Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận án tiến sĩ: Nghiên cứu cải thiện khả năng mang thuốc chống ung thư cisplatin của chất mang nano dendrimer

- Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, G3.5- PNIPAM-Cisplatin-5FU và G4.0-PAA-Cisplatin thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng th[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA

CHẤT MANG NANO DENDRIMER

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN NGỌC HÒA

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG MANG THUỐC CHỐNG UNG THƯ CISPLATIN CỦA CHẤT MANG

NANO DENDRIMER

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử tổ hợp Mã số: 44 01 25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS TS NGUYỄN CỬU KHOA PGS TS TRẦN NGỌC QUYỂN

LỜI CAM ĐOAN

Cơng trình thực phịng Vật liệu Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thành phố Hồ Chí Minh phịng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ Việt Đức - trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan là cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học GS TS Nguyễn Cửu Khoa PGS TS Trần Ngọc Quyển Các nội dung nghiên cứu, kết quả đề tài trung thực, hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác

Tác giả luận án

LỜI CÁM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Cửu Khoa PGS TS Trần Ngọc Quyển, dành cho động viên giúp đỡ tận tình định hướng khoa học hiệu suốt trình thực luận án

Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Học viện Khoa học Công nghệ, Khoa Khoa học vật liệu Năng lượng, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng tơi q trình thực luận án

Tôi xin cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trường Đại học Cơng Nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh tơi q trình thực luận án

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Mục tiêu luận án

Ý nghĩa khoa học luận án

Đóng góp luận án

Chương TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu dendrimer

1.1.1 Khái niệm phân loại

1.1.2 Tính tương hợp sinh học dendrimer 10

1.1.2.1 Độc tính tế bào in vitro dendrimer 11

1.1.2.2 Độc tính tế bào in vivo dendrimer 12

1.1.3 Phương pháp tổng hợp dendrimer 12

1.1.3.1 Các phương pháp tổng hợp 13

1.1.3.2 Tổng hợp dendrimer polyamidoamine 14

1.1.4 Các phương pháp xác định tính chất dendrimer 17

1.1.5 Ứng dụng dendrimer trị liệu 18

1.1.5.1 Hoạt tính trị liệu dendrimer 18

1.1.5.2 Cải thiện độ hòa tan thuốc 19

1.1.5.3 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc qua da 20

1.1.5.4 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc uống 20

1.1.5.6 Dendrimer vận chuyển gen 21

1.1.5.7 Dendrimer vận chuyển vaccine 22

1.2 Thuốc chống ung thư chứa Platin 22

1.2.1.1 Tính chất Cisplatin 22

1.2.1.2 Cơ chế tác động Cisplatin tế bào 24

1.2.1.3 Cơ chế kháng thuốc Cisplatin 27

1.2.1.4 Độc tính Cisplatin 28

1.2.2 Sử dụng Cisplatin để điều trị ung thư 29

1.2.3 Các thuốc chống ung thư khác có chứa Platin 31

1.2.4 Điều trị kết hợp Cisplatin với thuốc ung thư khác 32

1.2.5 Các hệ chất mang thuốc Cisplatin 33

1.2.5.1 Liposome mang thuốc Cisplatin 35

1.2.5.2 Viên nang nano chứa phức Cisplatin phủ lipid 36

1.2.5.3 Các polymer mang thuốc chứa platin 37

1.2.5.4 Ống nano carbon mang thuốc Cisplatin 38

1.2.5.5 Polymer mixen mang thuốc platin 39

1.2.5.6 Hệ chất mang dendrimer - platin 41

1.3 Polymer nhạy nhiệt - poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) 45

1.4 Polymer nhạy pH - Poly Acrylic Acid (PAA) 46

Chương NGHIÊN CỨU 48

2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu 48

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 48

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 48

2.2 Thực nghiệm 50

2.2.1 Hóa chất 50

2.2.2 Dụng cụ thiết bị 51

2.3.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine

(EDA) 53

2.3.2 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin 56

2.3.3 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin 57

2.3.4 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5-Cisplatin SA (có sử dụng siêu âm) 58

2.3.5 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.0 biến tính với PNIPAM 59

2.3.6 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5 biến tính với PNIPAM 60

2.3.7 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin 61

2.3.8 Tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA 63

2.3.9 Tổng hợp PAMAM dendrimer G4.0 biến tính với PAA 64

2.3.10 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin 64

2.3.11 Thử nghiệm khả mang thuốc 5-FU phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin 65

2.3.12 Xác định hàm lượng Pt phương pháp ICP-MS 66

2.3.13 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro 67

2.3.14 Nang hóa giải phóng thuốc 5-FU 67

2.3.15 Động học dược động học giải phóng thuốc 68

2.3.16 Kiểm tra độc tố tế bào 70

Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 72

3.1 Tổng hợp PAMAM Dendrimer hệ G-0.5 đến G4.5 72

3.1.1 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS 72 3.1.2 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR 73

3.2.1 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-CisPt,

G3.5-CisPt, G4.5-CisPt 80

3.2.2 Phổ FTIR phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 83 3.3 Phổ FTIR phức G3.0-PAA với Cisplatin 85

3.4 Phổ FTIR phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

3.5 Kết phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 G 3.5 biến tính với PNIPAM 87

3.6 Kết 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA 90

3.7 Kết 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA 91

3.8 Kết đo hàm lượng Pt 92

3.8.1 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ chẵn-Cisplatin 93

3.8.2 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ lẻ– Cisplatin (không thủy phân) 93

3.8.3 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân) 94

3.8.4 Kết đo hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) có sử dụng siêu âm 96

3.9 So sánh khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang điều kiện khơng thủy phân có thủy phân Cisplatin 96

3.10 Thử nghiệm khả mang đồng thời hai thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM 98

3.11 Kết đo TEM, DLS zeta 100

3.12 Kết bàn luận khả giải phóng thuốc in vitro 106

3.12.1 Khả giải phóng thuốc phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân) 106

3.12.3 Khả giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer

G4.0-PAA 111

3.13 Động học trình giải phóng thuốc Cisplatin 112

3.14 Dự đốn mơ hình dược động học hệ mang thuốc 115

3.15 Kết bàn luận khả gây độc tế bào 117

3.15.1 Kết bàn luận khả gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 hệ chất mang PAMAM G4.5 117

3.15.2 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang G4.0-PAA 117

3.15.3 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang hai thuốc cispaltin 5-FU 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 124

KẾT LUẬN 124

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Độc tính gây điện tích bề mặt dendrimer [6] 12

Bảng 1.2 Điều trị phối hợp Cisplatin loại thuốc ung thư khác [35] 33

Bảng 1.3 Các hệ chất mang liposome – platin [60] 35

Bảng 2.1 Các hóa chất tinh khiết dùng nghiên cứu thực nghiệm 51

Bảng 3.1 Khối lượng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS 73

Bảng 3.2 Kết tính tốn KLPT Dendrimer theo 1H-NMR 80

Bảng 3.3 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5-CisPt 82

Bảng 3.4 Kết phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 83

Bảng 3.5 Phổ FTIR G3.0-PAA phức G3.0-PAA-Cisplatin 85

Bảng 3.6 Phổ FTIR G4.0-PAA phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

Bảng 3.7 Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 ước lượng KLPT 89

Bảng 3.8 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân) 93

Bảng 3.9 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân) 93

Bảng 3.10 Hàm lượng Pt phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin 94

Bảng 3.11 Hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) 96

Bảng 3.12 Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer 97

Bảng 3.13 Khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer 98

Bảng 3.15 Kết giải phóng thuốc in vitro của phứcPAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin 107 Bảng 3.16 Khảo sát khả giải phóng thuốc 5FU hệ chất mang G3.5-PNIPAM-CisPt G3.5-PNIPAM-CisPt 110 Bảng 3.17 Kết giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA 111 Bảng 3.18 Giá trị AIC R2

hc theo mơ hình động học hệ mang thuốc

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Random Hyperbranched, dendrigraft, dendron dendrimer

Hình 1.4 Dendrimer cầu nối N dendrimer cầu nối aryl

Hình 1.5 Dendrimer với tâm NH3 (a) tâm BDA (b)

Hình 1.6 Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→2

Hình 1.7 Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→3 10

Hình 1.8 Tương tác sinh học tế bào với dendrimer có điện tích bề mặt khác [9] 10

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp dendrimer theo phương pháp divergent 13

Hình 1.10 Tổng hợp dendrimer phương pháp covergent 14

Hình 1.11 Tổng hợp dendrimer phương pháp tăng lũy thừa hai 14

Hình 1.12 Công thức phân tử G3.0 PAMAM dendrimer 15

Hình 1.13 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5 16

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 16

Hình 1.15 PAMAM dendrimer G 1.0 16

Hình 1.16 PAMAM dendrimer G 2.0 17

Hình 1.17 Các phương pháp xác định tính chất dendrimer 18

Hình 1.18 Cấu trúc dendrimer SPL7013 (MW 16.581 Da) 19

Hình 1.19 Dendrimer vận chyển DNA tới màng tế bào 21

Hình 1.20 Cấu tạo Cisplatin 22

Hình 1.21 Một số loại thuốc chống ung thư Platin chấp thuận đưa vào sử dụng 24

Hình 1.23 Sơ đồ tạo phức tác động phức Pt-DNA tế bào 26

Hình 1.24 A-Cisplatin; B-Carboplatin; C-Oxaliplatin; D-Ormaplatin; 31

E-Enloplatin 31

Hình 1.25 Các hệ chất mang khác phát triển tiền lâm sàng lâm sàng 34

Hình 1.26 Các hệ liên hợp thuốc polymer - platin 38

Hình 1.27 Hệ chất mang polymer mixen mang thuốc platin 39

Hình 1.28 Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM dendrimer hệ chẵn – Pt2+ 43

Hình 1.29 Sơ đồ phản ứng tổng hợp phức PAMAM G 3.5-Cisplatin 43

Hình 1.30 Cơng thức cấu tạo PNIPAM-COOH 45

Hình 1.31 Các polymer nhạy pH có chứa nhóm acid 47

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer 53

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ lẻ 54

Hình 2.3 Sơ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ chẵn 56

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM G3.0-Cisplatin PAMAM G4.0-Cisplatin 57

Hình 2.5 Sơ đồ qui trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5-Cisplatin có khơng sử dụng siêu âm 59

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp G3.0-PNIPAM 60

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM 61

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt 62

Hình 2.9 Sơ đồ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0-PAA G4.0-PAA 63

Hình 3.1.Cấu trúc PAMAM Dendrimer hệ 72

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR PAMAM Dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 79 Hình 3.3 Phổ FTIR PAMAM dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-Cisplatin, G3.5-G2.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin 81

Hình 3.4 Phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin 84

Hình 3.5 Phổ FTIR G3.0-PAA phức G3.0-PAA-Cisplatin 85

Hình 3.6 Phổ FTIR G4.0-PAA phức G4.0-PAA-Cisplatin 86

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR chất mang nano G3.0-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) 87

Hình 3.8 Kết GPC G3.0-PINIPAM (1:8) 89

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR G3.5-PNIPAM 90

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:12) 90

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G 4.0 biến tính với PAA (tỉ lệ mol 1:16) 92

Hình 3.12 Đường chuẩn xác định hàm lượng Pt 93

Hình 3.13 Ảnh TEM phức PAMAM dendrimer hệ lẻ - Cisplatin 100

Hình 3.14 Ảnh TEM mẫu PAMAM dendrimer G3.0, PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM DLS mẫu PAMAM dendrimer G3.0-G3.0-PNIPAM 101

Hình 3.15 Ảnh TEM mẫu PNIPAM-Cisplatin DLS mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin mẫu G3.5-PNIPAM-Cisplatin 102

Hình 3.16 Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 (A), G4.0-PAA (C) DLS PAMAM dendrimer G4.0 (B), G4.0-PAA (D) 102

Hình 3.17 Ảnh TEM hệ PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin 103

Hình 3.19 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) thay đổi theo pH: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5 105 Hình 3.20 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) thay đổi theo pH: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5 105 Hình 3.21 Độ tan hệ chất mang phụ thuộc vào pH dung dịch 106 Hình 3.22 Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 môi trường đệm PBS pH 7,4 đệm ABS pH 5,5 107 Hình 3.23 Lượng Cisplatin giải phóng theo thời gian khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer môi trường đệm pH 5,5 pH 7,4 108 Hình 3.24 Biểu đồ giải phóng thuốc 5-Flourouracil (5-FU) môi trường pH 7,4 pH 5,5 nhiệt độ 37oC 111

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

5-FU 5-Fuorouracil

A Absorbance Độ hấp thu

ABS Acetate Buffer Solution Dung dịch đệm acetate

ACN Acetonitrile Acetonitrile

AIC Akaike Information Criterion Tiêu chuẩn thông tin Akaike ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate AUC Area Under Curve Diện tích đường cong

CAT Catalase Enzyme Enzyme Catalase

Cisplatin Cis-diamminedichloroplatinum (II)

Cis-diamminedichloroplatinum (II)

Da Dalton Dalton

DACHPt

Dichloro(1,2-Diaminocyclohexane) Platinum (II)

Dichloro(1,2-Diaminocyclohexane) Platinum (II)

DI Deionized Nước khử ion

DL% % Drug loading

Hàm lượng thuốc nang hóa tổng trọng lượng chất mang

EDA Ethylenediamine Ethylenediamine

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

EE% % drug entrapment

FTIR Fourier transform infrared spectroscopy

Phương pháp quang phổ hồng ngoại

GBM Glioblastoma Khối u não

GPC Gel Permeation

Chromatography

Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

GPX Glutathione Peroxidase Glutathione Peroxidase

GSH Glutathione Glutathione

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSDB Hazardous Substances Data

Bank

Ngân hàng liệu chất độc hại

ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry

Quang phổ nguồn Plasma cảm ứng cao tần ghép nối khối phổ LCST Low Critical Solution

Temperature

Dung dịch có nhiệt độ tới hạn thấp

MA Methylacrylate Methylacrylate

MCF-7 Michigan Cancer Foudation-7 Tế bào ung thư vú người MPEG Methoxy Polyethylene glycol Methoxy Polyethylene glycol

MW Molecular weight Khối lượng phân tử

MWCO Molecular weight cut-off Molecular weight cut-off NCI-H460 NCI-H460 Human Lung

Carcinoma

Tế bào ung thư phổi người

NER Nucleotide Excision Repair Sửa chữa DNA theo hình thức cắt bỏ

NHS N-hydroxy succinimide N-hydroxy succinimide PAA Acid Poly acrylic Acid Poly acrylic

PAMAM Polyamidoamine Polyamidoamine

PAMAM G2.0

Polyamidoamine generation 2.0

PAMAM G3.0

Polyamidoamine generation 3.0

Polyamidoamine generation 3.0

PAMAM G4.0

Polyamidoamine generation 4.0

Polyamidoamine generation 4.0

PAMAM G5.0

Polyamidoamine generation 5.0

Polyamidoamine generation 5.0

PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối đệm photphat PNIPAM Poly N-isopropylacrylamide Poly N-isopropylacrylamide PPI Poly propyleneimine Poly propyleneimine

ROS Radical oxygen species Dạng oxy hoạt động

SA Siêu âm

SCLCs Small Cell Lung Cancers Ung thư phổi tế bào nhỏ SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét SOD Superoxide Dismutase Superoxide Dismutase

SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B

T Transmittance Độ truyền qua

TEM Transmission Electrons

Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua UCST Upper Critical Solution

