1.67** 1.00

Độ lệch 0.033 0.013 0.037 0.023 0.056 0.040 0.020 0.070

- * P<0.05 and ** P<0.01

Kết thu có chất 102 làm tăng đáng kể tế bào apoptotic so với đối chứng âm nồng độ, cụ thể tăng từ 1.21 1.36 lần nồng độ tương ứng 10 µM (P <0.05) 20 µM (P <0.01) Điều chất 102 kích hoạt đường caspase để kích hoạt q trình apoptosis tế bào MCF7 sau dẫn đến ức chế tăng sinh

Nghiên cứu cảm ứng apoptosis phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm FITC-anexin V PI

anexin V thường kết hợp với Propidium iodid (PI) để xác định apoptosis sớm muộn Thông qua phương pháp này, tế bào sống khơng nhuộm với loại mầu nhuộm Tế bào biểu apoptosis sớm bắt màu với FITC-anexin V, tế bào biểu apoptosis muộn bắt mầu với FITC-anexin V PI; tế bào chết hoại tử bắt mầu với thuốc nhuộm PI Kết phân tích trắc lưu tế bào thể Bảng 3.11 Hình 3.6 cho thấy hợp chất 82 102 nồng độ µM, 10 µM 20 µM thể ảnh hưởng đến tế bào apoptotic (cả sớm muộn qua giai đoạn) dòng tế bào ung thư vú MCF7, sau 24 tiếp xúc Dữ liệu có hợp chất 102 cho kết làm tăng đáng kể tế bào apoptotic (P <0.05) Được ghi nhận qua thống kê sống sót tế bào khối u MCF7 giảm xử lý hợp chất 102 so với đối chứng âm, chất 102 nồng độ 20 µM làm tăng tốc độ tế bào apoptosis sớm muộn từ 18.32% đến 42.24% từ 1.90% đến 6.73% Những kết chứng minh khả hợp chất 102 gây trình apoptosis, đặc biệt giai đoạn đầu apoptosis tế bào MCF7

Bảng 3.11 Tỉ lệ tế bào apoptosis

Mẫu thí nghiệm % tế bào hoại tử

% tế bào

apoptosis sớm

% tế bào

apoptosis muộn

% tế bào apoptosis

ĐC âm 0.22 18.32 1.90 20.22

82 (20 µM) 1.39 18.49 4.08 22.57

82 (10 µM) 0.27 21.62 4.59 26.21

82 (5 µM) 0.16 22.74 3.27 26.01

102 (20 µM) 0.42 42.24 6.73 48.97*

102 (10 µM) 0.49 19.90 3.45 23.35

102 (5 µM) 0.27 15.84 2.17 18.01

Camptothecin (5µM) 0.08 73.83 4.96 78.79**

Tế bào ủ với mẫu 82 (20 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với mẫu 82 (10 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với mẫu 82 (5 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với mẫu 102 (20 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với mẫu 102 (10 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với mẫu 102 (5 µg/ml) 48h

Tế bào ủ với 0.5% DMSO 48h

Tế bào ủ với µM Camptothecin 48h

tích hệ thống trắc lưu tế bào Trục x thể mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log

Phần kết luận xác định khả cảm ứng apoptosis mẫu nghiên cứu

Qua việc xác định cảm ứng apoptosis qua ba phương pháp phát apoptosis hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, caspase - Flow cytometry tổng kết:

 Mẫu 82 nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.57- 26.21%  Mẫu 102, nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis

sớm muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% 1.90% đến 6.7%, cách tương ứng Ở nồng độ thấp làm tăng nhẹ (10 µg/ml 5µg/ml) tỉ lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm

 Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ 78.79%  Mẫu 82 chưa thể rõ khả cảm ứng apoptosis với nồng độ nghiên

cứu thử nghiệm thực hiện;

 Mẫu 102 nồng độ 10 µM có khả cảm ứng apoptosis tế bào MCF7 thông qua cảm ứng sinh caspase với hàm lượng tăng 1.21 lần so với đối chứng âm (P<0.05);

 Mẫu 102 nồng độ 20 µM có khả cảm ứng apoptosis tế bào MCF7 thông qua: gây cô đặc phân mảnh nhân tế bào với tỉ lệ 12.386%; cảm ứng sinh caspase -3 với hàm lượng tăng 1.36 lần so với đối chứng âm (P<0.01); quần thể tế bào apoptosis tăng đặc biệt quần thể apoptosis sớm tăng 42.24% thông qua kĩ thuật trắc lưu tế bào (P<0.05)

Do hoạt động ức chế tiềm trình tăng sinh tế bào, tiến trình chu kỳ tế bào sản sinh PGE2 Các hợp chất 102 82 chọn để đánh giá khả tương tác chúng với COX2 tubulin mơ hình docking phân tử Các kết gắn kết làm sáng tỏ chế hoạt động hợp chất nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học in vitro Bước đầu tiên, docking ba hợp chất celecoxib, colchicine combretastatin A4 lên COX2 tubulin, sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 Việc mô tiến hành cấu trúc tinh thể khác hai mục tiêu để tìm tương quan nghiên cứu cảm ứng chất mục tiêu

Bảng 3.12 Lựa chọn cấu trúc COX2 tubulin tương ứng sử dụng cho chương trình docking

Hợp chất

Giá trị (Kcal/mol)

COX2 Tubulin ∆G (1)-(4)

3LN1 (1)

1CX2 (2) 6BL3 (3) 1Z2B (4) 3DU7 (5) 3E22 (6)

102 -11.90 - 11.45 -11.40 - 8.06 - 7.92 -8.98 -3.84

82 -11.92 - 10.48 -11.78 - 9.37 -8.96 -8.70 -2.55

CA4 -9.63 - 7.83 -7.76 - 7.75 - 6.30 -6.71 -1.88

Colchicin - - - -8.06 -7.85 -7.18 -

Celecoxib -11.50 -10.90 -11.03 - - - -

cần xác định phối tử tham chiếu chọn cho q trình này; đó, hợp chất có lượng gần với hai – 11.50 kcal /mol (COX2) – 8.06 kcal /mol (tubulin) coi chất ức chế tiềm hai mục tiêu protein Hợp chất 102 liên kết với mục tiêu COX2 với điểm docking – 11.90 kcal /mol cao chút so với celecoxib (- 11.50 kcal /mol) combretastatin A-4 (- 9.63 kcal / mol) (Bảng 3.13) Phân tích định hướng liên kết cho thấy Val335, Leu345, Val509, Ala513 Leu517 có tương tác alkyl Pi-alkyl; tương tác hydro cacbon quan sát Gly512 Ser516; hai liên kết Pi – sigma với Ser339 Tyr371; tương tác ổn định thông qua hình thành liên kết hydro với Gln178, Leu338, Phe504 (Hình 3.6, Hinhh 3.7) Những tương tác phù hợp với nghiên cứu trước [129-130] Đối với thử nghiệm docking tubulin, hợp chất 102 có giá trị – 8.06 kcal /mol, tương đương với colchicine cao so với combretastatin A-4 (- 7.75 kcal /mol) Phân tích docking hợp chất 102 với tubulin Asn101, Ala250, Asn258, Met259, Lys352 chìa khóa khẳng định hình thành liên kết hydro liên kết cộng hóa trị thấy Val238, Cys241 (Halogen); Leu248, Leu255 Ala316 (Loại liên kết pi-alkyl); Lys254 Val351 (liên kết hydro cacbon) (Hình 3.7)

cho hai mục tiêu coi chất ức chế kép COX2 / tubulin tiềm năng, tương tác chúng phân tích thêm cách sử dụng mơ hình Studio Visualizer Tính tốn thu kết sử dụng để dự đốn chất ức chế tốt cho mơ hình protein dựa độ lệch (Δ) giá trị tương tác COX2 tubulin (Phương trình 1–2)

Đặc biệt, tất hợp chất có giá trị liên kết gắn với COX2 âm liên kết với tubulin (Bảng 3.14). Phối tử cho thấy tỷ lệ gắn kết lượng tổng số nguyên tử (không kể nguyên tử hiđro) [130] Điều gây khác biệt cấu trúc vị trí liên kết hai protein gợi ý hợp chất thiết kế có lợi cho liên kết với COX2 nhiều tubulin Docking hợp chất 102 với COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro nhóm sulfonamid (NH2) Gln178, Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71; 2.93; 3.33 Å, tương ứng), vị trí liên kết tubulin nhóm tạo ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352 (khoảng cách = 2.91; 3.20; Tương ứng 2.86 Å) Ngoài ra, tương tác hợp chất 102 tubulin tăng cường thông qua hai liên kết hydro trimethoxybenzen với Asn101, Ala250 Phân tích liên kết hợp chất 82 liên kết hydro hình thành nhóm etyl este (CO2C2H5) với Arg106

COX2 Ala250 tubulin (khoảng cách = 2.99; 3.18 Å, tương ứng); đặc biệt NO2 82 liên kết với Phe504 COX2 Liên kết hỗ trợ giả định nhóm sulfonamit etyl este đóng vai trị quan trọng hoạt động kép hợp chất 102 82 Mặt khác, trimethoxybenzen nhóm aryl giả định đặc trưng cho đặc điểm liên kết hợp chất với mục tiêu protein

Hợp chất

Năng lƣợng (kcal/mol)

COX2 (3LN1) Tubulin (1Z2B)

102 -11.90 -8.06

82 -11.92 -9.37

Combretastatin A-4 -9.63 -7.75

Colchicin - -8.06

Celecoxib -11.50 -

(A) (B)

(C) (D)

(A)

(B)

(C)

Hình 3.7. Vị trí gắn kết 2D hợp chất thiết kế với protein COX2 PDB ID: 3LN1) tubulin (PDB ID: 1Z2B) (A) hợp chất 102 với COX2; (B) hợp chất 102 với tubulin; (C) hợp chất 82 với COX2; (D) hợp chất 82 với tubulin

Docking 82 –COX2

Docking 82 – tubulin

Docking 102 – COX2

82 –COX2 82 – tubulin

102- COX2 102 -tubulin

Hinh 3.8 Hình ảnh stereo mẫu chất

Bảng 3.14 Tương tác hợp chất, phối tử COX2 (ID: 3LN1) mơ hình protein

tubulin (ID: 1Z2B)

Hợp chất thiết kế

Năng lượng liên kết (LE)