Temperature

Dung dịch có nhiệt độ tới hạn cao

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu

1 MỞ ĐẦU

Các polymer tự nhiên polymer tổng hợp đối tượng thu hút nhà khoa học lĩnh vực nghiên cứu đại Các vật liệu nano polymer sinh học tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để ứng dụng lĩnh vực dược phẩm y sinh học Trong số vật liệu này, dendrimer lên chất mang nano polymer đầy triển vọng dùng để mang loại thuốc điều trị

Dendrimer lần tổng hợp từ năm 1970-1990 hai nhóm khác (Buhleier cộng sự; Tomalia cộng sự) Ngược lại với polymer cao phân tử mạch nhánh thẳng thông thường, dendrimer kiểm soát chặt chẽ cấu trúc có nhóm chức bề mặt biến tính dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng [1], [2]

Hiện nay, số lượng công trình nghiên cứu dendrimer cơng bố ngày nhiều, tập trung vào khảo sát khả dendrimer việc vận chuyển hoạt chất sinh học khác nhau, ví dụ như: thuốc, oligonucleotide, enzyme vaccine [3] Các dendrimer thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học phân phối sinh học thuốc tăng cường khả hướng đích thuốc Dendrimer tương tác với phân tử thuốc cách hấp phụ bề mặt, tương tác tĩnh điện liên kết với nhóm chức bề liên kết hóa trị cách bao gói thuốc vào khoang trống dendrimer Các khoang trống bên thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với loại thuốc hòa tan Sự tồn nguyên tử nitơ oxy cấu trúc bên dendrimer cho phép tương tác liên kết hydro với thuốc Với số lượng lớn nhóm chức bề mặt dendrimer (như amine -NH2 nhóm cacboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn loại thuốc khác

nhau tương tác tĩnh điện vận chuyển chúng đến đích [4]

2

khác [4], [5] Mặt khác, nghiên cứu Cisplatin gây nhiều tác dụng phụ thần kinh, độc tính với thận ức chế tủy xương Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein enzyme gây việc điều chỉnh chế sinh hóa chúng Quá trình điều trị ung thư Cisplatin dẫn tới tế bào ung thư trở nên kháng Cisplatin làm giảm khả điều trị thuốc [5] Nhiều chế kháng Cisplatin nghiên cứu bao gồm thay đổi hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế trình chết tế bào apoptosis tăng sửa chữa DNA

Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin giảm độ gây độc tế bào Cisplatin, liệu pháp tổ hợp phát triển chứng minh hiệu điều trị bệnh ung thư Một giải pháp việc sử dụng PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin

Trong luận án này, tiếp tục cải thiện khả mang thuốc Cisplatin PAMAM dendrimer sở tăng cường nhóm chức bề mặt dendrimer nhằm tăng khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang Mục tiêu luận án

Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu mang thuốc Cisplatin

Hình Cơ chế mang thuốc PAMAM dendrimer hệ lẻ [6]

P

3

Hình 2: Cơ chế mang thuốc hệ G4.0-PAA-Cisplatin [6]

Hình Cơ chế mang thuốc hệ G3.5-PNIPAM-Cisplatin Ý nghĩa khoa học luận án

Kết nghiên cứu luận án cho thấy số kết luận có ý nghĩa khoa học sau:

4

Hình Định hướng thụ động theo chế EPR [7], [8]

- Thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức

và kết hợp sóng siêu âm trình tổng hợp phức dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin, G3.0-PAA-Cisplatin G4.0-G3.0-PAA-Cisplatin làm tăng khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang

- Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc Cisplatin chậm ổn định điều kiện in vitro

- Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM có khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác

- Các hệ chất mang phức PAMAM dendrimer Cisplatin, G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU G4.0-PAA-Cisplatin thể khả giảm độc tính thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư có khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5

Đóng góp luận án

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin

pH = 7,4

5

- Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin có khơng có sử dụng sóng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm carboxylate

bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ kết hợp với siêu âm làm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin

- Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM Đã tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1

H-NMR Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) Cisplatin (35,22%) áp dụng để mang loại thuốc khác

- Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với tỉ lệ mol khác Tính tốn số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer tính KPLT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất

mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 15 nhóm thể khả mang thuốc Cisplatin tốt (40,44%) Phức G4.0-PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự (có IC50 cao gấp lần

Cisplatin tự do) thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư thể khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5

- Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc chậm ổn định điều kiện in vitro

6

Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dendrimer

1.1.1 Khái niệm phân loại

Khái niệm dendrimer Donald A Tomalia cộng đưa vào năm 1985 [1] Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa nhánh Từ đến có nhiều cơng trình nghiên cứu cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp ứng dụng dendrimer nhiều lĩnh vực khác [3], [9], [10], [11], [12], [13]

Dendrimer nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt so với polymer mạch thẳng

Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Dendrimer

7

Các dendrimer phân loại theo tiêu chí sau: (a) Theo cấu trúc hình học [3], [7], [14]

Theo cấu trúc hình học, dendrimer phân chia thành dạng sau: dendrgraft; dendron; dendrimer (hình 1.2)

(b) Theo nguyên tử tạo nhánh khác

Theo nguyên tử tạo nhánh khác phân chia gọi tên khác (hình 1.3): nhánh N; nhánh aryl; nhánh C; nhánh Si; nhánh Saccharide; nhánh P;

8

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác (c) Theo loại kết nối

Theo loại kết nối (connectivity) phân chia gọi tên theo loại liên kết hóa học vị trí kết nối (hình 1.4): cầu nối aryl; cầu nối amide; cầu nối este; cầu nối ether; cầu nối N; cầu nối O; cầu nối Si; cầu nối urea; cầu nối alkyl; cầu nối alken; cầu nối alkyn; …

(d) Theo thành phần tâm khác

Dendrimer nhánh N Dendrimer nhánh Aryl

CN CN

CN NC (C6H13)2N

CNCN NC

CN N(C6H13)2

CN CN CN CN N(C6H13)2

CN NC NC

CN

N(C6H13)2

CNCN NC

CN N(C6H13)2

NC NC

CN CN

N(C6H13)2

CN NC NC

CN

N(C6H13)2

NC CN CN NC

N(C6H13)2

NC NC

CN CN

N(C6H13)2

CN CN

CN NC (C6H13)2N

NC CN CN NC

N(C6H13)2

CN CN CN CN (C6H13)2N

N N

N NH2

H2N

N NH2 NH2 N N NH2

H2N

N NH2 NH2 N N N H2N NH

2

N H2N

H2N

N N H2N NH2

N H2N

H2N

9

Dendrimer phân chia theo thành phần tâm khác nhau: ví dụ tâm NH3, ethylenediamine (EDA), butylenediamine (BDA), Aryl, … Do tâm có

kích thước khác nên phản ứng tạo dendrimer bị ảnh hưởng khơng

gian khác tâm có độ phân cực khác nên phần không gian bên phân tử dendrimer có độ phân cực khác nhau, ảnh hưởng tới khả nang hóa hoạt chất có độ phân cực khác (hình 1.5)

(e) Theo mối nối tạo nhánh 1→2 1→3

Mơ hình tạo nhánh 1→2: Đó mơ hình từ nhánh hệ trước tạo hai nhánh hệ sau (tổng hợp divergent) Ví dụ từ nguyên tử X tách thành hai nhánh Z, từ Z tiếp tục tách thành hai nhánh Z hệ (hình 1.6)

Hình 1.5 Dendrimer với tâm NH3 (a) tâm BDA (b)

10

Mô hình tạo nhánh 1→3: Đó mơ hình từ nhánh hệ trước tạo ba nhánh hệ sau Ví dụ từ nguyên tử X tách thành ba nhánh Y, từ nhánh Y tiếp tục tách thành ba nhánh Z hệ (hình 1.7)

Hình 1.7 Tổng hợp divergent theo mơ hình tạo nhánh 1→3 1.1.2 Tính tương hợp sinh học dendrimer

Các dendrimer xem chất mang thông minh chúng có khả mang thuốc vào nội bào, vượt qua rào cản sinh học, lưu thông thể thời gian cần thiết để gây hiệu ứng lâm sàng nhắm tới mục tiêu cụ thể Độc tính dendrimer chủ yếu gây nhóm bề mặt (hình Hình 1.8 Tương tác sinh học tế bào với dendrimer có điện tích bề mặt khác

11

1.8) Nhóm amine (-NH2) bề mặt PAMAM PPI dendrimer gây độc tính

chứng huyết tan (hemolysis) tùy theo nồng độ chúng nhóm ngồi nhóm trung tính anion có độc tính thấp khơng độc [9]

Khả gây độc tế bào dendrimer cation gây tương tác màng tế bào tích điện âm bề mặt dendrimer tích điện dương, làm cho dendrimer bám vào làm hỏng màng tế bào, gây giảm lượng tế bào Trong việc che nhóm cation bề mặt chuyển đổi nhóm bề mặt thành nhóm trung tính anion làm cho dendrimer có độc tính thấp chí khơng có độc tính nghiên cứu in vitro in vivo, điển dendrimer trung tính: polyester, polyether dendrimer biến tính bề mặt: dendrimer glycosylate, PEGylate

Các tính chất sinh học dendrimer phụ thuộc nhiều vào kích thước dendrimer nhóm chức bề mặt dendrimer phụ thuộc vào cấu trúc bên dendrimer Với nhóm chức bề mặt, dendrimer biến tính để tạo tính chất sinh học đặc biệt

1.1.2.1 Độc tính tế bào in vitro dendrimer

Dendrimer có nhiều nhóm chức bề mặt chúng tích điện khác Dendrimer với nhóm chức amine (-NH2) tích điện dương dính với phần âm

bề mặt tế bào tương tác tĩnh điện tạo thành “lỗ thủng” làm cho màng tế bào tác dụng ngăn cản tế bào bị dung giải (coi bị phá hủy) hình thành tượng nhập bào (endocytosis): cho phép dendrimer thâm nhập qua màng tế bào (thông qua ẩm bào – pinocytosis) vào tế bào phá vỡ tế bào từ bên

Dendrimer với nhóm chức khơng phân cực ví dụ nhân thơm dãy lipid bề mặt dendrimer có khả làm cho tế bào bị dung giải Do lúc lipid dendrimer tương tác dầu với lớp lipid màng tế bào gây nên phá hủy màng tế bào

12

các phản ứng alkyl hóa amit hóa nhóm amine Độ độc dendrimer phụ thuộc nhóm chức bề mặt theo trình tự sau [6]:

-NH3+ > -Guanidyl+ > -SO3- > -PO3- > OH- > -COO- > PEG

Bảng 1.1 Độc tính gây điện tích bề mặt dendrimer [6] Bề mặt

dendrimer dương

điện

Bề mặt dendrimer

âm điện

Bề mặt dendrimer

trung tính khơng mang điện

Bề mặt dendrimer

phân cực không mang điện

Độ độc in vitro - + -

Kết độc tính in vitro:

+ - - -

Tính thẩm thấu sinh học

+ -/+ + -

Sinh miễn dịch + + + -

1.1.2.2 Độc tính tế bào in vivo dendrimer

PAMAM dendrimer có nhóm amine bề mặt dẫn xuất chúng hệ G ≤ 5.0 khơng cho thấy dấu hiệu độc tính in vivo. Tuy nhiên, PAMAM dendrimer G7.0 có nhóm amine bề mặt gây chết 20% chuột thí nghiệm sau 24 liều 45mg/kg Các PAMAM dendrimer G > 6.0 khơng khuyến khích sử dụng sinh học độ độc cao chúng

Nghiên cứu in vivo với dendrimer melamine cho thấy với liều lượng 160 mg/kg làm chết 100% chuột thí nghiệm sau tiêm 6-12

Dendrimer sở polysine chứa nhóm bề mặt Sulfonat Carboxylat cho thấy khả diệt mạnh Herpes simplex virut (HSV) thử nghiệm in vivo cho thấy không độc với nồng độ sử dụng 10 mg/mL

Dendrimer hệ chẵn (nhóm amine bề mặt) có độc tính với tế bào (in vivo) cao so với dendrimer hệ lẻ (nhóm ester bề mặt) [6]

13 1.1.3.1 Các phương pháp tổng hợp

Dendrimer tổng hợp nhiều phương pháp phương pháp “tổng hợp phân kỳ” (devergent), “tổng hợp hội tụ” (convergent), “tổng hợp tăng lũy thừa hai” (double exponential), …

a Phương pháp “tổng hợp phân kỳ” (divergent) [11], [14]

Phương pháp tổng hợp dendrimer biết đến phương pháp phân kỳ Tên gọi xuất phát từ cách thức phát triển dendrimer từ tâm bên phân nhánh vào không gian Bắt đầu từ tâm phản ứng, hệ phát triển sau ngoại vi phân tử hoạt hóa để phản ứng với monomer khác Qui trình lặp lại cho nhiều hệ dendrimer khác nhau, chúng xây dựng từ lớp sang lớp khác (hình 1.9)

Ưu điểm phương pháp tổng hợp dendrimer hệ cao Nhược điểm lớn phương pháp thường hay xảy nhiều phản ứng phụ sản phẩm sinh có nhiều khuyết tật Tổng hợp hệ cao, số lượng phản ứng tăng khiếm khuyết dendrimer nhiều Nếu phản ứng phụ xảy nhiều điều gây trở ngại cho việc tinh chế sản phẩm sau

b Phương pháp “tổng hợp hội tụ” (convergent) [11], [14]

Phương pháp hội tụ phát triển phản ứng tổng hợp điểm khuyết phương pháp phân kỳ Quá trình tổng hợp theo phương pháp convergent đơn vị bề mặt dendrimer, cấu trúc bên liên kết với đơn vị bề mặt Quá trình tổng hợp gồm hai bước: hoạt hóa phát triển nhánh Khi nhánh phát triển đủ lớn, số gắn vào tâm để dendrimer hồn chỉnh (hình 1.10) Việc tinh chế sản phẩm mong muốn tương đối dễ dàng xuất khuyết tật cấu trúc cuối giảm thiểu Phương pháp hội tụ khơng cho phép hình

14

thành hệ dendrimer cao vấn đề hiệu ứng không gian xảy phản ứng dendron tâm phân tử

Hình 1.10 Tổng hợp dendrimer phương pháp covergent c Phương pháp “tổng hợp tăng lũy thừa hai” (double exponential)

Gần bước đột phá việc tổng hợp dendrimer phương pháp tăng trưởng theo cấp số nhân (hình 1.11) Trong thực tế, tăng trưởng theo cấp số nhân nhanh, lặp lặp lại có lẽ có hai ba lần trước tiếp tục tăng trưởng Các phương pháp cung cấp phương tiện nhờ mà đoạn hình kéo dài theo hướng hội tụ hay phân kỳ theo hướng khác tùy theo yêu cầu Bằng cách này, khía cạnh tích cực hai phương pháp áp dụng mà không cần thiết để ý đến nhược điểm chúng

Hình 1.11 Tổng hợp dendrimer phương pháp tăng lũy thừa hai 1.1.3.2 Tổng hợp dendrimer polyamidoamine

Dendrimer polyamidoamine (PAMAM) dendrimer tạo thành sở phản ứng amide phản ứng Michael [3]

15

Polyamidoamine tổng hợp từ tâm (core) khác với tác nhân tạo mạch nhánh methylacrylate (MA) ethylenediamine (EDA) Sản phẩm tâm (ví dụ NH3 hay EDA), qua hai phản ứng amide hóa phản ứng

Michael Nhóm -NH2 thực phản ứng Michael với methylacrylate, phản ứng

amide hóa xảy nhóm –COO- phân tử methylacrylate vừa gắn vào

phản ứng với nhóm -NH2 phân tử EDA tiếp đưa đến hình thành

hệ dendrimer

PAMAM dendrimer quan tâm nhiều có nhóm chức bề mặt -NH2 hay -COO- hoạt động Do PAMAM dễ tan nhiều loại dung môi

phân cực phân cực, dễ biến tính tạo hợp chất với cấu trúc đa dạng tính chất vơ phong phú

Hình 1.12 Cơng thức phân tử G3.0 PAMAM dendrimer

Trong tổng hợp dendrimer PAMAM sử dụng nhiều tâm khác nhau: EDA, BDA, hexylenediamine (HAD), hay NH3 Với tâm khác nhau, có kích

16

PAMAM dendrimer với tâm EDA tổng hợp theo sơ đồ sau:

Tiếp tục thực trình tổng hợp thu PAMAM dendrimer hệ G 0.5; G 1.5; G 2.5; G 3.0; G3.5; G 4.0

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G Hình 1.13 Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5

17

1.1.4 Các phương pháp xác định tính chất dendrimer

Các dendrimer hệ khác với nhóm chức bề mặt như: OH, -NH2, -COCH3, -COOH, -CN) dendrimer biến tính bề mặt với:

folate, PEG, Glycosylated, v.v.) tách xác định phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC, UPLC), NMR, Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Visible), nhiễu xạ tia X (XRD)… Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), NMR, phổ quang điện tử tia X (XPS) sử dụng để xác định nhóm chức bề mặt dendrimer Kính hiển vi điện tử quét (SEM) kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) dùng để kích thước, hình dạng, hình thái bề mặt dendrimer, khối phổ MALDI-TOF-MS dùng để xác định khối lượng dendrimer (hình 1.22) [15], [16]

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

18

Kolhatkar cộng [17] sử dụng phổ MALDI-TOF-MS xác định khối lượng phân tử dendrimer PAMAM (G2.0, G4.0) dẫn xuất chúng Độ

sai lệch khối lượng nằm khoảng 0-6% so sánh với giá trị khối lượng mol tính tốn theo lý thuyết xác định MALDI-TOF-MS

Hiện tại, nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng sử dụng phổ 1H-NMR để tính tốn khối lượng phân tử dendrimer tính tốn mức độ chuyển hóa dẫn xuất dendrimer với tác nhân khác phương pháp có độ xác tương đương MALDI-TOF-MS [18], [19]

Ngoài ra, việc sử dụng TEM, SEM giúp theo dõi hình thái kích thước nano hạt dendrimer tạo thành

1.1.5 Ứng dụng dendrimer trị liệu

Dendrimer với kích thước nano cấu trúc khơng gian rỗng bên phân tử nơi chứa thuốc lý tưởng nhóm chức bề mặt kết nối với thuốc nhóm chức khác nhóm hướng đích, nhóm quang hoạt (fluorescent) giúp nhà khoa học theo dõi hướng đi, đường đi, vị trí thuốc sau đưa vào thể Cách tiếp cận đặc biệt hiệu điều trị rối loạn gây tử vong ung thư bệnh ký sinh trùng gây [20]

1.1.5.1 Hoạt tính trị liệu dendrimer

TEM; SEM SEC

GPC

NMR; Điện hóa; Điện di

DSC UV; IR; NIR; MS, Huỳnh quang; XRD

Xác định tính chất Dendrimer

19

Các nghiên cứu cho thấy dendrimer - polylysine thể khả kháng virut herpes simplex (HSV), kết thử nghiệm lâm sàng Pha II cho thấy hiệu hợp chất nhiễm trùng âm đạo

Sản phẩm SPL7013 Gel (VivaGel®) Starpharma Pty Ltd (Melbourne, Australia) phát triển chất diệt vi khuẩn âm đạo để ngăn ngừa nhiễm HIV HSV Thành cơng VivaGel® (Starpharma) làm tiền đề cho việc phát triển thuốc trị liệu khác dendrimer [21]

Hình 1.18 Cấu trúc dendrimer SPL7013 (MW 16.581 Da)

Wang cộng [22] đánh giá chế hoạt tính kháng khuẩn PAMAM dendrimer lợn Guinea mắc bệnh viêm màng ối gây

Escherichia coli làm nhiễm trùng tử cung Các tác giả cho hoạt tính chống vi khuẩn tương tác dendrimer polycation với lipolisaccharide polyanion có E coli Một nghiên cứu khác cho thấy PAMAM G3.5 dendrimer glycosyl hoá với glucosamine có hoạt tính chống viêm Với đặc tính dendrimer glycosyl hóa ứng dụng điều trị bệnh ác tính, bệnh viêm bệnh truyền nhiễm [23]

1.1.5.2 Cải thiện độ hòa tan thuốc

20

chống viêm không steroid (NSAID) chống tăng huyết áp, [12], [24] Sự hòa tan thuốc qua trung gian dendrimer phụ thuộc yếu tố kích thước hệ, nồng độ dendrimer, pH, lõi, đơn vị phân nhánh bên trong, nhóm bề mặt nhiệt độ Hiệu hịa tan dendrimer dễ dàng thay đổi cách điều chỉnh lõi, đơn vị phân nhánh nhóm bề mặt biến tính bề mặt phân tử ưa nước [25], [26], [20], [27] Nghiờn cu ca F.E Koỗ v cộng [28] cho thấy dendrimer chất tăng cường khả hòa tan hiệu cho thuốc NSAID Ketoprofen, Ibuprofen and Diflunisa Nghiên cứu Dib cộng [29] cho thấy PAMAM dendrimer PPI dendrimer làm tăng khả hòa tan nước thuốc 7-bromo-2-hydroxy-phenazine N5, N10-dioxide

1.1.5.3 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc qua da

Gần khảo sát việc vận chuyển thuốc qua da dendrimer tiến hành hai yếu tố: (i) diện phần kỵ nước hầu hết thuốc dẫn đến khả tan nước gây hạn chế xâm nhập thuốc vào khoang sinh học, (ii) khả hòa tan nước khả tương thích sinh học hầu hết dendrimer [12], [20]

Chauhan cộng [30] khảo sát việc vận chuyển thuốc Indomethacin qua da dendrimer PAMAM G4.0 với nhóm bề mặt amino hydroxyl PAMAM dendrimer G4.5 Các nghiên cứu dược động học động lực học in vivo với chuột Wistar, cho thấy gia tăng đáng kể nồng độ Indomethacin máu hệ chất mang so với việc dùng riêng lẻ Indomethacin Cheng cộng phát triển hệ chất mang PAMAM dendrimer G5.0 liên hợp Ketoprofen Diflunalu Trong nghiên cứu in vitro tính thấm qua da chuột cho thấy phức chất dendrimer-Ketoprofen dendrimer-Diflunisal có độ thấm qua da cao gấp 3,4 3,2 lần so với Ketoprofen Diflunisal phân tán nước muối [31] 1.1.5.4 Dendrimer dùng vận chuyển thuốc uống

21

hạn chế việc sử dụng qua đường uống Dendrimer khảo sát để vận chuyển loại thuốc uống khác với kết đầy hứa hẹn Các chất dendrimer biến tính bề mặt tìm thấy làm tăng tính thấm qua biểu mơ Nghiên cứu Jevprasesphant cộng cho thấy PAMAM dendrimer dendrimer biến tính bề mặt với nhóm lauroyl qua đơn lớp biểu mơ thơng qua đường cạnh tế bào (paracellular) xuyên qua tế bào (transcellular) [32]

Các dendrimer gắn folate (FA) bề mặt dễ dàng vận chuyển hoạt chất chống ung thư tới vị trí khối u Nghiên cứu Kukowska-Latallo cộng cho thấy PAMAM dendrimer – Folic acid mang thuốc chống ung thư Methotrexate (MTX) có tích tụ MTX cao gấp ba lần tế bào khối u sau 24 so với hệ chất mang không gắn acid folic [33] Jain đồng nghiệp tổng hợp thành công dendrimer PPI liên hợp phối tử mannosyl acid sialic nhằm mục đích mang thuốc kháng HIV Ziovudine hướng đích tăng khả tương hợp sinh học [34]

1.1.5.6 Dendrimer vận chuyển gen

Các nhà khoa học sử dụng dendrimer làm tác nhân vận chuyển gen Szoka Baker cho PAMAM dendrimer tạo phức với plasmid DNA có khả vận chuyển tế bào CV-1, HeLa, HepG2, Rat Hepatocyte, K562, EL-4 Jukart

22

Dendrimer với nhóm amine bề mặt vận chuyển DNA tới màng tế bào hỗ trợ trình chuyển dịch cách phá vỡ màng tế bào Quá trình vận chuyển gen đến nhân giải mã phức dendrimer-DNA mơ tả hình 1.19 [20]

Trong năm gần đây, nhiều nhóm nghiên cứu giới bắt đầu nghiên cứu tổng hợp dạng phức dendrimer-DNA dendrimer-RNA ứng dụng chúng sống Nhìn chung lĩnh vực chữa bệnh liệu pháp gen sở dendrimer lĩnh vực với nhiều triển vọng cao [3], [6], [12] 1.1.5.7 Dendrimer vận chuyển vaccine

Dendrimer với phân tử linh động dễ sử dụng hoàn toàn phù hợp với việc kết hợp với kháng nguyên có trọng lượng phân tử nhỏ để tạo vaccine nhân tạo có tính bền vững, mạnh mẽ (robust) ứng dụng điều kiện mơi trường khác có giá thành rẻ so với vaccine truyền thống có nguồn gốc từ thiên nhiên

Với nhóm chức hoạt động bề mặt, dendrimer gắn kết với kháng nguyên có nhiều kiểu dáng khác gắn kết với tá dược để thực chức vacxin miễn dịch [6], [12]

1.2 Thuốc chống ung thư chứa Platin 1.2.1 Cisplatin

1.2.1.1 Tính chất Cisplatin

Cisplatin, gọi cis-diamminedichloroplatinum (II), phức chất có cấu trúc tứ diện với ion trung tâm Pt Ở nhiệt độ phòng, Cisplatin tồn dạng tinh thể màu vàng vàng đậm đến vàng da cam Cisplatin tan nước hịa tan dimethylprimanide N, N-dimethylformamide Cisplatin ổn định

23

nhiệt độ áp suất bình thường, biến đổi chậm theo thời gian tạo thành đồng phân dạng trans Cisplatin có trọng lượng phân tử 301,1 g/mol, tỷ trọng 3,74 g/cm3, điểm nóng chảy 270 °C, với hệ số phân tán octanol/nước logK

ow =

- 2,19 độ tan nước 2,53 g/l 25 ° C (HSDB 2009)

Cisplatin M Peyrone tổng hợp lần vào năm 1844 cấu trúc hóa học Alfred Werner chứng minh vào năm 1893 Tuy nhiên, năm 1960 giới khoa học bắt đầu quan tâm đến việc sử dụng hợp chất việc điều trị ung thư sau kết nghiên cứu ban đầu Rosenberg cộng (1965), Đại học Michigan State cho thấy muối Pt kim loại quý khác có khả ức chế phân chia tế bào Escherichia coli Phát tiền đề cho công bố sau việc sử dụng phức chất platinum, palladium kim loại quý khác điều trị ung thư [35]

Cisplatin ý đặc biệt cho thấy hoạt tính chống ung thư nhiều khối u bao gồm ung thư buồng trứng, tinh hoàn khối u rắn đầu cổ Các đặc tính gây độc tế bào Cisplatin biết đến vào năm 1960 đến cuối năm 1970 xem thành phần quan trọng việc điều trị hệ thống tế bào mầm ung thư Trong số nhiều loại thuốc hóa trị sử dụng rộng rãi cho ung thư, Cisplatin hợp chất hấp dẫn Đây hợp chất Pt (II) FDA chấp thuận điều trị ung thư vào năm 1978 Điều thu hút quan tâm nhà khoa học đến hợp chất Pt (II) kim loại khác thuốc chống ung thư tiềm [36], [37]

24

1.2.1.2 Cơ chế tác động Cisplatin tế bào

Kể từ đưa vào thử nghiệm lâm sàng, Cisplatin (cisdiammine-dichloro-platinum (II)) có tác động lớn điều trị ung thư, thay đổi trình

Tăng độ an toàn Mở rộng khả

chống khối u

Cải thiện hoạt tính, chống kháng thuốc Thuốc uống

Cải thiện mang thuốc

25

điều trị số khối u, ung thư buồng trứng, tinh hoàn, đầu cổ Gần 30 năm sau lợi ích lâm sàng lần cơng nhận, nghiên cứu tiếp tục nhằm tìm hiểu cách xác chế tác động Cisplatin tế bào ung thư Bên cạnh khả diệt tế bào ung thư, nhiều nhà khoa học chứng minh Cisplatin tác động đến DNA, cụ thể ức chế tổng hợp DNA, ức chế chép RNA, tác động lên chu trình tế bào trình chết tế bào apoptosis Nghiên cứu chế tác động Cisplatin cải thiện phương pháp trị liệu để tăng cường hoạt tính chống ung thư thuốc, đồng thời giúp làm sáng tỏ chế kháng thuốc Cisplatin điều trị lâm sàng

Khoang ngoại bào huyết có nồng độ cao ion Clorua (90-100mM) so với khoang nội bào (4-10mM) Nồng độ Clorua cao huyết làm ổn định Cisplatin, sau xâm nhập vào nội bào Cisplatin bị hydrat hóa, nguyên tử Clorua Cisplatin bị thay phân tử nước làm Cisplatin hai nhóm Clorua Sản phẩm thủy phân chất có lực điện

26

tử mạnh phản ứng với nucleophile nào, bao gồm nhóm sulfurhydryl protein nguyên tử nitơ acid nucleic (hình 1.22) [37] Cisplatin liên kết với Guanine (một loại nucle base diện DNA RNA) thuộc nhóm base Purine (có vịng Pyrimidine Imidazol cạnh) gây tổn thương DNA tế bào ung thư, ngăn chặn phân chia tế bào thời kỳ nguyên phân dẫn đến gây chết tế bào Liên kết chéo 1,2-intrastrand

d(GpG), 1,2-intrastrand d(ApG), 1,3-intrastrand d (GpXpG)… Purine với Cisplatin nguyên nhân gây độc tính Cisplatin (hình 1.23)

27

ROS gây oxy hóa thành phần tế bào dẫn đến hậu làm chết tế bào hoại tử hay tế bào tự chết theo chương trình

Các tế bào ung thư chứa ROS cao nhiều so với tế bào bình thường, phần kích thích phát triển khối u, tăng hoạt động trao đổi chất rối loạn ty thể Mất cân oxy hóa chế quan trọng liên quan đến độc tính Cisplatin Ty thể mục tiêu cho Cisplatin gây cân oxy hóa, dẫn đến nhóm sulfhydryl protein ty thể, ức chế hấp thu canxi giảm khả màng ty thể

Trong môi trường nội bào nồng độ ion clorua thấp, Cisplatin bị thủy phân thành dạng monoaqua [cis-(NH2)2PtCl(H2O)] diaqua [cis-(NH2)2Pt(H2O)2] Các

dạng Cisplatin thủy phân có hoạt tính gấp 1000 lần so với Cisplatin tác động lên ty thể Dẫn đến lượng canxi thoát từ ty thể gia tăng tạm thời nồng độ canxi tế bào nhân tố quan trọng làm phá vỡ cân canxi nội môi ảnh hưởng đến chức tế bào Cisplatin gây tổn thương ty thể, ức chế chức ty thể, làm suy giảm Adenosine triphosphate (ATP) yếu tố khác Điều dẫn đến chết tế bào theo chương trình (apoptosis) hoại tử mơ

1.2.1.3 Cơ chế kháng thuốc Cisplatin

Có nhiều chế khác liên quan đến kháng Cisplatin Đầu tiên giảm tích tụ Cisplatin nội bào Cisplatin hấp thu qua cổng CTR1 (CTR1 tạo từ gen, gen bị đột biến tăng lực với kim loại đồng, mà đồng lại chất cạnh tranh với Cisplatin nên thuốc Cisplatin bị giảm hấp thu vào tế bào ung thư [37], [38] Giảm tích tụ thuốc chế quan trọng dẫn đến kháng thuốc giảm tích tụ thuốc từ 20% đến 70% gây tình trạng kháng Cisplatin tăng tương ứng từ đến 40 lần Giảm tích tụ Cisplatin nội bào nguyên nhân nguyên nhân gây kháng thuốc Cisplatin [39]