COX2 Tubulin ΔLE

102 - 0.38 - 0.26 -0.12

82 - 0.38 - 0.30 -0.08

Colchicin - - 0.28 -

Celecoxib - 0.44 - -

3.5 Thảo luận

Sản phẩm thu dẫn xuất pyrazol thay aryl

tổng hợp cấu trúc giống với cis-diphenylethylen Qua nghiên cứu hoạt tính sinh học

cơ chế kháng viêm kháng ung thư cho thấy, chất thu có chất, chất 82 102 thể hoạt tính chống tăng sinh chống viêm mạnh Hai chất lai có tác dụng ức chế đồng thời sản xuất prostaglandin E2 (PGE2) tế bào RAW 264,7 đại thực bào kích hoạt LPS tiến triển chu kỳ tế bào bị ức chế tế bào MCF7 pha G2 /M G0 /G1 Riêng chất 102 có hoạt tính gây apoptosis thơng qua hoạt hóa caspase-3 Hơn nữa, qua mơ hình docking phân tử cho thấy, hai chất cho thấy lượng gắn kết tốt với mục tiêu protein COX-2 tubulin tương tác phân tử mẫu Qua đó, đưa số điểm lưu

ý cấu trúc hoạt tính phân tử lai sau: Cấu hình cis-diphenylethylene

celecoxib combretastatin A-4 nhóm chức ethyl nhóm este

và sulfonamit, CF3 coi đặc điểm tiềm cho hoạt tính kép

hợp chất nghiên cứu có mặt nhóm trimethoxybenzene đặc điểm quan trọng để làm tăng hoạt tính kháng ung thư hợp chất lai Sản

phẩm chất lai 82 102 thể hoạt tính kháng viêm kháng ung thư lý

axit, 01 hợp chất lai coxib – combretastatin chứa nhóm CF3

2 Đã đánh giá hoạt tính sinh học 22 chất dịng tế bào ung thư người HT-29, Hep-G2, MCF-7 ức chế sản sinh NO Trong có 12 chất 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hoạt tính trội so với chất gốc celecoxib, 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 có hoạt tính IC50 < 10 µM

3 Đã đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO ung thư vú MCF-7 chất lai coxib – combretastatin dạng gốc axit tiến hành so sánh hoạt tính với chất lai coxib – combretastatin dạng gốc este Tuy nhiên, kết cho thấy có 02 chất 118 114 thể độc tính tế bào dòng MCF-7 mạnh celecoxib 02 chất 116 111 tương đương với hoạt tính ức chế sản sinh NO celecoxib

4 Đã đánh giá hoạt tính kháng ung thư kháng viêm 05 chất 102, 96, 81, 82, 94 celecoxib thông qua xác định khả ức chế sản sinh PEG2, phân tích chu kỳ tế bào hoạt tính gây apotosis thông qua xác định khả gây apotosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, thị caspase ‑ trắc lưu tế bào

5 Đã thu chất tiêu biểu 82 102 phân tử đa đích sinh học, có hoạt tính trội hoạt tính kháng ung thư so với combretastatin kháng viêm so với celecoxib,

6 Trên mơ hình docking phân tử, khảng định hai chất 82 102 thể hoạt tính kép với hai đích tác dụng tubulin COX2 theo mục tiêu thiết kế luận án Các chất thu được chứng minh không độc với tế bào thường mơ hình in vitro

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1 Đã tổng hợp thành cơng 41 phân tử lai đa đích sinh học coxib – combretatastatin theo mục tiêu thiết kế ban đầu

2 Đã sàng lọc hoạt tính kháng viêm NO kháng ung thư HepG2, HT-29, MCF7 lớp chất lai

3 Đã chứng minh chế hoạt tính sinh học hợp chất lai với mơ hình in vitro

Ngo “Design, Synthesis and Biological Activities of New Pyrazole Derivatives Possessing Both Coxib and Combretastatins Pharmacophores” Chem Biodiversity, 2019

2 Quoc Anh Ngo, Thuy Hang Nguyen Thi, Minh Quan Pham, Domenico Delfno, Thi Thao Do “Antiproliferative and antiinfammatory coxib–combretastatin hybrids suppress cell cycle progression and induce apoptosis of MCF7 breast cancer cells” Molecular Diversity, 2020

3 Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Lê Anh, Trần Thị Yến, Võ Ngọc Bình, Vũ Đình Hồng, Ngơ Quốc Anh “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất lai ghép combretastatin celecoxib” Tạp chí hóa học, 2017, 55(4E23), 235-239

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bode, A M.; Dong, Z., Cancer prevention research—then and now Nature Reviews Cancer,2009, 9, (7), 508-516

2 Zhan, P.; Liu, X., Designed multiple ligands: an emerging anti-HIV drug discovery paradigm Current pharmaceutical design,2009, 15, (16), 1893-1917

3 Gediya, L K.; Njar, V C., Promise and challenges in drug discovery and development of hybrid anticancer drugs Expert opinion on drug discovery, 2009, 4, (11), 1099-1111

4 Dai, Z.-J.; Ma, X.-B.; Kang, H.-F.; Gao, J.; Min, W.-L.; Guan, H.-T.; Diao, Y.; Lu, W.-F.; Wang, X.-J., Antitumor activity of the selective cyclooxygenase-2 inhibitor, celecoxib, on breast cancer in vitro and in vivo Cancer cell international, 2012, 12, (1), 1-8

5 Grösch, S.; Tegeder, I.; Niederberger, E.; Bräutigam, L.; Geisslinger, G., COX‐2 independent induction of cell cycle arrest and apoptosis in colon cancer cells by the selective COX‐2 inhibitor celecoxib The FASEB journal,2001, 15, (14), 1-22

6 Viegas-Junior, C.; Danuello, A.; da Silva Bolzani, V.; Barreiro, E J.; Fraga, C A M., Molecular hybridization: a useful tool in the design of new drug prototypes Current medicinal chemistry,2007, 14, (17), 1829-1852

7 Morphy, R.; Kay, C.; Rankovic, Z., From magic bullets to designed multiple ligands Drug discovery today, 2004, 9, (15), 641-651