28

khối u Sửa chữa theo hình thức cắt bỏ (NER) coi đường để loại bỏ phức chất DNA-Cisplatin sửa chữa DNA Khi xảy trình NER, tế bào trở nên nhạy cảm với Cisplatin làm tăng khả kháng thuốc Cisplatin

Cơ chế kháng thuốc thứ ba Cisplatin liên quan đến bất hoạt Cisplatin khoang nội bào Sự bất hoạt Cisplatin ảnh hưởng đến hiệu phản ứng với DNA Cisplatin làm tăng khả sống sót tế bào ung thư Glutathione (GSH) tác nhân bất hoạt Cisplatin, Glutathione tạo phức với Cisplatin phức chất bị trục xuất khỏi tế bào qua cổng MRP Kết nghiên cứu dòng tế bào ung thư buồng trứng cho thấy bất hoạt Cisplatin tăng tăng nồng độ GSH Ngoài GSH, protein metallicothionein tác nhân gây bất hoạt thuốc Cisplatin [39]

Sự xuất ATP7A ATP7B làm gia tăng trục xuất thuốc Cisplatin khỏi tế bào ung thư Bơm GS-X giúp trục xuất thuốc chứa platin khỏi tế bào ung thư Bơm protein tên MRP, protein tổng hợp từ gen MRP2 tương ứng [37] Biết tình trạng gen MRP2 tiên đốn khả đáp ứng với thuốc chứa platin

Cho đến thời điểm công bố chế kháng Cisplatin xem chưa hoàn thiện giúp giới khoa học hiểu biết định lý thất bại điều trị Cisplatin định hướng hướng nghiên cứu để cải thiện hiệu điều trị Cisplatin

1.2.1.4 Độc tính Cisplatin

Như đề cập Cisplatin liên kết với Guanine gây độc tế bào ung thư Tuy nhiên, nguyên nhân Cisplatin gây độc với tế bào lành Điều trị Cisplatin gây tác dụng phụ như: buồn nôn, nhiễm độc thận, nhiễm độc tim, nhiễm độc gan nhiễm độc thần kinh Nhiều nghiên cứu khác cho thấy Cisplatin gây rối loạn nhịp tim, suy tim sung huyết, thay đổi điện tim viêm tim

29

dụng trước điều trị Cisplatin có tác dụng giảm buồn nơn nôn chu kỳ điều trị Việc sử dụng hiệu thuốc chống nôn làm giảm độc tính gây Cisplatin [41]

Các nghiên cứu độc tính Cisplatin cho thấy mức độ gây độc cao thận Thận đóng vai trị quan trọng đường để tiết Cisplatin Thận có xu hướng tích lũy Cisplatin mức cao so với quan khác thể bao gồm gan Hydrat hóa Cispaltin với dung dịch nước muối 0,9% trước sau truyền Cisplatin làm giảm đáng kể độc tính thận Cisplatin [42]

Độc tính thần kinh độc tính nghiêm trọng gây Cisplatin Bệnh lý thần kinh nguyên nhân việc hạn chế liều dùng Cisplatin bệnh nhân ung thư Bộ phận bị ảnh hưởng hệ thống nơ-ron dây thần kinh cảm giác ngoại biên với biểu bệnh lý thần kinh chủ động, thính giác, co giật, dấu hiệu Lhermitte dùng Cisplatin liều cao [43] 1.2.2 Sử dụng Cisplatin để điều trị ung thư

- Cisplatin điều trị ung thư phổi [44]

Ung thư phổi loại ung thư ác tính phổ biến Ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLCs) chiếm 15% tổng số bệnh ung thư Cisplatin carboplatin hai số loại điều trị dựa bạch kim phổ biến sử dụng hóa trị liệu ung thư phổi tế bào nhỏ Trong thử nghiệm lâm sàng, Cisplatin thường chọn hoạt tính chống ung thư mạnh, gây tác dụng phụ bao gồm độc tính thận, buồn nơn nơn

- Cisplatin điều trị ung thư buồng trứng [45]

30

buồng trứng với lý khơng rõ ràng, phần cịn lại di truyền, có liên quan đến ung thư vú đại tràng Các dẫn xuất Cisplatin sử dụng phương pháp điều trị ung thư buồng trứng, tác dụng phụ nghiêm trọng có kháng thuốc Ung thư buồng trứng có tỷ lệ đáp ứng tổng thể tốt điều trị Cisplatin, giai đoạn sớm giai đoạn bệnh tiến triển, đáp ứng khơng trì cuối khối u kháng thuốc Cisplatin [46] Cisplatin sử dụng kết hợp với tác nhân hóa học khác hợp chất để điều trị ung thư buồng trứng dòng tế bào kháng nhạy cảm thuốc Nghiên cứu Koch cộng cho thấy liposome-Cisplatin làm giảm khả kháng thuốc tế bào ung thư buồng trứng [47]

- Cisplatin điều trị ung thư biểu mô

Ung thư biểu mô tế bào vảy (HNSCC) đầu cổ bệnh ác tính phổ biến với 600.000 trường hợp phát toàn giới năm Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị bao gồm phẫu thuật, xạ trị hóa trị HNSCC có tỷ lệ tử vong cao Trong thập kỷ qua, tỷ lệ sống năm ln trì khoảng 50% Cisplatin loại thuốc hiệu điều trị ung thư biểu mô tế bào vảy Cisplatin kết hợp với Methotrexate, Vinblastine, Doxorubicin Gemcitabine để điều trị cho bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tiền liệt di [48], [49]

- Cisplatin điều trị ung thư vú

Ung thư vú nguyên nhân hàng đầu gây tử vong phụ nữ tồn giới Hóa trị lựa chọn để điều trị ung thư vú ác tính kéo dài tuổi thọ bệnh nhân Cisplatin tác nhân hóa trị liệu quan trọng sử dụng rộng rãi điều trị loạt khối u ác tính, bao gồm vú, tinh hoàn, buồng trứng, cổ tử cung, tuyến tiền liệt, đầu cổ, bàng quang, phổi ung thư hạch không Hodgkin [50], [51]

- Cisplatin điều trị ung thư não

31

các bệnh ung thư khác ung thư đại tràng ung thư phổi thường gây tử vong [52] Các bệnh nhân GBM điều trị phẫu thuật kết hợp xạ trị với thuốc Temozolomide Liệu pháp điều trị Cisplatin sử dụng cho khối u não trẻ tái phát [53]

1.2.3 Các thuốc chống ung thư khác có chứa Platin

Sau công bố thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng Cisplatin, hàng nghìn hợp chất tương tự Platin tổng hợp thử nghiệm đặc tính làm tăng số điều trị chúng Khoảng 13 số chất đánh giá thử nghiệm lâm sàng, có Carboplatin cho thấy ưu rõ ràng Cisplatin đạt chấp thuận tồn giới Chín chất tương đồng chứa platin thử nghiệm lâm sàng toàn giới Tetraplatin, Oxaliplatin, DWA2114R, Enloplatin, Lobaplatin, CI-973 (NK-121), 254-S, JM-216, Cis-bis-neodecanoato -trans-R, R-1,2-diaminocyclohexan platinum (II) (LNDDP)] (Weiss Christian, 1993) Cấu trúc hóa học Cisplatin bốn chất tương tự bao gồm Carboplatin, Oxaliplatin, Ormaplatin Enloplatin [54]

Hình 1.24 A-Cisplatin; B-Carboplatin; C-Oxaliplatin; D-Ormaplatin; E-Enloplatin

A B

C D

E

2

32

Carboplatin (Cis diammine (1,1-cyclobutanecarboxylato) platinum (II)) loại thuốc hóa trị liệu sử dụng cho ung thư buồng trứng, phổi, đầu cổ Về cấu trúc khác với Cisplatin, Carboplatin có chứa ligand đầu nối dicarboxylate vị trí hai ligand clorua (nhóm dễ tách rời Cisplatin (hình 2) Hoạt tính thấp khả ghép nối với DNA chậm so với Cisplatin Khơng giống Cisplatin, Carboplatin dễ bị chế thay Một số nghiên cứu cho thấy Cisplatin Carboplatin gây thay đổi hình thái khác dịng tế bào MCF-7 gây độc tế bào [55] Tốc độ tiết Carboplatin thấp so với Cisplatin có nghĩa có nhiều thuốc giữ lại thể hiệu thuốc lâu (thời gian bán hủy trì 30 Carboplatin, so với 1,5-3,6 Cisplatin)

So với Cisplatin, ưu điểm lớn Carboplatin gây tác dụng phụ hơn, đặc biệt tác dụng gây độc thận [56], [57] Hạn chế Carboplatin tác dụng ức chế tủy xương làm cho tế bào máu sản lượng tiểu cầu tủy xương thể giảm đáng kể, thấp tới 10% so với mức thông thường [57]

Oxaliplatin (1R, 2R-diaminocyclohexane oxalatoplatinum [II]) thể hoạt tính chống ung thư cải thiện khác biệt so với Cisplatin Quá trình xâm nhập Oxaliplatin vào tế phụ thuộc vào gen vận chuyển đồng CTR1 Cisplatin protein MMR không phát thuốc khơng tạo thành phức chất platin-DNA tác nhân gây trình đẩy thuốc khỏi tế bào [37] Ngồi ra, Oxaliplatin thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào tế bào L1210 HT29 (có khả kháng Cisplatin) điều cho thấy chế hoạt động khác biệt Oxaliplatin Oxaliplatin chất hóa trị liệu tiêu chuẩn dùng kết hợp với Fluoropyrimidine để điều trị ung thư đại trực tràng 1.2.4 Điều trị kết hợp Cisplatin với thuốc ung thư khác

33

thư phổi (ung thư biểu mô màng phổi), ung thư dày, ung thư tuyến nước bọt, vú, đại tràng, phổi, tuyến tiền liệt, u ác tính dịng tế bào ung thư tuyến tụy, ung thư biểu mô tế bào vảy đường sinh dục nam, ung thư bàng quang tiết niệu ung thư cổ tử cung Bảng 1.2 trình bày tóm tắt liệu pháp phối hợp Cisplatin với loại thuốc ung thư khác cho điều trị loại bệnh ung thư [35]

Bảng 1.2 Điều trị phối hợp Cisplatin loại thuốc ung thư khác [35] Các loại thuốc kết hợp Loại ung thư

5-FU Ung thư dày ung thư tuyến

tiền liệt thực quản

UFT Ung thư biểu mô phổi tế bào không

nhỏ

Paclitaxel Ung thư biểu mô buồng trứng, ung

thư vú, ung thư biểu mơ phổi, u ác tính, ung thư biểu mơ đầu cổ

Doxorubicin Ung thư u trung biểu mô màng

phổi ác tính

Cyclophosphamide doxorubicin Ung thư biểu mô tuyến nước bọt

Gemcitabine Ung thư đường mật

Anvirzel Ung thư buồng trứng, ung thư vú,

đại tràng, phổi, tuyến tiền liệt, u ác tính ung thư tuyến tụy

Bevacizumab Ung thư phổi tế bào không nhỏ

Vinbalstine bleomycin Các khối u tế bào u hạt di buồng trứng

Methotrexate bleomycin Ung thư biểu mô tế bào vảy cao cấp đường sinh dục nam

Everolimus Ung thư bàng quang tiết niệu

Fluorouracil, doxorubicin cyclophosphamide

Ung thư biểu mô tuyến nước bọt

34

Các hệ chất mang thuốc chống ung thư nhận nhiều quan tâm năm gần khả cải thiện hiệu thuốc, giảm tác dụng phụ không mong muốn giảm khả kháng thuốc Nguyên tắc hệ chất mang dựa khác biệt mơ bình thường khối u để tăng tính chọn lọc thuốc mục tiêu dự định Cụ thể, hiệu ứng thẩm thấu lưu giữ tăng cường (hiệu ứng EPR) làm gia tăng khả thẩm thấu hợp chất cao phân tử tới khối u lưu giữ chúng Trong hầu hết loại thuốc chống ung thư sử dụng lâm sàng có trọng lượng phân tử thấp nhanh chóng qua màng tế bào thường tế bào ung thư, loại thuốc kết hợp với liposome, hạt lipid, mixen, polymer, ống nano carbon, dendrimer tích lũy cách có chọn lọc khối u (hình 1.25) [58], [59]

Hình 1.25 Các hệ chất mang khác phát triển tiền lâm sàng lâm sàng

35

một số trường hợp tăng cường việc mang thuốc cách gắn tác nhân hướng đích chủ động [60]

1.2.5.1 Liposome mang thuốc Cisplatin

Kể từ khám phá Bangham cộng [61], liposome trở thành chất mang thuốc lựa chọn với nhiều ứng dụng thực tế Một số công thức thuốc-liposome chấp thuận, số khác đánh giá lâm sàng [62] Ưu điểm hệ chất mang khả làm việc với thuốc kỵ nước ưa nước; loại thuốc kỵ nước bao bọc lớp kép phospholipid, loại thuốc ưa nước bọc khoang trống [63] Hệ chất mang liposome-PEG biến tính nhóm bề mặt mang nhiều loại thuốc khác nhau, có thời gian bán hủy cao Cispaltin tự Điều dẫn đến nồng độ Cisplatin khối u sau 48 sau dùng thuốc cao so với Cisplatin tự Độc tính thuốc giảm đáng kể so với Cispaltin tự [64] Liposome – Cispaltin (lipoplatin) điều chế thử nghiệm in vitro lâm sàng giai đoạn I, II III Các kết thử nghiệm chuột cho thấy lipoplatin độc Cisplatin làm giảm kích thước khối u [65] Catanzaro cộng sử dụng kết hợp Cisplatin liposome 6-amino nicotinamide để làm giảm kháng thuốc Cisplatin tế bào ung thư buồng trứng, tăng cường dược động học thuốc mở hướng điều trị ung thư buồng trứng [66]

Bảng 1.3 Các hệ chất mang liposome – platin [60] Công thức Thuốc kết

hợp

Chất mang Kích thước Giai đoạn lâm sàng

Chỉ định

36 Aroplatin

(L-NDDP)

NDDP Liposome μm Pha II Ung thư đại trực tràng di căn, U trung mô màng phổi

Lipoxal Oxaliplatin Liposome 250 nm Pha I Ung thư đường tiêu hóa di MBP-426 Oxaliplatin Liposome 100 nm Pha II Dạ dày, trào

ngược dày thực quản, ung thư thực quản

Lipoplatin (hãng Regulon, Inc.) hệ chất mang liposome – Cisplatin có triển vọng thử nghiệm lâm sàng Lipoplatin chứa khoảng 9% Cisplatin 91% lipid (% khối lượng) tương ứng với tỷ lệ thuốc-lipid 1:10 [67] Kích thước hạt khoảng 110 nm Một số hệ mang thuốc liposome – platin khác nêu bảng 1.3

1.2.5.2 Viên nang nano chứa phức Cisplatin phủ lipid

Năm 2002, Burger cộng công bố phương pháp điều chế viên nang nano chứa phức platin với hiệu nang hóa cao [68] Những viên nang nano gần giống với công thức liposome mơ tả có khả nạp thuốc cao nhiều Phân tích thành phần viên nang nano cho thấy phần lõi bao gồm 80% Cisplatin bao phủ lớp kép lipid Tỷ lệ thuốc - lipid trung bình viên nang nano cao 10:1[69] Guo cộng tổng hợp hạt nano Cisplatin phủ lipid có khả mang thuốc cao (~80,8 %kl) Kết thử nghiệm in vitro in vivo cho thấy, dùng chuột với liều thấp hàng tuần, hệ chất mang Cisplatin ức chế hiệu phát triển khối u ác tính Cisplatin tự liều lượng điều [70]

37

nghệ cho thấy nhiều hứa hẹn khả cải thiện đáng kể việc mang thuốc nang hóa loại thuốc chứa platin khác Carboplatin Những cải tiến việc giải phóng thuốc thơng qua nội bào, khả hướng đích chủ động tối ưu hóa ổn định huyết tương, viên nang nano đưa vào thử nghiệm lâm sàng [72]

1.2.5.3 Các polymer mang thuốc chứa platin

Khái niệm polymer liên hợp thuốc platin đề xuất Ringsdorf [73], dựa gắn kết cộng hóa trị thuốc với polymer ưa nước Được tiếp tục phát triển Duncan, Kopeček người khác [74], [75], kết gần chục loại polymer liên hợp thuốc tiến hành thử nghiệm lâm sàng Hệ liên hợp polymer – thuốc bao gồm polymer tương hợp sinh học với nhóm chức liên kết kiểu liên kết hóa học khác tạo liên kết với thuốc, mang nhả thuốc theo hướng mục tiêu Các polymer có chứa nhóm chức amine, carboxylate, hydroxyl liên kết với phức platin [76]

N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA) polymer sử dụng phổ biến để liên hợp hợp chất chống ung thư (Hình 1.26) Điển hình hệ liên hợp thuốc AP5280 chứa Cisplatin (liên kết thơng qua nhóm chức đầu cuối malonate polymer) [77] Hệ mang 10% (theo khối lượng) thuốc Cisplatin với độ gây độc tế bào nhỏ 20 lần so với Cisplatin thử nghiệm in vivo cho thấy gia tăng 19 lần tích lượng platin khối u chuột B16 AP5280 (Access Pharmaceuticals, Inc.) đưa vào thử nghiệm lâm sàng Trong nghiên cứu pha I/II, AP5280 cho kết thử nghiệm khả quan khả giảm độc tính platin [78] Bên cạnh đó, AP5346 hệ liên hợp polymer hệ thứ ba phát triển AP5346 gọi ProLindac (Access Pharmaceuticals, Inc.) liên hợp HPMA-platinum phát triển lâm sàng ProLindac cho thấy hiệu tương tự Oxaliplatin thử nghiệm dòng tế bào ung thư vú, buồng trứng, phổi tuyến tiền liệt [79]

38

đối với tế bào bình thường, tăng trì lượng platin huyết tương lên đến 14 lần mức vận chuyển thuốc chứa platin tới khối u [80]

Stoyanova tổng hợp copolymer gồm khối Polyacrylic acid-Propylene oxide- Polyacrylic acid chứa 20% khối lượng Cisplatin Hệ copolymer cho thấy khả mang giải phóng thuốc Cispaltin cao có độc tính thấp Cisplatin tự [81] Copolymer poly acrylic acid-poly methyl methacrylate với nhóm carboxylate hệ chất mang tiềm dùng để mang thuốc Cisplatin [82]

1.2.5.4 Ống nano carbon mang thuốc Cisplatin

Ống nano carbon bao gồm ống nano carbon đơn thành (SWCNTs) ống nano carbon đa thành (MWCNTs) ống nano peptide tuần hoàn ống nano tổng hợp kiểu mẫu Ống nano có số ưu điểm việc vận chuyển thuốc so với hạt nano hình cầu Với nhóm đầu cuối thay đổi thể tích bên lớn, ống nano carbon liên hợp loại thuốc có khả mang thuốc cao Ngoài ra, bề mặt bên bên ngồi ống nano biến tính với nhóm chức hóa học sinh hóa ghép với phối tử hướng đích ghép nối với PEG để tăng khả tương thích sinh học ống

39

nano [83] Độ gây độc tế bào SWCNTs tương đối thấp tích lũy lâu dài thể [84]

Ajima cộng chứng minh khả mang nhả thuốc Cisplatin SWCNTs Cisplatin giải phóng từ hệ SWCNTs - platin tiêu diệt tế bào ung thư phổi người thân SWCNTs không gây độc tế bào [85] Các SWCNTs biến tính hóa học với cấu trúc lỗ có khả mang nhả Cisplatin cao loại chưa biến tính [86] Các thử nghiệm in vitro hệ cho thấy hoạt tính chống ung thư Cisplatin hệ SWCNTs - platin tăng loại thuốc thể ức chế đáng kể khối u trong thử nghiệm in vivo

[87] Guven tổng hợp thành công ống nano carbon đơn thành siêu ngắn mang Cisplatin Các ống nano carbon mang Cisplatin thể hiệu cao Cisplatin tự việc ngăn chặn phát triển khối u dòng tế bào MCF-7 MDAMB-231 [88]

1.2.5.5 Polymer mixen mang thuốc platin

Các polymer mixen (hình 1.27) tập hợp khối copolymer với cấu trúc lõi-vỏ [60], [89] Chúng “bắt giữ” loại thuốc, nói chung lõi mixen làm tăng rõ rệt độ hòa tan thuốc so với độ hịa tan thực nước Do trình tạo mang thuốc mixen dễ thực hiện, với khả thay đổi thành phần hóa học, tổng khối lượng phân tử độ dài khối

Khối polyion

Khối kỵ nước

40

block copolymer, cho phép kiểm sốt xác kích thước hình thái mixen, nên hệ chất mang ứng dụng nhiều việc mang thuốc [90] Nhiều nghiên cứu cho thấy hệ chất mang có nhiều ưu điểm rõ rệt bao gồm tăng khả tương hợp sinh học giảm tác dụng phụ thuốc

Các mixen block copolymer chia thành hai nhóm chủ yếu Nhóm mixen khối copolymer lưỡng tính có phần lõi hình thành tương tác kỵ nước phần không tan nước vỏ hình thành phần tan nước khối copolymer [91] Ở nồng độ cao nồng độ mixen tới hạn (CMC), khối copolymer tự lắp ghép dẫn tới hình thành mixen Nhóm thứ hai mixen chứa khối ionomer (BICs) polyion (PIC) Nhóm có lõi hình thành tương tác tĩnh điện khối polyion khối copolymer với chất mang điện trái dấu, chất hoạt động bề mặt ion kim loại [92]–[94]

Các mixen khối copolymer vừa có nhóm ưa nước kỵ nước thích hợp để hịa tan thuốc kỵ nước [92], [95], [96] Một số mixen loại thể khả mang thuốc cao (xấp xỉ 50%) [97], [98] Nhìn chung, phân bố mặt khơng gian thuốc hịa tan bên mixen phụ thuộc vào độ phân cực thuốc Thuốc kỵ nước phân bố vào lõi mixen thuốc có độ phân cực trung bình cao chiếm giữ vị trí bề mặt [92] Sự phân phối thuốc phụ thuộc vào độ mạnh liên kết mixen thuốc điều ảnh hưởng đến khả giải phóng thuốc mixen thuốc nằm bên ngồi dễ giải phóng thuốc bên lõi mixen [92] Thuốc ưa nước hấp phụ vịng ngồi mixen, nhiên tương tác yếu Cisplatin thuốc khác chứa platin có khả hịa tan nước bị nang hóa vào bên lõi mixen làm giảm khả giải phóng thuốc Hạn chế khắc phục cách sử dụng khối ionomer có khả tạo liên kết phức chất kim loại polymer Các copolymer có khối ion polycarboxylate thường sử dụng với mục đích tạo liên kết phức chất với platin nhóm carboxylate có khả thay ligand anion halogen (X2) phức platin để tạo

41

và tạo phức hai đầu nối với copolymer Điều dẫn đến trường hợp thuốc platin tạo liên kết chéo với hai nhóm carboxylic hai khối ionomer riêng biệt [99] Các nhóm carboxylic có tính nhân thấp cho phép nhả platin hoạt hóa mơi trường nước muối sinh lý Sự nhả thuốc phức platin phụ thuộc vào yếu tố nồng độ, pH độ bền mixen [100], [101]

Các hệ copolymer poly amino acid poly aspartic acid (Pasp) poly glutamic acid (Pglu), sử dụng rộng rãi để mang thuốc platin [102] Kataoka nghiên cứu tạo phức Cisplatin với copolymer PEG-PAsp tạo hệ mixen polymer bền vững với hiệu mang thuốc cao Trong môi trường nước muối sinh lý mixen ổn định khoảng 10 giờ, sau tự phân rã [99], [103], [104]

Các nghiên cứu khác cho thấy mixen PGlu cải thiện tính ổn định nhả thuốc so với mixen PAsp Phức chất Cisplatin – mixen PGlu có độc tính thấp Cisplatin [105] Công thức thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III, châu Á với tên gọi NC-6004 (Nanoplatin; NanoCarrier Co., Ltd; Nhật Bản) Các nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I, II chứng minh NC-6004 có khả dung nạp tốt đáng kể so với Cisplatin tự gây độc không đáng kể cho thận, gây tác dụng phụ khác [106]

Các mixen Oxaliplatin (DACHPt) có độ kháng thuốc nhỏ Oxaliplatin nhờ vào việc nhả thuốc chọn lọc vùng nhân tế bào, làm tăng chuyển thuốc Pt đến DNA phá vỡ chế kháng thuốc bào tương [107]

1.2.5.6 Hệ chất mang dendrimer - platin

42

carbohydrate DNA [109] Dendrimer phổ biến polyamidoamine (PAMAM), có sẵn thị trường với loạt hệ nhóm chức bề mặt khác [110] Các PAMAM dendrimer hệ chẵn có nhóm chức bề mặt nhóm amin PAMAM dendrimer hệ lẻ có nhóm chức bề mặt nhóm carboxylate [6], [111] Nghiên cứu liên hợp PAMAM dendrimer với platin công bố Duncan cộng [112] Cisplatin liên kết với dendrimer G3.5 carboxylate hóa nhóm chức bề mặt Hệ chất mang thể nhiều ưu điểm độ hòa tan thuốc tăng, khả mang thuốc cao (20-25% khối lượng), độc tính giảm, tích tụ chọn lọc khối u rắn có hoạt tính chống ung thư

Nghiên cứu Kirkpatrick cộng cho thấy, lượng Cisplatin bị giữ lại dendrimer sau ủ kéo dài (60°C, tuần), điều giải thích có hình thành liên kết phụ nhóm amine amide bên dendrimer với Cisplatin Ngoài ra, khả mang thuốc nhả thuốc Cisplatin phụ thuộc vào hệ dendrimer [113] Trong nghiên cứu khác PAMAM dendrimer (nhóm amine bề mặt) liên hợp với kali tetrachloroplatinate cho thấy phần đáng kể phức platin liên kết với nhóm amin bậc bậc có lõi dendrimer làm chậm q trình giải phóng thuốc [114], [115] Howell cộng tổng hợp thành công hệ mang thuốc PAMAM dendrimer (G4.5) mang tối đa 40 phân tử DACHPt bề mặt [116] Gordon cộng sử dụng dendrimer carboxylate để mang thuốc Cisplatin đạt tỉ lệ mang thuốc 25 % (% khối lượng) [113] Kulhari tối ưu hóa qui trình mang thuốc Cisplatin PAMAM dendrimer G3.5 đạt tỉ lệ mang thuốc 27% [117]

Kesavan tổng hợp thành công hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0 biến tính với acid diGlycolamic gắn tác nhân hướng đích Herceptin Thử nghiệm in vitro trên dịng tế bào ung thư buồng trứng HER-2+ve HER-2-ve cho thấy hạt nano có giá trị IC50 thấp tăng cường khả gây chết

43

G4.0-PGLA (poly-D,L-lactide-co-glycolide) cho thấy khả mang đồng thời siRNA (2%) Cisplatin (1.8%) hướng đích tế bào ung thư làm tăng q trình chết tế bào apotosis tăng khả sống sót chuột bạch đem thử nghiệm [119]

Ở Việt Nam, năm 2007, nhóm nghiên cứu GS TS Nguyễn Cửu Khoa, Viện KHVL UD - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam xem đơn vị nghiên cứu tổng hợp dendrimer [6]

Một số hệ chất mang PAMAM dendrimer -Pt nhóm nghiên cứu tổng hợp Bao gồm:

Hệ chất mang PAMAM G 2.0, G 3.0 K2PtCl4 thực theo sơ đồ

sau: 2 2 Hình 1.28 Sơ đồ tổng hợp phức PAMAM dendrimer hệ chẵn – Pt2+

Hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ lẻ G 2.5 G3.5 với muối Cisplatincũng tổng hợp theo sơ đồ sau:

Hình 1.29 Sơ đồ phản ứng tổng hợp phức PAMAM G 3.5-Cisplatin

Bên cạnh nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng biến tính hệ chất mang PAMAM dendrimer tác nhân alkyl hóa,

PAMAM G 3.5 N O O -O -O NH O N O O -O -O N H O N

O O

-O -O NH O PAMAM G 3.5 N O O O O NH O N O O O O N H O N

O O

-O -O NH O Pt NH2 NH2 Pt NH2 NH2 NH2 H2N

Pt NH2

NH2

44

Pluronic, Polyethylene glycol tác nhân hướng đích (acid folic) mang thuốc chống ung thư 5-FU với mục tiên làm tăng tính tương hợp sinh học phân phối thuốc đến vị trí tế bào ung thư [18], [120]

Như vậy, dendrimer với tính chất đơn phân tán, có kích thước nano cấu trúc khơng gian rỗng bên phân tử nơi chứa thuốc lý tưởng nhóm chức bề mặt kết nối với thuốc nhóm chức khác nhóm hướng đích, nhóm quang hoạt giúp nhà khoa học theo dõi hướng đi, đường đi, vị trí thuốc sau đưa vào thể Hơn nữa, hệ chất mang dendrimer hệ mang thuốc giải phóng chậm có kiểm sốt mang đến nhiều lợi so với phương pháp sử dụng thuốc truyền thống tăng hiệu lực thuốc, giảm độ độc thuốc, giảm tác dụng phụ tạo thuận tiện cho người bệnh

Tuy nhiên, nghiên cứu trước cho thấy PAMAM dendrimer có bề mặt chứa nhóm amine tích điện dương gây độc cho thể có tính gây độc tế bào có phản ứng dễ gây viêm nhiễm thể phân bố tới phổi gây phù nề phổi; đồng thời nhóm amine bề mặt PAMAM dendrimer tích điện dương bị đào thải nhanh khỏi vịng tuần hồn máu Để giải vấn đề nhà khoa học biến tính nhóm amine bề mặt PAMAM dendrimer với tác nhân khác (các tác nhân alkyl hóa nhóm amine; polymer sinh học (chitosan, alginate, gelatin,…) hay polymer chức (PNIPAM, PAA…) nhằm triệt tiêu điện tích dương đó, tạo rào cản khơng gian xung quanh nhóm amine Khi dendrimer giảm gây độc tế bào, kéo dài thời gian lưu tuần hoàn máu đồng thời làm giảm tích lũy thể ứng dụng hiệu y-dược [6], [9] Việc biến tính PAMAM dendrimer với polymer “thông minh” giúp cải thiện khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer đồng thời giảm độc tính thuốc

45

của vật liệu polymer thông minh lĩnh vực cảm biến sinh học, vận chuyển thuốc, chuyển gen công nghệ tế bào Cơ chế polymer thông minh giải thích cách đơn giản thay đổi trạng thái mạch polymer theo thay đổi mơi trường ngồi gây tính chất thú vị có giá trị ứng dụng thực tế Các polymer “thông minh” dùng để phát triển hệ chất mang thuốc có khả kết nang, cố định thuốc, giải phóng thuốc theo điều kiện mơi trường … cho phép thuốc vận chuyển đến vị trí mong muốn thể cách an toàn, thời điểm cần thiết liều quy định [121]