11 Sabet, R.; Mohammadpour, M.; Sadeghi, A.; Fassihi, A., QSAR study of isatin analogues as in vitro anti-cancer agents European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (3), 1113-1118

12 Singh, P.; Sharma, P.; Anand, A.; Bedi, P.; Kaur, T.; Saxena, A.; Kumar, V., Azide-alkyne cycloaddition en route to novel 1H-1, 2, 3-triazole tethered isatin conjugates with in vitro cytotoxic evaluation European journal of medicinal chemistry, 2012, 55, 455-461

13 Guibourt, N J B G., Histoire abrégée des drogues simples Société encyclographique des sciences médicales: 1839; Vol

14 Piazzi, L.; Cavalli, A.; Colizzi, F.; Belluti, F.; Bartolini, M.; Mancini, F.; Recanatini, M.; Andrisano, V.; Rampa, A., Multi-target-directed coumarin derivatives: hAChE and BACE1 inhibitors as potential anti-Alzheimer compounds Bioorganic & medicinal chemistry letters,2008, 18, (1), 423-426

15 Amin, K M.; Eissa, A A.; Abou-Seri, S M.; Awadallah, F M.; Hassan, G S., Synthesis and biological evaluation of novel coumarin–pyrazoline hybrids endowed with phenylsulfonyl moiety as antitumor agents European Journal of Medicinal Chemistry,2013, 60, 187-198

16 Belluti, F.; Fontana, G.; Dal Bo, L.; Carenini, N.; Giommarelli, C.; Zunino, F., Design, synthesis and anticancer activities of stilbene-coumarin hybrid compounds: Identification of novel proapoptotic agents Bioorganic & medicinal chemistry, 2010, 18, (10), 3543-3550

18 Gupta, A.; Saha, P.; Descôteaux, C.; Leblanc, V.; Asselin, É.; Bérubé, G., Design, synthesis and biological evaluation of estradiol–chlorambucil hybrids as anticancer agents Bioorganic & medicinal chemistry letters,2010, 20, (5), 1614-1618 19 Kuduk, S D.; Zheng, F F.; Sepp-Lorenzino, L.; Rosen, N.; Danishefsky, S J., Synthesis and evaluation of geldanamycin-estradiol hybrids Bioorganic & medicinal chemistry letters,1999, 9, (9), 1233-1238

20 Kuduk, S D.; Harris, C R.; Zheng, F F.; Sepp-Lorenzino, L.; Ouerfelli, Q.; Rosen, N.; Danishefsky, S J., Synthesis and evaluation of geldanamycin–testosterone hybrids Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2000, 10, (11), 1303-1306

21 Kumar, R.; Lown, J., Recent developments in novel pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepine conjugates: synthesis and biological evaluation Mini reviews in medicinal chemistry,2003, 3, (4), 323-339

22 Bose, D S.; Idrees, M.; Todewale, I K.; Jakka, N.; Rao, J V., Hybrids of privileged structures benzothiazoles and pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepin-5-one, and diversity-oriented synthesis of benzothiazoles European journal of medicinal chemistry,2012, 50, 27-38

23 Kamal, A.; Srikanth, Y.; Ramaiah, M J.; Khan, M N A.; Reddy, M K.; Ashraf, M.; Lavanya, A.; Pushpavalli, S.; Pal-Bhadra, M., Synthesis, anticancer activity and apoptosis inducing ability of bisindole linked pyrrolo [2, 1-c][1, 4] benzodiazepine conjugates Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2012, 22, (1), 571-578

24 Kim, M.-Y.; Na, Y.; Vankayalapati, H.; Gleason-Guzman, M.; Hurley, L H., Design, synthesis, and evaluation of psorospermin/quinobenzoxazine hybrids as structurally novel antitumor agents Journal of medicinal chemistry, 2003, 46, (14), 2958-2972

25 Nepali, K.; Sharma, S.; Kumar, D.; Budhiraja, A.; L Dhar, K., Anticancer hybrids-a patent survey Recent patents on anti-cancer drug discovery, 2014, 9, (3), 303-339

2-28 Ducki, S.; Mackenzie, G.; Greedy, B.; Armitage, S.; Chabert, J F D.; Bennett, E.; Nettles, J.; Snyder, J P.; Lawrence, N J., Combretastatin-like chalcones as inhibitors of microtubule polymerisation Part 2: Structure-based discovery of alpha-aryl chalcones Bioorganic & medicinal chemistry,2009, 17, (22), 7711-7722

29 Downing, K H., Structural basis for the interaction of tubulin with proteins and drugs that affect microtubule dynamics Annual review of cell and developmental biology,2000, 16, (1), 89-111

30 Kaur, R.; Kaur, G.; Gill, R K.; Soni, R.; Bariwal, J., Recent developments in tubulin polymerization inhibitors: An overview European journal of medicinal chemistry,2014, 87, 89-124

31 Airy Shaw, H., A dictionary of the flowering plants and ferns Cambridge: CUP, 1973

32 Watt, J M.; Breyer-brandwijk, M G., The Medicinal and Poisonous Plants of Southern and Eastern Africa being an Account of their Medicinal and other Uses, Chemical Composition, Pharmacological Effects and Toxicology in Man and Animal E & S Livingstone Ltd.: 16-17, Teviot Place, Edinburgh, 1962; p xii + 1457 pp