1.3 Polymer nhạy nhiệt - poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)

PNIPAM-COOH poly(N-isopropylacrylamide) khóa đầu nhóm –COOH Đây loại polymer nhạy nhiệt, có khả trương nở nhiệt độ thấp (t<30oC) co lại, làm đục dung dịch nhiệt độ cao (t=32oC)

Hình 1.30 Cơng thức cấu tạo PNIPAM-COOH

Có hai loại polymer nhạy nhiệt Đó dung dịch có nhiệt độ tới hạn thấp (Lower Critical Solution Temperature, LCST) dung dịch có nhiệt độ tới hạn cao (Upper Critical Solution Temperature, UCST)

LCST dung dịch có nhiệt độ tới hạn thấp, nghĩa nhiệt độ hạ xuống tới nhiệt độ tới hạn thành phần hỗn hợp trộn lẫn vào tạo thành dung dịch đồng Upper critical solution temperature dung dịch có nhiệt độ tới hạn cao Khi nhiệt độ tăng lên tới nhiệt độ tới hạn hỗn hợp thành phần hỗn hợp trộn lẫn vào tạo thành dung dịch đồng

46

người (37 °C) [122] Ở nhiệt độ thấp giá trị LCST, hình thành liên kết hydrogen nhóm amide phân cực PNIPAM phân tử nước dẫn đến hòa tan polymer Tại nhiệt độ lớn LCST, PNIPAM trở nên kỵ nước chuyển đổi hình thái từ dạng cuộn xoắn sang hình cầu gây tượng kết tụ Giá trị LCST PNIPAM biến tính kiểm soát cách ghép nối với loại monomer khác Phản ứng đồng trùng hợp PNIPAM với monomer có tính kỵ nước làm giảm giá trị LCST Ngược lại, việc kết hợp PNIPAM với monomer ưa nước dẫn đến việc tăng giá trị LCST Hơn nữa, số nghiên cứu cho thấy pH nồng độ muối có ảnh hưởng đến giá trị LCST dung dịch PNIPAM

1.4 Polymer nhạy pH - Poly Acrylic Acid (PAA)

47

Acid Poly (acrylic) (PAA) (hình 1.31) loại polymer tổng hợp nhạy pH có nhóm anion/acid (-COOH) chuỗi polymer PAA vật liệu tiềm cho ứng dụng y sinh, đặc biệt hệ thống mang thuốc dựa sở hydrogel nhạy pH [125] PAA có độ hịa tan nước cao bị hịa tan trước vận chuyển thuốc [126] Vì vậy, monomer acid acrylic đồng trùng hợp với số monomer khác có chứa nhóm chức đặc trưng 2-hydroxymethacrylate, N, N’-methylenebisacrylamide N-isopropylacrylamide liên kết chéo dễ dàng với poly (vinyl alcohol) poly(ethylene glycol) phương pháp trùng hợp gốc tự ghép chuỗi polysacarit Giá trị pKa PAA nằm khoảng từ 4,5 đến 5,0 pH > 5, nhóm acid chuỗi polymer bị ion hóa mang điện tích âm Điện tích âm gây lực đẩy mạnh chuỗi nguyên nhân gây trương nở diện rộng Tuy nhiên, có xu hướng giảm trương pH < (pH dày) nên bảo vệ thuốc khỏi phân rã biến tính độ pH thấp dịch dày giải phóng thuốc vị trí cụ thể, ruột non ruột già [127] Do đặc tính này, PAA copolymer chứa PAA sử dụng làm hydrogel nhạy pH mang thuốc uống

Hydrogel PAA nhạy pH liên kết chéo poly (l-glutamic acid) -g- (2-hydroxyl methacrylamide) thể tính chất trương /giảm trương phụ thuộc pH sử dụng để vận chuyển BSA (Bovine Serum Albumin) [128] Các mixen khối copolymer PAA pNIPAAM (pNIPAAm-b-PAA) nhạy pH nhạy nhiệt sử dụng làm hệ mang thuốc chống ung thư doxorubicin [129] Các hydrogel phân hủy sinh học nhạy pH tổng hợp từ dẫn xuất PAA poly(l-glutamic acid) dùng để vận chuyển thuốc uống Insulin [130]

HO O

CH3

O

HO HO O

H3C

HO O

CH3

48

Chương NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

- Điều chế dẫn xuất PAMAM dendrimer: (PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid)

- Đánh giá cấu trúc độ chuyển hóa

- Đánh giá khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ chất mang PAMAM dendrimer tạo dẫn xuất bao gồm PAMAM dendrimer - Poly(N-isopropylacrylamide), PAMAM dendrimer - Poly acrylic acid

- Phân tích cấu trúc phức chất hệ chất mang - Cisplatin đánh giá hiệu suất mang thuốc Cisplatin hệ chất mang

- Thử độc tính tế bào PAMAM dendrimer số dẫn xuất PAMAM dendrimer

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Phương pháp tổng hợp

a Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine (EDA)

PAMAM dendrimer từ hệ G-0.5 đến G4.5 tổng hợp từ lõi ethylenediamine (EDA) phát triển nhánh methyl acrylate (MA) ethylendiamine (EDA) sở phản ứng ester hóa phản ứng alkyl hóa theo báo cáo Donald Tomalia [1]

Sử dụng phổ 1H-NMR xác định thành phần cấu trúc PAMAM

dendrimer từ hệ G-0.5 đến G4.5 Tính tốn khối lượng phân tử PAMAM dendrimer dựa phổ 1H-NMR

b Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin

Phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G3.0 PAMAM dendrimer G4.0 với Cisplatin dựa việc hình thành liên kết phối trí ion trung tâm Pt2+

của Cisplatin nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer Cấu trúc sản

49

c Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3.5 G4.5 với Cisplatin

Phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G2.5, G3.5 G4.5 với Cisplatin dựa việc hình thành liên kết phối trí ion trung tâm Pt2+

Cisplatin (đã thủy phân AgNO3) nhóm -COO- bề mặt

PAMAM dendrimer G2.5, G3.5 G4.5 (đã thủy phân NaOH) Cấu trúc sản phẩm xác định phổ FTIR Sử dụng phương pháp đo TEM xác định hình thái, kích thước sản phẩm Hàm lượng Pt sản phẩm xác định phương pháp ICP-MS So sánh hàm lượng Cisplatin sản phẩm thực phản ứng hỗ trợ có hỗ trợ sóng siêu âm

d Biến tính PAMAM dendrimer G3.0 với PNIPAM

Biến tính PAMAM dendrimer G3.0 với PNIPAM dựa sở liên kết amide (-NHCO-) với chất hoạt hóa NHS EDC Sử dụng phổ 1H-NMR xác định

thành phần cấu trúc khối lượng phân tử dẫn xuất PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM Sử dụng phương pháp đo TEM xác định hình thái, kích thước sản phẩm

e Tổng hợp PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM

PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM tổng hợp dựa phản ứng cộng Michael amine bậc (-NH2) bề mặt G3.0-PNIPAM với MA Thành

phần cấu trúc khối lượng phân tử sản phẩm xác định phổ 1

H-NMR Sử dụng phương pháp đo TEM xác định hình thái, kích thước sản phẩm

f Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin

Phản ứng tạo phức dẫn xuất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin dựa việc hình thành liên kết phối trí ion trung tâm Pt2+

Cisplatin (thủy phân AgNO3) nhóm -COO- bề mặt PAMAM

dendrimer G3.5-PNIPAM (thủy phân NaOH) Hàm lượng Pt sản phẩm xác định phương pháp ICP-MS

g Biến tính PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với PAA

Biến tính PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với PAA dựa sở liên kết amide (-NHCO-) với chất hoạt hóa EDC Sử dụng phổ 1H-NMR xác định thành

50

và PAMAM dendrimer G4.0-PAA Sử dụng phương pháp đo TEM xác định hình thái, kích thước sản phẩm

h Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin

Phản ứng tạo phức dẫn xuất PAMAM dendrimer G3.0-PAA PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin dựa việc hình thành liên kết phối trí ion trung tâm Pt2+ Cisplatin (thủy phân AgNO

3) nhóm

-COO- bề mặt của dẫn xuất Cấu trúc sản phẩm xác định

phổ FTIR Sử dụng phương pháp đo TEM xác định hình thái, kích thước sản phẩm Hàm lượng Pt sản phẩm xác định phương pháp ICP-MS

2.1.1.2 Thử nghiệm khả mang thuốc 5-FU phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin

5-FU nang hóa vào phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin Hàm lượng 5-FU nang hóa xác định phương pháp HPLC-DAD

2.1.1.3 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro số hệ chất mang

Lượng Cisplatin giải phóng từ hệ chất mang xác định phương pháp ICP-MS

Lượng 5-FU giải phóng từ hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin xác định phương pháp HPLC-DAD

2.1.1.4 Tính tốn động học dược động học q trình giải phóng thuốc

Chọn lựa mơ hình động học giải phóng thuốc phù hợp dự đốn mơ hình dược động học số hệ mang thuốc Cisplatin

2.1.1.5 Kiểm tra độc tố tế bào

Độc tố tế bào số hệ mang thuốc Cisplatin kiểm tra phương pháp Sulforhodamine B (SRB) dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 tế bào ung thư vú MCF-7

51

Các hóa chất cung cấp từ hãng Acros, Sigma Aldrich, Merck với chất lượng cao phù hợp mục đích sử dụng cho tổng hợp hóa học phân tích

Bảng 2.1 Các hóa chất tinh khiết dùng nghiên cứu thực nghiệm

Hóa chất Nguồn gốc

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ 5-Fluorouracil (5-FU) Acros Organics, Hoa Kỳ

AgNO3 Merck, Đức

Cisplatin Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Ethylenediamine (EDA) Merck, Đức

HCl Merck, Đức

Methanol Merck, Đức

Methylacrylate (MA) Merck, Đức

NaOH Merck, Đức

N-hydroxy succinimide (NHS) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Nitrogen Việt Nam

pnitrophenyl chloroformate (NPC) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ Phosphate buffered saline (PBS) Merck, Đức

Poly Acrylic acid 63% H2O Mw = 2000 Acros Organics, Hoa Kỳ

poly(N-isopropylacrylamide) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Sodium acetate Merck, Đức

Toluene Merck, Đức

2.2.2 Dụng cụ thiết bị

2.2.2.1 Dụng cụ

 Bình cầu cổ nhám cổ, bình cầu cổ nhám hai cổ,

 Phểu nhỏ giọt

 Ống đong

 Pipette

 Cá từ

52

 Túi thẩm tách MWCO 3.000-5.000 Da, 6.000-8.000 Da, 12.000- 14.000 Da (Spectra/Por Regenerated Cellulose Dialysis Membranes)

2.2.2.2 Thiết bị

 Cân điện tử - Satorius (4 số lẻ)

 Cân điện tử - Satorius (5 số lẻ)

 Tủ sấy, bể siêu âm

 Tủ sấy chân không

 Máy cô quay chân không Eyala,

 Bể gia nhiệt memmert, phịng thí nghiệm phân tích, trường Đại học Cơng nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh

 Máy khuấy từ gia nhiệt số Thermo SP131320-33 (50-1200v/p), Mỹ, Máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô -800C,

Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) chụp máy JEOL JEM 1400 140 KV, Nhật Bản, Trường Đại học Bách Khoa, TP.HCM

 Phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR máy Equinox 55 Bruker, Đức, Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các mẫu nén ép thành viên với KBr Phạm vi bước sóng từ 400–4000 cm-1

 HPLC đo máy Agilent 1260, Hoa Kỳ, Trường Đại Học Công nghiệp thực phẩm, TP.HCM

 Phổ 1H-NMR đo máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500,

được thực cách sử dụng D2O làm dung môi methanol đồng

dung môi tần số 500 MHz, Khoa Khoa học Vật liệu Năng lượng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

 Phổ khối lượng MS đo máy Agilent 1100 LC-MSD Trap (dạng phun sương), Khoa Khoa học Vật liệu Năng lượng, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

53

 Đánh giá độc tính tế bào MCF-7 đo PTN-SHPT- BM Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến hệ G4.5 từ tâm ethylenediamine (EDA)

Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ G4.5 qua 11 giai đoạn, bắt đầu giai đoạn tổng hợp hệ G-0.5 từ ethylenediamine (EDA) đến hệ G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0 G4.5

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer

Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM hệ lẻ (G-0.5; G0.5; G1.5; G2.5; G3.5 G4.5 methylacrylate (MA), thời gian phản ứng 1-4 ngày (tùy vào giai đoạn tổng hợp hệ lớn thời gian phản ứng tăng) Đuổi methylacrylate cách cô quay chân không với dung môi methanol nhiệt độ 42oC

Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM hệ chẵn (G0.0; G1.0; G2.0;3.0; G4.0 G5.0) ethylenediamine (EDA), thời gian 4-8 ngày (tùy vào hệ lớn ngày tăng) Loại EDA dư cách cô quay chân không sử dụng hỗn hợp dung môi toluene: methanol = 9: nhiệt độ 450C

H2N

NH2 H2C

OCH3

O

+ MeOH

2 ngày N N

H3CO O

H3CO

O O OCH3

OCH3 O EDA MA PAMAM G-0.5 EDA MeOH + ngày N N HN O H N

O O NH

N H

O NH2

NH2

H2N

H2N

PAMAM G0 N N HN O H N O H N O N H O N N N N OCH3 O OCH3 O OCH3 O OCH3 O

H3CO

H3CO

O O

H3CO O

H3CO

O PAMAM G0.5 MeOH MA 2 ngày ngày MeOH EDA

54

Qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ lẻ (G-0.5; G0.5; G1.5; G2.5; G3.5 G4.5)

Tiến hành phản ứng:

Cho (1,2a x Z; Z số nhóm bề mặt PAMAM dendrimer) mmol (V mL) dung dịch methylacrylate (MA) V mL dung dịch methanol vào bình cầu hai cổ, làm lạnh, lắp hệ thống khuấy từ Nhỏ từ từ giọt hỗn hợp: a mmol (b mL) dung dịch ethylenediamine (EDA)/ a mmol (b g) PAMAM 10b mL dung dịch methanol vào hỗn hợp trên, giữ lạnh hỗn hợp phản ứng 00C sau

đó tiến hành phản ứng nhiệt độ phịng 1-4 ngày (thế hệ cao tăng thời gian phản ứng) mơi trường khí N2 Tỷ lệ MA: EDA phản ứng

là 1,2 x Z :1

Nhỏ từ từ; Nhiệt độ 00C (2 giờ);

Khuấy từ, mơi trường khí N2

a mmol EDA (b mL)/ a mmol PAMAM G chẵn (b gam) hòa tan 10 x b mL

(1,2a x Z) mmol MA (V mL) hòa tan V mL MeOH

Phản ứng nhiệt độ phòng (1-4 ngày); Khuấy từ, mơi trường khí N2

Cơ quay loại MA dư (420C)

Thẩm tách (màng MWCO) MeOH (2 ngày)

Loại MeOH dư (cô quay)

PAMAM G lẻ

55 Tinh chế sản phẩm:

Cô quay thu hồi hết dung dịch methylacrylate cịn dư sau phản ứng dung mơi methanol, khoảng ngày, nhiệt độ 420C Tiến hành thẩm tách

sản phẩm ngày túi thẩm tách MWCO dung mơi methanol, sau quay lại để thu sản phẩm

Qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ chẵn (G0; G1.0; G2.0; G3.0 G4.0)

Tiến hành phản ứng:

Cho (10a x Z) mmol hay V mL dung dịch EDA 2V mL dung dịch methanol vào bình cầu hai cổ, lắp hệ thống khuấy từ Nhỏ từ từ giọt hỗn hợp a mmol hay b g dung dịch PAMAM 10b mL dung dịch methanol vào hỗn hợp trên, giữ lạnh hỗn hợp phản ứng 00C sau tiến hành phản ứng

tại nhiệt độ phòng 4-8 ngày (thế hệ cao tăng thời gian phản ứng) mơi trường khí N2 Tỷ lệ EDA: PAMAM phản ứng 10 x Z:1

Tinh chế sản phẩm:

Cô quay thu hồi hết dung dịch ethylenediamine dư sau phản ứng hệ dung môi toluene: methanol (9:1), khoảng ngày, nhiệt độ 450C Tiến

hành thẩm tách sản phẩm ngày túi thẩm tách MWCO dung môi methanol, sau quay lại để thu sản phẩm

Lượng EDA dùng với tỷ lệ mol so với hệ G = (-0.5; 0.5; 1.5; 2.5; 3.5) tính sau:

nEDA = nPAMAM x Z x 10 (mol)

Lượng methylacrylate dùng với tỷ lệ mol so với hệ G = 0; G1.0; G2.0; G3.0; G4.0, G5.0) tính sau:

nMA = nPAMAM x Z x 1,2 (mol)

Với nEDA, nMA nPAMAM số mol EDA, methylacrylate PAMAM, Z

số nhóm bề mặt

56

Sản phẩm PAMAM G-0.5, G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0, G4.5 sau tổng hợp xác định cấu trúc phổ MS (thế hệ thấp)

1H-NMR

2.3.2 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 với Cisplatin

Cisplatin 0,167 mmol (50 mg) hòa tan 20 mL H2O cho vào bình cầu

2 cổ khuấy liên tục nhiệt độ phịng mơi trường khí N2

Hình 2.3 Sơ qui trình tổng hợp PAMAM dendrimer hệ chẵn

Phản ứng nhiệt độ phịng (4-8 ngày); Khuấy từ; mơi trường khí N2

Nhỏ từ từ; Nhiệt độ 00C (2 giờ)

Khuấy từ, mơi trường khí N2

a mmol PAMAM G lẻ (b gam) hòa tan 10 x b mL MeOH

(10a x Z) mmol EDA (V mL) hòa tan 2V mL MeOH

Thẩm tách (màng MWCO) MeOH (2 ngày)

Loại MeOH dư (cô quay)

PAMAM G chẵn

Cô quay loại EDA dư (470C) hỗn

57

PAMAM dendrimer G3.0 (0,005 mmol; 36 mg), G4.0 0,003 mmol (37 mg) hòa tan mL nước DI, thêm từ từ dung dịch HCl 0,1N pH=7-8 Nhỏ từ từ dung dịch PAMAM dendrimer vào dung dịch Cisplatin, khuấy liên tục 24 đánh siêu âm nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 Q trình thực

hiện ln điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp Sản phẩm lọc túi thẩm tách Regenerated Cellulose MWCO 3.000 – 5.000 Da đông khô để thu phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin dạng bột

2.3.3 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5 với Cisplatin PAMAM G3.0, G4.0

a mmol

Hòa tan

Cho từ từ dung dịch PAMAM G3.0/G4.0 vào dd Cisplatin; Khuấy từ 24h, siêu âm 1h, mơi trường khí N2

PAMAM G3.0CisPt/ PAMAM G4.0CisPt Thêm HCl 0.1N

đến pH=7-8

Thẩm tách nước, màng MWCO 3.000-5.000 Da Dung dịch sau thẩm tách

Cô quay loại bớt nước Đông khô

Cisplatin b mmol

Nước DI; mơi trường khí N2

Hòa tan

58

Cisplatin 50 mg (0,167 mmol) hòa tan nước DI, sau cho từ từ 3,42 mL dung dịch AgNO3 0,1 M vào khuấy liên tục 24 nhiệt độ

phịng khí N2, bình phản ứng điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp để ngăn

chặn phân hủy ánh sáng Kết tủa AgCl loại bỏ cách ly tâm lọc qua màng lọc 0,22 m PAMAM G2.5 31,3 mg (0,005 mmol) làm qua túi thẩm tách loại 3.500-5.000Da, sau cho từ từ 1,67 mL dung dịch NaOH 0,1M vào khuấy

Cho từ từ dung dịch G2.5, G3.5, G4.5 thủy phân vào dung dịch Cisplatin thủy phân khuấy liên tục 24 nhiệt độ phòng mơi trường khí N2

Hỗn hợp sau phản ứng cho vào túi thẩm tách loại 3.500-5.000Da, dung mơi thẩm tách nước DI, thể tích nước thẩm tách gấp 100 lần thể tích dung dịch phản ứng đem thẩm tách, thời gian thẩm tách

2.3.4 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G 4.5-Cisplatin SA (có sử dụng siêu âm)

Tiến hành tương tự phản ứng tạo phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin Sau khuấy liên tục 24 nhiệt độ phịng mơi trường khí N2, hỗn hợp phản ứng đem đặt vào bể siêu âm với nhiệt độ phòng

phản ứng tiếp tục trong mơi trường khí N2

Hỗn hợp sau phản ứng cho vào túi thẩm tách loại 3.500 – 5.000Da, dung môi thẩm tách nước DI, thể tích nước thẩm tách gấp 100 lần thể tích dung dịch phản ứng đem thẩm tách, thời gian thẩm tách Tiến hành cô quay để loại bớt nước đông khô thu sản phẩm thu có dạng rắn màu vàng nhạt

Tiến hành tương tự phản ứng tạo phức PAMAM G4.5-Cisplatin Sau khuấy liên tục 24 nhiệt độ phịng mơi trường khí N2, hỗn hợp

phản ứng đem đặt vào bể siêu âm với nhiệt độ phòng phản ứng tiếp tục trong mơi trường khí N2

59

dịch phản ứng đem thẩm tách, thời gian thẩm tách Tiến hành cô quay để loại bớt nước đông khô thu sản phẩm thu có dạng rắn màu vàng nhạt

2.3.5 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.0 biến tính với PNIPAM

PAMAM G3.0 (315 mg; 0,046 mmol) hòa tan nước cất (3 mL) vào bình hai cổ Dung dịch HCl (10 %) nhỏ từ từ vào bình đến đạt pH ≈ 6.5 Sau đó, 12 mL PNIPAM-COOH (1,75 g; 0,25 mmol) cho vào hỗn hợp điều kiện khuấy từ ổn định 25oC Đồng thời, NHS (0,5 mmol) EDC (0,5

Dung dịch thủy phân

V mL NaOH 0,1M b*Z mmol; t = 2h Cisplatin

a mmol

Hòa tan

t = 24h

PAMAM G lẻ b mmol

Thẩm tách, loại bớt nước

Dung dịch Cisplatin thủy phân

PAMAM G lẻ-CisPt Thủy phân 3,42 mL dd

AgNO3 0,1 M

Loại AgCl, Loại bớt nước

Khuấy từ 24h Siêu âm 1h

Đơng khơ

Hịa tan

60

mmol) thêm vào để hoạt hóa PNIPAM –COOH Giữ phản ứng cố định nhiệt độ 30oC 24 Sau đó, thẩm tách hỗn hợp túi thẩm tách

Regenerated Cellulose MWCO 12.000-14.000 Da dung dịch methanol ngày Cô quay thu hồi sản phẩm (Hình 2.8) Cấu trúc sản phẩm xác định 1H-NMR

Sản phẩm thu G3-PNIPAM dạng rắn có màu vàng nhạt Cấu trúc sản phẩm xác định 1H-NMR Hình thái kích thước hạt xác

định TEM phân bố kích thước hạt xác định DLS

2.3.6 Tổng hợp PAMAM dendrimer G 3.5 biến tính với PNIPAM

G3.0-PNIPAM (100 mg, 0,002 mmol) G3.0 PAMAM dendrimer hòa tan 300mL methanol methyl acrylate (117 L, 1,219 mmol) hòa tan với mL methanol Nhỏ từ từ giọt dung dịch G3.0-PNIPAM sau hòa tan

PAMAM G3.0 (315 mg) + 3mL nước cất;

Trung hòa HCl 10%

PNIPAM (1,75g) 12 mL nước cất, 0,5 mmol NHS 0,5 mmol EDC

Phản ứng Khuấy từ 25-29oC

trong 24

Thẩm tách màng (MWCO 12000-14000) ngày

methanol

Loại MeOH dư (cô quay)

G3-PNIPAM

61

methanol vào methyl acrylate bình cầu 0oC 1giờ sau cho tiến

hành phản ứng nhiệt độ phòng 96 giờ, khuấy cung cấp N2

quá trình phản ứng Cơ quay, sản phẩm thu G3.5-PNIPAM có dạng bột màu vàng nhạt Cấu trúc sản phẩm xác định 1H-NMR Hình thái

kích thước hạt xác định TEM phân bố kích thước hạt xác định DLS

2.3.7 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM với Cisplatin Nhỏ từ từ 1,4 mL NaOH 0,1M vào G3.5-PNIPAM (109 mg, 0,0026 mmol) hòa tan 5mL nước cất khuấy từ để thủy phân hoàn toàn Cisplatin 50 mg (0,167 mmol) hòa tan nước DI, sau cho từ từ 3,42 mL dung dịch AgNO3 0,1 M vào khuấy liên tục 24 đánh siêu âm

nhiệt độ phịng khí N2, bình phản ứng điều kiện tránh ánh sáng trực

G3.0-PNIPAM (0.002 mmol) +

300mL MeOH

Methylacrylate (1.219 mmol) + 5mL MeOH Phản ứng: mơi trường khí N2;

Khuấy từ 0oC (1h) phản

ứng 96h (nhiệt độ phịng)

Cơ quay thẩm tách màng (MWCO 12.000-14.000 Da) ngày methanol

Loại MeOH dư (cô quay)

G3.5-PNIPAM

62

tiếp để ngăn chặn phân hủy ánh sáng Kết tủa AgCl loại bỏ cách ly tâm lọc qua màng lọc 0,22 m Nhỏ từ từ dung dịch thủy phân G3.5-PNIPAM-COONa vào dung dịch Cisplatin thủy phân, khuấy liên tục 24 nhiệt độ phòng mơi trường khí N2 Q trình thực ln điều kiện

tránh ánh sáng trực tiếp Sản phẩm lọc túi thẩm tách Regenerated Cellulose MWCO 6.000 – 8.000 Da đông khô để thu phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin dạng bột màu vàng

Dung dịch G3.5-PNIPAM thủy phân

1,4 mL NaOH 0,1M; t = 2h Cisplatin

50mg

Hòa tan

t = 24h

G3.5-PNIPAM-COOH 109 mg

Thẩm tách, loại bớt nước

Dung dịch Cisplatin thủy phân

G3.5-PNIPAM-CisPt Thủy phân 3,42 ml dd

AgNO3 0,1 M

Loại AgCl, Loại bớt nước

Khuấy từ 24h Siêu âm 1h

Đơng khơ

Hịa tan

63

2.3.8 Tổng hợp PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA

G3.0 0,7988g (0,116 mmol) hòa tan 40 mL H2O, thêm từ từ giọt

HCl 10% đến pH PAA 4,4045 g (1,387 mmol) hòa tan 40 mL H2O, thêm

từ giọt NaOH 10% đến pH 7, thêm tiếp EDC 0,2154 g (1,387 mmol) Cho từ từ dung dịch PAA vào dung dịch PAMAM G3.0 Khuấy từ vòng 24 Cô quay để loại bớt nước tiến hành thẩm tách màng (MWCO 12.000-14.000 Da) ngày H2O Cô quay để loại bớt nước tiến hành đông khô sản phẩm

PAMAM G3.0; G4.0 + 40 mL H2O

PAA + 40 mL H2O

Loại dung môi thẩm tách ngày H2O

Cô quay đông khô mẫu

G3.0; 4.0-PAA Thêm từ từ HCl

10% đến pH =

Dung dịch PAMAM G3.0; G4.0

Thêm từ từ NaOH 10% đến pH = +

0,1747g EDC (1,255 mmol)

Khuấy từ 24h

Dung dịch PAA hoạt hóa

64

thu G3.0-PAA có dạng bột màu trắng Cấu trúc dẫn xuất xác định thông qua 1H-NMR TEM

2.3.9 Tổng hợp PAMAM dendrimer G4.0 biến tính với PAA

G4.0 1g (0,070 mmol) hòa tan 40 mL H2O, thêm từ từ giọt HCl

10% đến pH PAA 3,5730 g (1,1255 mmol) hòa tan 40 mL H2O, thêm từ

từng giọt NaOH 10% đến pH 7, thêm tiếp EDC 0,1747 g (1,1255 mmol) Cho từ từ dung dịch PAA vào dung dịch PAMAM G4.0 Khuấy từ vòng 24 Cô quay để loại bớt nước tiến hành thẩm tách màng (MWCO 12.000-14.000 Da) ngày H2O Cô quay để loại bớt nước tiến hành đông khơ sản phẩm

thu G4.0-PAA có dạng bột màu trắng Cấu trúc dẫn xuất xác định thông qua 1H-NMR TEM

2.3.10 Tổng hợp phức PAMAM dendrimer G3.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.0-PAA với Cisplatin

Cisplatin 50 mg (0,167 mmol) hịa tan nước DI, sau cho từ từ 3,33 mL dung dịch AgNO3 0,1 M vào khuấy liên tục 24 đánh

siêu âm nhiệt độ phịng khí N2, bình phản ứng điều kiện tránh

ánh sáng trực tiếp để ngăn chặn phân hủy ánh sáng Kết tủa AgCl loại bỏ cách ly tâm lọc qua màng lọc 0,22 m

PAMAM dendrimer G3.0-PAA (31,08 mg; 0,002 mmol), PAMAM dendrimer G4.0-PAA (31,33 mg; 7,08x10-4 mmol) hòa tan mL nước DI

cho từ từ dung dịch NaOH 0,1M vào pH 7-8 Nhỏ từ từ giọt dung dịch G3.0-PAA vào dung dịch Cisplatin, khuấy từ liên tục 24 nhiệt độ phịng mơi trường khí N2 Q trình thực ln điều kiện tránh ánh sáng

65

2.3.11 Thử nghiệm khả mang thuốc 5-FU phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin

Hòa tan 100mg loại PAMAM PNIPAM PAMAM G3.5-PNIPAM- cisPt 2,5 mL nước cất Sau đó, cho vào ống 30 mg 5-FU, đánh siêu âm thêm khuấy từ 24 37oC Thẩm tách dung dịch

thu với túi thẩm tách MWCO 3.000-5.000 Da 1,5 L H2O để loại 5-FU

Dung dịch G3.0-PAA; G4.0-PAA

NaOH 0,1M đến pH = Cisplatin

50mg

Hòa tan

t = 24h

G3.0-PAA; G4.0-PAA

Thẩm tách, loại bớt nước

Dung dịch Cisplatin thủy phân

G3.0; 4.0-PAA-CisPt Thủy phân 3,33 mL dd

AgNO3 0,1 M

Loại AgCl, Loại bớt nước

Khuấy từ 24h Siêu âm 1h

Đông khơ

Hịa tan

66

dư khơng nang hóa Dung dịch sau thẩm tách đem đông khô, thu sản phẩm PAMAM G3.5-PNIPAM-5FU G3.5-PNIPAM-Cisplatin-5FU