33 Hartwell, J., Plants used against cancer (A survey) Quarterman Publications Inc Lawrence, Massachu setts,1982, 408

34 Cushman, M.; Nagarathnam, D.; Gopal, D.; Chakraborti, A K.; Lin, C M.; Hamel, E., Synthesis and evaluation of stilbene and dihydrostilbene derivatives as potential anticancer agents that inhibit tubulin polymerization Journal of medicinal chemistry,1991, 34, (8), 2579-2588

36 Tozer, G M.; Kanthou, C.; Parkins, C S.; Hill, S A., The biology of the combretastatins as tumour vascular targeting agents International journal of experimental pathology,2002, 83, (1), 21-38

37 Parihar, S.; Kumar, A.; Chaturvedi, A K.; Sachan, N K.; Luqman, S.; Changkija, B.; Manohar, M.; Prakash, O.; Chanda, D.; Khan, F., Synthesis of combretastatin A4 analogues on steroidal framework and their anti-breast cancer activity The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2013, 137, 332-344

38 Shen, L.; Yang, X.; Yang, B.; He, Q.; Hu, Y., Novel hybrids from lamellarin D and combretastatin A as cytotoxic agents European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (1), 11-18

39 Kamal, A.; Mallareddy, A.; Ramaiah, M J.; Pushpavalli, S.; Suresh, P.; Kishor, C.; Murty, J.; Rao, N S.; Ghosh, S.; Addlagatta, A., Synthesis and biological evaluation of combretastatin-amidobenzothiazole conjugates as potential anticancer agents European journal of medicinal chemistry,2012, 56, 166-178

40 Rasolofonjatovo, E.; Provot, O.; Hamze, A.; Bignon, J.; Thoret, S.; Brion, J.-D.; Alami, M., Regioselective hydrostannation of diarylalkynes directed by a labile ortho bromine atom: An easy access to stereodefined triarylolefins, hybrids of combretastatin A-4 and isocombretastatin A-4 European journal of medicinal chemistry, 2010, 45, (9), 3617-3626

41 Nam, N.-H., Combretastatin A-4 analogues as antimitotic antitumor agents Current medicinal chemistry,2003, 10, (17), 1697-1722

42 Levy, M.; Spino, M.; Read, S E., Colchicine: a state‐of‐the‐art review Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 1991, 11, (3), 196-211

45 Zefirova, O N.; Nurieva, E V.; Shishov, D V.; Baskin, I I.; Fuchs, F.; Lemcke, H.; Schröder, F.; Weiss, D G.; Zefirov, N S.; Kuznetsov, S A., Synthesis and SAR requirements of adamantane–colchicine conjugates with both microtubule depolymerizing and tubulin clustering activities Bioorganic & medicinal chemistry, 2011, 19, (18), 5529-5538

46 Li, W.; Li, M.-f.; Yang, D.; Xu, R.; Zhang, Y.-r., Production of podophyllotaxin by root culture of Podophyllum hexandrum Royle Electron J Biol,2009, 5, (2), 34-9 47 Hartwell, J.; Schrecker, A., The chemistry of Podophyllum In Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe/Progress in the Chemistry of Organic Natural Products/Progrès dans la Chimie des Substances Organiques Naturelles, Springer: 1958; pp 83-166

48 Damayanthi, Y.; Lown, J W., Podophyllotoxins: current status and recent developments Current medicinal chemistry, 1998, 5, 205-252

49 Kamal, A.; Laxman, E.; Khanna, G R.; Reddy, P.; Rehana, T.; Arifuddin, M.; Neelima, K.; Kondapi, A K.; Dastidar, S G., Design, synthesis, biological evaluation and QSAR studies of novel bisepipodophyllotoxins as cytotoxic agents Bioorganic & medicinal chemistry,2004, 12, (15), 4197-4209

50 Kamal, A.; Suresh, P.; Ramaiah, M J.; Mallareddy, A.; Kumar, B A.; Raju, P.; Gopal, J V.; Pushpavalli, S.; Lavanya, A.; Sarma, P., Synthesis and biological evaluation of 4β-acrylamidopodophyllotoxin congeners as DNA damaging agents Bioorganic & medicinal chemistry,2011, 19, (15), 4589-4600

52 Kamal, A.; Ramakrishna, G.; Raju, P.; Viswanath, A.; Ramaiah, M J.; Balakishan, G.; Pal-Bhadra, M., Synthesis and anti-cancer activity of chalcone linked imidazolones Bioorganic & medicinal chemistry letters,2010, 20, (16), 4865-4869 53 Nagaraju, M.; Deepthi, E G.; Ashwini, C.; Vishnuvardhan, M.; Nayak, V L.; Chandra, R.; Ramakrishna, S.; Gawali, B., Synthesis and selective cytotoxic activity of novel hybrid chalcones against prostate cancer cells Bioorganic & medicinal chemistry letters,2012, 22, (13), 4314-4317

54 Overmeyer, J H.; Young, A M.; Bhanot, H.; Maltese, W A., A chalcone-related small molecule that induces methuosis, a novel form of non-apoptotic cell death, in glioblastoma cells Molecular Cancer,2011, 10, (1), 69

55 Nepali, K.; Ojha, R.; Sharma, S.; MS Bedi, P.; L Dhar, K., Tubulin inhibitors: a patent survey Recent patents on anti-cancer drug discovery,2014, 9, (2), 176-220 56 Wittman, M D.; Kadow, J F.; Vyas, D M.; Lee, F L.; Rose, W C.; Long, B H.; Fairchild, C.; Johnston, K., Synthesis and antitumor activity of novel paclitaxel– chlorambucil hybrids Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2001, 11, (6), 811-814

57 Smith, A B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P H.; Horwitz, S B., Design and Synthesis of (+)-Discodermolide–Paclitaxel Hybrids Leading to Enhanced Biological Activity Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 54, (18), 6319-6327

58 Smith III, A B.; Sugasawa, K.; Atasoylu, O.; Yang, C.-P H.; Horwitz, S B., Design and synthesis of (+)-discodermolide–paclitaxel hybrids leading to enhanced biological activity Journal of medicinal chemistry,2011, 54, (18), 6319-6327

59 Huang, G S.; Lopez-Barcons, L.; Freeze, B S.; Smith, A B.; Goldberg, G L.; Horwitz, S B.; McDaid, H M., Potentiation of taxol efficacy by discodermolide in ovarian carcinoma xenograft-bearing mice Clinical cancer research, 2006, 12, (1), 298-304

Life Sciences CMLS,1999, 56, (1-2), 133-142

63 Wilson, L.; Jordan, M.; Morse, A.; Margolis, R., Interaction of vinblastine with steady-state microtubules in vitro Journal of molecular biology, 1982, 159, (1), 125-149

64 Passarella, D.; Giardini, A.; Peretto, B.; Fontana, G.; Sacchetti, A.; Silvani, A.; Ronchi, C.; Cappelletti, G.; Cartelli, D.; Borlak, J., Inhibitors of tubulin polymerization: Synthesis and biological evaluation of hybrids of vindoline, anhydrovinblastine and vinorelbine with thiocolchicine, podophyllotoxin and baccatin III Bioorganic & medicinal chemistry,2008, 16, (11), 6269-6285

65 Lin, C M.; Singh, S.; Chu, P.; Dempcy, R.; Schmidt, J.; Pettit, G.; Hamel, E., Interactions of tubulin with potent natural and synthetic analogs of the antimitotic agent combretastatin: a structure-activity study Molecular pharmacology, 1988, 34, (2), 200-208

66 Pettit, G R.; Lippert, J W., 3rd, Antineoplastic agents 429 Syntheses of the combretastatin A-1 and combretastatin B-1 prodrugs Anticancer Drug Des, 2000, 15, (3), 203-16

67 Pinney, K G.; Jelinek, C.; Edvardsen, K.; Chaplin, D J.; Pettit, G R., The discovery and development of the combretastatins Anticancer agents from natural products,2005, 23-46

68 Pettit, G.; Lippert, J., Preparation of combretastatin A-1 phosphate and combretastatin B-1 phosphate prodrugs with increased solubility, PCT Int Application WO2001081355 A,1, 2001

69 Pettit, G.; Minardi, M., Preparation of combretastatin A3 diphosphate prodrugs for the treatment of cancer, PCT Int Application WO2002102766 A,2, 2002

derivatives of combretastatin A-4 as molecular probes for tubulin Bioorganic & medicinal chemistry,2000, 8, (10), 2417-2425

71 Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Morinaga, Y.; Suga, Y.; Nihei, Y.; Ohishi, K.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Synthesis and antitumor activities of amino acid prodrugs of amino-combretastatins Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14, (6), 539-548

72 Hadimani, M B., Studies toward the discovery of new classes of privileged molecules as colchicine-site binding ligands for tubulin: Structure-based design, synthesis and bioactivity of small ligands targeted at tumor vasculature Baylor University: 2004

73 Pettit, G R.; Anderson, C R.; Herald, D L.; Jung, M K.; Lee, D J.; Hamel, E.; Pettit, R K., Antineoplastic agents 487 Synthesis and biological evaluation of the antineoplastic agent 3, 4-methylenedioxy-5, ‘-dimethoxy-3 ‘-amino-Z-stilbene and derived amino acid amides Journal of medicinal chemistry,2003, 46, (4), 525-531 74 Lawrence, N J.; Hepworth, L A.; Rennison, D.; McGown, A T.; Hadfield, J A., Synthesis and anticancer activity of fluorinated analogues of combretastatin A-4 Journal of fluorine chemistry,2003, 123, (1), 101-108

75 Davis, P D., Compositions with vascular damaging activity Google Patents: 2006

76 Gaukroger, K.; Hadfield, J A.; Lawrence, N J.; Nolan, S.; McGown, A T., Structural requirements for the interaction of combretastatins with tubulin: how important is the trimethoxy unit? Organic & biomolecular chemistry, 2003, 1, (17), 3033-3037

77 Cragg, G M.; Kingston, D G.; Newman, D J., Anticancer agents from natural products CRC press: 2011

78 Janik, M E.; Bane, S L., Synthesis and antimicrotubule activity of combretatropone derivatives Bioorganic & medicinal chemistry, 2002, 10, (6), 1895-1903

Isocombretastatins A: 1,1-Diarylethenes as potent inhibitors of tubulin polymerization and cytotoxic compounds Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009, 17, (17), 6422-6431

81 Jiménez, C.; Ellahioui, Y.; Álvarez, R.; Aramburu, L.; Riesco, A.; González, M.; Vicente, A.; Dahdouh, A.; Ibn Mansour, A.; Jiménez, C.; Martín, D.; Sarmiento, R G.; Medarde, M.; Caballero, E.; Peláez, R., Exploring the size adaptability of the B ring binding zone of the colchicine site of tubulin with para-nitrogen substituted isocombretastatins European journal of medicinal chemistry,2015, 100, 210-222 82 Holwell, S.; Cooper, P.; Thompson, M.; Pettit, G.; Lippert, J.; Martin, S.; Bibby, M., Anti-tumor and anti-vascular effects of the novel tubulin-binding agent combretastatin A-1 phosphate Anticancer research,2002, 22, (6 C), 3933-3940

83 Hill, S A.; Toze, G.; Pettit, G R.; Chaplin, D J., Preclinical evaluation of the antitumour activity of the novel vascular targeting agent Oxi 4503 Anticancer research,2002, 22, (3), 1453-1458

84 Shnyder, S.; Cooper, P.; Pettit, G.; Bibby, M., Combretastatin A-1 phosphate potentiates the antitumour activity of cisplatin in a murine adenocarcinoma model Anticancer research,2003, 23, (2B), 1619-1623

85 Hua, J.; Sheng, Y.; Pinney, K G.; Garner, C M.; Kane, R R.; Prezioso, J A.; Pettit, G R.; Chaplin, D J.; Edvardsen, K., Oxi4503, a novel vascular targeting agent: effects on blood flow and antitumor activity in comparison to combretastatin A-4 phosphate Anticancer research,2003, 23, (2B), 1433-1440

87 Guerram, M.; JIANG, Z.-Z.; Zhang, L.-Y., Podophyllotoxin, a medicinal agent of plant origin: past, present and future Chinese Journal of Natural Medicines, 2012, 10, (3), 161-169

88 Banday, A H.; Kulkarni, V V.; Hruby, V J., Design, synthesis, and biological and docking studies of novel epipodophyllotoxin–chalcone hybrids as potential anticancer agents MedChemComm,2015, 6, (1), 94-104

89 Ameen, D.; Snape, T J., Chiral 1, 1-diaryl compounds as important pharmacophores MedChemComm,2013, 4, (6), 893-907

90 Patterson, D.; Rustin, G.; Serradell, N.; Rosa, E.; Bolos, J., Combretastatin A-4 phosphate Drugs Future,2007, 32, 1025-1032

91 Rimando, A M.; Suh, N., Biological/chemopreventive activity of stilbenes and their effect on colon cancer 2008

92 Griggs, J.; Metcalfe, J C.; Hesketh, R., Targeting tumour vasculature: the development of combretastatin A4 The lancet oncology,2001, 2, (2), 82-87

93 Kluza, J.; Gallego, M.-A.; Loyens, A.; Beauvillain, J.-C.; Sousa-Faro, J.-M F.; Cuevas, C.; Marchetti, P.; Bailly, C., Cancer cell mitochondria are direct proapoptotic targets for the marine antitumor drug lamellarin D Cancer Research, 2006, 66, (6), 3177-3187

94 Banwell, M G.; Hamel, E.; Hockless, D C.; Verdier-Pinard, P.; Willis, A C.; Wong, D J., 4, 5-Diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylates as combretastatin A-4/lamellarin T hybrids: Synthesis and evaluation as anti-mitotic and cytotoxic agents Bioorganic & medicinal chemistry,2006, 14, (13), 4627-4638

95 Sharma, V.; Bhatia, P.; Alam, O.; Javed Naim, M.; Nawaz, F.; Ahmad Sheikh, A.; Jha, M., Recent advancement in the discovery and development of COX-2 inhibitors: Insight into biological activities and SAR studies (2008–2019) Bioorganic Chemistry,2019, 89, 103007

Journal of Chemistry,2017, 41, (1), 16-41

99 Murahari, M.; Mahajan, V.; Neeladri, S.; Kumar, M S.; Mayur, Y C., Ligand based design and synthesis of pyrazole based derivatives as selective COX-2 inhibitors Bioorganic Chemistry,2019, 86, 583-597

100 Brullo, C.; Massa, M.; Rapetti, F.; Alfei, S.; Bertolotto, M B.; Montecucco, F.; Signorello, M G.; Bruno, O., New hybrid pyrazole and imidazopyrazole antinflammatory agents able to reduce ROS production in different biological targets Molecules,2020, 25, (4), 899

101 Punganuru, S R.; Madala, H R.; Mikelis, C M.; Dixit, A.; Arutla, V.; Srivenugopal, K S., Conception, synthesis, and characterization of a rofecoxib-combretastatin hybrid drug with potent cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibiting and microtubule disrupting activities in colon cancer cell culture and xenograft models Oncotarget,2018, 9, (40), 26109

102 Nayak, N.; Ramprasad, J.; Dalimba, U., Synthesis and antitubercular and antibacterial activity of some active fluorine containing quinoline–pyrazole hybrid derivatives Journal of Fluorine Chemistry,2016, 183, 59-68

103 Alegaon, S G.; Hirpara, M B.; Alagawadi, K R.; Hullatti, K K.; Kashniyal, K., Synthesis of novel pyrazole–thiadiazole hybrid as potential potent and selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, (22), 5324-5329

104 Zhang, X.; Chen, J.; Davis, B.; Kiechle, F., Hoechst 33342 induces apoptosis in HL-60 cells and inhibits topoisomerase I in vivo Archives of Pathology and Laboratory Medicine,1999, 123, (10), 921-927

106 Schnecke, V.; Kuhn, L A., Virtual screening with solvation and ligand-induced complementarity In Virtual Screening: An Alternative or Complement to High Throughput Screening?, Springer: 2000; pp 171-190

107 Fu, R.-g.; Sun, Y.; Sheng, W.-b.; Liao, D.-f., Designing multi-targeted agents: an emerging anticancer drug discovery paradigm European journal of medicinal chemistry,2017, 136, 195-211

108 Ohsumi, K.; Hatanaka, T.; Fujita, K.; Nakagawa, R.; Fukuda, Y.; Nihei, Y.; Suga, Y.; Morinaga, Y.; Akiyama, Y.; Tsuji, T., Syntheses and antitumor activity of cis-restricted combretastatins: 5-membered heterocyclic analogues Bioorganic & medicinal chemistry letters,1998, 8, (22), 3153-3158

109 Kurumbail, R G.; Stevens, A M.; Gierse, J K.; McDonald, J J.; Stegeman, R A.; Pak, J Y.; Gildehaus, D.; Penning, T D.; Seibert, K.; Isakson, P C., Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents Nature, 1996, 384, (6610), 644-648

110 Lala, P K.; Chakraborty, C., Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression The lancet oncology,2001, 2, (3), 149-156

111 Del Grosso, E.; Boschi, D.; Lazzarato, L.; Cena, C.; Di Stilo, A.; Fruttero, R.; Moro, S.; Gasco, A., The Furoxan System: Design of Selective Nitric Oxide (NO) Donor Inhibitors of COX‐2 Endowed with Anti‐Aggregatory and Vasodilating Activities Chemistry & biodiversity,2005, 2, (7), 886-900

112 Boschi, D.; Lazzarato, L.; Rolando, B.; Filieri, A.; Cena, C.; Di Stilo, A.; Fruttero, R.; Gasco, A., Nitrooxymethyl‐Substituted Analogues of Celecoxib: Synthesis and Pharmacological Characterization Chemistry & Biodiversity, 2009, 6, (3), 369-379

113 Bozzo, F.; Bassignana, A.; Lazzarato, L.; Boschi, D.; Gasco, A.; Bocca, C.; Miglietta, A., Novel nitro-oxy derivatives of celecoxib for the regulation of colon cancer cell growth Chemico-biological interactions,2009, 182, (2-3), 183-190

research,1985, 45, (10), 4779-4784

117 Schrey, M.; Patel, K., Prostaglandin E production and metabolism in human breast cancer cells and breast fibroblasts Regulation by inflammatory mediators British Journal of Cancer,1995, 72, (6), 1412-1419

118 Rakesh, K.; Wang, S.-M.; Leng, J.; Ravindar, L.; Asiri, A M.; Marwani, H M.; Qin, H.-L., Recent development of sulfonyl or sulfonamide hybrids as potential anticancer agents: a key review Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents),2018, 18, (4), 488-505 119 Zhai, J.; Gu, C.; Jiang, J.; Zhang, S.; Liao, D.; Wang, L.; Zhu, D.; Ji, Y., A One‐ pot Approach to Ethyl 1, 4, 5‐Triaryl‐1H‐pyrazole‐3‐carboxylates via an Improved Claisen Condensation‐Knorr Reaction Sequence Chinese Journal of Chemistry, 2013, 31, (12), 1526-1538

120 Monks, A.; Scudiero, D.; Skehan, P.; Shoemaker, R.; Paull, K.; Vistica, D.; Hose, C.; Langley, J.; Cronise, P.; Vaigro-Wolff, A., Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines JNCI: Journal of the National Cancer Institute,1991, 83, (11), 757-766

121 Waskewich, C.; Blumenthal, R D.; Li, H.; Stein, R.; Goldenberg, D M.; Burton, J., Celecoxib exhibits the greatest potency amongst cyclooxygenase (COX) inhibitors for growth inhibition of COX-2-negative hematopoietic and epithelial cell lines Cancer research,2002, 62, (7), 2029-2033

122 Li, Y.; Niu, Y.; Wu, H.; Zhang, B.; Sun, Y.; Huang, H.; Li, Q.; Fan, L.; Liu, L.; Mei, Q., PC‐407, a celecoxib derivative, inhibited the growth of colorectal tumor in vitro and in vivo Cancer science,2009, 100, (12), 2451-2458

mechanism in human hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line Cancer chemotherapy and pharmacology, 2010, 65, (5), 903-911

124 Cheenpracha, S.; Park, E.-J.; Rostama, B.; Pezzuto, J M.; Chang, L C., Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A Marine drugs,2010, 8, (3), 429-437

125 Tarade, D.; Ma, D.; Pignanelli, C.; Mansour, F.; Simard, D.; van den Berg, S.; Gauld, J.; McNulty, J.; Pandey, S., Structurally simplified biphenyl combretastatin A4 derivatives retain in vitro anti-cancer activity dependent on mitotic arrest Plos one, 2017, 12, (3), e0171806

126 Belloc, F.; Dumain, P.; Boisseau, M R.; Jalloustre, C.; Reiffers, J.; Bernard, P.; Lacombe, F., A flow cytometric method using Hoechst 33342 and propidium iodide for simultaneous cell cycle analysis and apoptosis determination in unfixed cells Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 1994, 17, (1), 59-65

127 Porter, A., Jaenicke RU Emerging roles of caspase-3 in apoptosis Cell Death Differ,1999, 6, 99-104

128 Van Engeland, M.; Nieland, L J.; Ramaekers, F C.; Schutte, B.; Reutelingsperger, C P., Annexin V‐affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology,1998, 31, (1), 1-9

129 Pérez, D J.; Díaz-Reval, M I.; Obledo-Benicio, F.; Zakai, U I.; Gómez-Sandoval, Z.; Razo-Hernández, R S.; West, R.; Sumaya-Martínez, M T.; Pineda-Urbina, K.; Ramos-Organillo, Á., Silicon containing ibuprofen derivatives with antioxidant and anti-inflammatory activities: An in vivo and in silico study European Journal of Pharmacology,2017, 814, 18-27