2.3.12 Xác định hàm lượng Pt phương pháp ICP-MS

Phép đo ICP thực hệ thống ICP-MS-7700x/Agilent Thiết bị sử dụng hệ phun sương làm giàu với buồng phun sương hình nón, impact bead làm giảm kích hước hạt sương kết hợp với bơm nhu động để hút mẫu Bộ lục cực CCT ED sử dụng để loại nhiễu đa nguyên tử Thiết bị vận hành điều kiện tần số RF 1550W, vận tốc khí Ar cấp cho plasma 15 L/phút, vận tốc khí Heli phun sương 4,3 mL/phút khí Heli bổ trợ L/phút Mẫu hút 20 giây, làm hệ thống lần đo 20 giây, peak tín hiệu cho Pt lấy 10 mili giây Hàm lượng Pt xác định dựa khối phổ 195, nội chuẩn Luterium (Lu)

G3.5-PNIPAM-CisPt a mmol

Hòa tan

b mmol 5-FU

Dung dịch G3.5-PNIPAM.cisPt.5-FU

G3.5-PNIPAM-CisPt-Nước DI

Siêu âm 1h khuấy từ 24h

Thẩm tách nước màng MWCO 3.000-5.000 Da Dung dịch sau thẩm tách

Đông khô

67

khối phổ 175 Đường chuẩn dựng từ chuẩn stock Cisplatin 1000 ppm, pha loãng acid nitric 1%

2.3.13 Khảo sát giải phóng thuốc in vitro + Ở giá trị pH 7,4

1 mL dung dịch sản phẩm phức (G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin, G3.0-PNIPAM-Cisplatin-5FU, G4.0-PAA-Cisplatin) với nồng độ Cisplatin 100 ppm pha dung dịch đệm PBS pH 7,4 cho vào túi thẩm tách loại 3.000-3.500Da, thể tích dung dịch thẩm tách 50 mL dung dịch đệm PBS

+ Ở giá trị pH 5,5

1 mL dung dịch sản phẩm phức (G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin, G3.0-PNIPAM-Cisplatin-5FU, G4.0-PAA-Cisplatin) với nồng độ Cisplatin 100 ppm pha dung dịch đệm đệm acetate pH 5,5 cho vào túi thẩm tách loại 3.000-3.500 Da, thể tích dung dịch thẩm tách 50 mL đệm acetate Sau khoảng thời gian giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 60 72 mL dung dịch đệm bên màng thẩm tách rút để xác định lượng Cisplatin nhả từ chất mang mL dung dịch đệm bổ sung vào hệ thẩm tách

2.3.14 Nang hóa giải phóng thuốc 5-FU Phương pháp nang hóa

Hịa tan lượng thuốc xác định nước DI, khuấy để thuốc tan hoàn toàn, dung dịch (l) Tiếp theo hòa tan lượng xác định hệ chất mang thuốc nước DI Khuấy 10 phút dung dịch (2) Cho từ từ dung dịch (1) vào dung dịch (2), tiếp tục khuấy hỗn hợp 24 nhiệt độ phòng

Sau nang hóa xong, cho dung dịch vào túi thấm tách có 3.500 Da để vào falcon, thêm nước DI tiến hành thẩm tách Dung dịch bên màng đo HPLC để xác định lượng thuốc 5-FU tự Lượng thuốc nang hóa tính gián tiếp thơng qua lượng thuốc tự theo công thức sau:

68 Trong đó:

mDL : Lượng thuốc nang hóa (mg); mt.bđ: Tổng luợng thuốc ban đầu

(mg); mnm : Lượng thuốc tự (mg); Ct.td : Nồng độ thuốc tự (ppm

g/mL); Vnm: Thể tích dung dịch ngồi màng sau thẩm tách (mL)

Hiệu suất nang hóa (Drug Encapsulation Efficiency - EE%) tính theo cơng thức sau:

EE% = mDL mt.bđ

×100%

Khả tải thuốc (Drug Load Content – DL%) tính theo cơng thức sau:

DL% = mDL mDL+ mcm

x 100% Trong đó: mcm khối lượng chất mang

Phương pháp giải phóng thuốc

Hịa tan lượng xác định polymer mang thuốc nước DI cho vào màng 3500 Da, sau dó để vào falcon, thêm nước DI với pH 7,4 Sau 1, 3, 6, 12, 24, … tiến hành lấy mẫu dung dịch màng lần, đồng thời bổ sung lại lượng nước DI có pH Dung dịch ngồi màng đem đo HPLC

Lượng thuốc giải phóng tính theo cơng thức: mtgp= Ct gp*V*10

-3 %tgp= mt pt

mtnh

x 100 Trong đó:

- mt.gp: Lượng thuốc giải phóng; mt.nh: Lượng thuốc nang hóa; Ct.gp:

Nồng độ thuốc giải phóng; V: Thể tích dung dịch ngồi màng 2.3.15 Động học dược động học giải phóng thuốc

a Động học nhả thuốc

69

thuốc phụ thuộc vào pH, chất thuốc polymer Các mơ hình động học giải phóng thuốc phổ biến sau [131], [132]:

Động học bậc không : Qt = Q0 + k0t

Động học bậc : logQt=logQ0+ k1t/2,303 : logQrt=logQ0- k1t/2,303 Phương trình Higuchi : Q = kH√t

Phương trình Hixson – Crowell : Q3 0

- Q3 t= k

HCt Phương trình Korsmeyer-Peppas : F = Mt

M = kmt n Trong đó:

Q0: lượng thuốc ban đầu; Qt: tổng lượng thuốc giải phóng đến thời điểm t;

Qrt: lượng thuốc lại thời điểm t; Mt/M: phần thuốc giải phóng thời điểm

t; k0, k1, kH, kHC, km số

b Dự đoán mơ hình dược động học q trình giải phóng thuốc

Mơ hình dự đốn dược động học thuốc thiết lập dựa bước sau đây:

Phần trăm thuốc giải phóng thu từ thực nghiệm chuyển đổi thành số lượng thuốc riêng lẻ (mg) theo khoảng thời gian lấy mẫu

Ngay xảy hấp thụ thuốc, trình thải trừ thuốc bắt đầu tuân theo động học bậc 1, lượng thuốc thải trừ theo thời gian tính phương trình sau:

Ke = lnQ1-lnQ2 t2- t1

Trong đó, Ke số tốc độ thải trừ bậc 1, Q1 Q2 (mg) lượng thuốc

dự đoán máu khoảng thời gian t1 t2

Tổng lượng thuốc có máu Qm (mg) tính đến thời điểm tm bằng:

Q

m = Qi

70

Nồng độ thuốc dự kiến máu thời điểm tm tính sau:

C(ng/mL)=Qm*F*10

Vd*Bw Trong đó:

F: số sinh khả dụng thuốc đặc tính tốc độ mức độ thành phần hoạt tính, gốc hoạt tính chất chuyển hóa có hoạt tính hấp thu vào tuần hoàn chung sẵn sàng nơi tác động Phần liều thuốc hấp thu guyên vẹn gọi liều khả dụng F=100% trường hợp tiêm tĩnh mạch

Vd (L/kg): Thể tích phân bố thuốc đại lượng biểu thị mối liên quan lượng thuốc thể nồng độ thuốc huyết tương trạng thái cân

Bw: trọng lượng thể người 2.3.16 Kiểm tra độc tố tế bào

Thí nghiệm thực phương pháp Sulforhodamine B (SRB) dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 phịng thí nghiệm sinh học phân tử, trường đại học Khoa học Tự Nhiên TP.HCM Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra độc tố tế bào nguyên bào sợi số hệ chất mang như: PAMAM G4.0, PAMAM G4.5 G4.0-PAA PAMAM G3.0, PAMAM G3.0-PNIPAM, G3.0-PNIPAM-5FU, PAMAM G3.5, PAMAM G3.5-Cisplatin PAMAM G3.5-5FU, PAMAM G3.5-5FU-Cisplatin, G4.0-PAA, G4.0-PAA-Cisplatin 5FU tự thử nghiệm sàng lọc để đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào Giải đông nguồn tế bào ung thư bảo quản Nitơ lỏng nuôi cấy tới đến hệ thứ (P4) Phủ tế bào vào giếng đĩa 96 giếng (104tb/giếng) ủ 37oC, 5% CO2 24 Bổ sung môi

trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muốn thử ủ tiếp 48 Cố định tế bào với trichloroacetic acid (TCA) giữ lạnh 4oC (1-3 giờ)

71

72

Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp PAMAM Dendrimer hệ G-0.5 đến G4.5

Các sản phẩm dendrimer PAMAM tổng hợp từ hệ G-0.5 đến G4.5 dựa phản ứng ethylenediamine (EDA) methylacrylate (MA) có dạng dẻo màu vàng nhạt đậm dần từ G-0.5 đến G4.5

3.1.1 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS Phổ khối lượng MS phương pháp hiệu để xác định khối lượng phân tử polymer

73

Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 với cấu trúc sản phẩm, phù hợp với lý thuyết (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Khối lượng phân tử dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS

PAMAM CTPT MLT MMS

Sai lệch (%)

G-0.5 C18H32O8N2 407 405 0,02

G0.0 C22H48O4N10 517 517 0,00

G0.5 C54H96O20N10 1.212 1.206 0,06

G1.0 C62H128O12N26 1.430 1.428 0,02

G1.5 C126H224O44N26 2.823 2.808 0,15

G2.0 C142H288O28N58 3.256 3.259 0,03

Tuy MS phương pháp hiệu để xác định khối lượng phân tử, với dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6.049) trở MS không xác định Kết phù hợp với nghiên cứu nhóm Schwartz [49] Hood [50] Bên cạnh MS, GPC dùng để xác định trọng lượng hợp chất cao phân tử với PAMAM dendrimer, phịng thí nghiệm thường gặp nhiều khó khăn để phân tích hệ dung mơi sử dụng cho pha động hệ đệm với pH cao (pH 11) cần có loại cột phù hợp Hơn nữa, kết phân tích thường cho kết với độ đa phân tán cao Cho nên 1H-NMR phương pháp hiệu

để theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử độ chuyển hóa dendrimer đặc biệt dendrimer hệ (G) lớn

3.1.2 Xác định cấu trúc dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

Độ dịch chuyển hóa học cho proton đặc trưng dendrimer PAMAM ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [19], [120]

Trong kết phổ 1H-NMR tương ứng với proton điển hình cấu trúc dendrimer: -CH2CH2N< (a) δH = 2,60 ppm; -CH2CH2CO- (b) δH =

2,80-2,90 ppm; -CH2CH2CONH- (c) δH = 2,30 - 2,40 ppm; -CH2CH2NH2 (d)

-74

CH2CH2COOCH3- (g) δH = 2,40 - 2,50 ppm -COOCH3 (h) δH = 3,70

ppm

Kết 1H-NMR dendrimer PAMAM hệ sau:

1H-NMR PAMAM G-0.5: δH = 2,47 - 2,50 ppm (a), δH = 2,77-2,80 ppm

(b), δH = 2,54 ppm (g) δH = 3,68 ppm (h)

1H-NMR PAMAM G0.0: δH = 2,56 - 2,57 ppm (a), δH = 2,77 - 2,82 ppm

(b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 2,71 -2,75 ppm (d) δH = 3,25 - 3,27 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G0.5: δH = 2,54 -2,57 ppm (a), δH = 2,76 - 2,82 ppm

(b), δH = 2,37 - 2,40 ppm (c), δH = 3,24 - 3,26 ppm (e), δH = 2,45 - 2,48 ppm (g) δH = 3,66 ppm (h)

1H-NMR PAMAM G1.0: δH = 2,59 - 2,60 ppm (a), δH = 2,80 -2,82 ppm

(b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,73 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 - 3,28 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G1.5: δH = 2,58 - 2,59 ppm (a), δH = 2,78 - 2,86 ppm

(b), δH = 2,39 - 2,42 ppm (c), δH = 3,27 - 3,29 ppm (e), δH = 2,47 -2,50 ppm (g) δH = 3,69 ppm (h)

1H-NMR PAMAM G2.0: δH = 2,57 - 2,59 ppm (a), δH = 2,77 -2,81 ppm

(b), δH = 2,36 -2,38 ppm (c), δH = 2,68 -2,74 ppm (d) δH = 3,24 - 3,27 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G2.5: δH = 2,57 - 2,64 ppm (a), δH = 2,84 - 2,86 ppm

(b), δH = 2,40 -2,42 ppm (c), δH = 3,27 -3,30 ppm (e), δH = 2,48 - 2,46 ppm (g) δH = 3,68 - 3,69 ppm (h)

1H-NMR PAMAM G3.0: δH = 2,61 - 2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm

(b), δH = 2,38 - 2,40 ppm (c), δH = 2,74 - 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,29 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G3.5: δH = 2,57 -2,64 ppm (a), δH = 2,84-2,85 ppm

75

1H-NMR PAMAM G4.0: δH = 2,59 -2,62 ppm (a), δH = 2,80 -2,83 ppm

(b), δH = 2,39 – 2,40 ppm (c), δH = 2,74 – 2,76 ppm (d) δH = 3,26 -3,28 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G4.5: δH = 2,57 - 2.65 ppm (a), δH = 2,84 – 2,85

76

3 3

3

3

3

77

3

3

3

3

3

3 3

3

3

3

3

79

Theo kết phổ 1H-NMR, peak đặc trưng proton vị trí (a) (e) ln xuất rõ ràng không trùng lặp với peak khác, nên hai peak chọn sử dụng để tính tốn đánh giá dendrimer PAMAM So sánh tỷ lệ proton vị trí (a), (e) phân tử dendrimer χLT) tỉ lệ diện tích peak proton vị trí (a), (e) thể phổ 1H-MNR (χ

NMR) chúng tơi lập cơng thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR sau:

M(NMR) = χNMR

χLT MLT =

SH(-CH (e)2-) SH(-CH

2-)

(a) ∑H(-CH

2-)

(e) ∑H(-CH

2-)

(a)

.MLT

80 Trong đó:

SH(-CH (e)2-), SH(-CH (a)2-) : Diện tích peak proton vị trí (e) (a) xuất phổ 1H-NMR

∑H(-CH

2-)

(e)

, ∑H(-CH

2-)

(a)

: Tổng số proton vị trí (e) (a) tính cơng thức phân tử PAMAM Dendrimer

MLT : Khối lượng phân tử Dendrimer tính theo lý thuyết

Kết tính tốn sau:

Bảng 3.2 Kết tính tốn KLPT Dendrimer theo 1H-NMR

H(-CH

2-)

(e)

H(-CH

2-)

(a)

χLT M(LT) χNMR M(NMR) Sai lệch

G-0.5 (vị trí b) 404 2,01 405,62 0,40%

G0 2,00 517 1,99 515,02 0,32%

G0.5 12 0,67 1.205 0,67 1.205,42 0,06%

G1.0 24 12 2,00 1.430 1,95 1.396,18 2,36%

G1.5 24 28 0,86 2.808 0,81 2.668,19 4,96%

G2.0 56 28 2,00 3.257 1,95 3.181,78 2,30%

G2.5 56 60 0,93 6.012 0,90 5.774,30 3,95%

G3.0 120 60 2,00 6.910 1,90 6.556,70 5,11%

G3.5 120 124 0,97 12.420 0,92 11.809,71 4,91%

G4.0 248 124 2,00 14.216 1,90 13.510,97 4,96%

G4.5 248 252 0,98 25.237 0,90 23.103,55 8,45%

Kết phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Nguyễn Thị Trâm Châu [120] Nguyễn Thị Bích Trâm [18]

Các phân tử PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 tổng hợp thành cơng có cấu trúc tương đối đồng ổn định nên ứng dụng làm chất mang thuốc

81

82

Bảng 3.3 Phổ FTIR PAMAM Dendrimer G2.5, G3.5, G4.5 phức G2.5-CisPt, G3.5-CisPt, G4.5-CisPt

Phổ FTIR PAMAM G2.5, G3.5 có tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh tín hiệu có cường độ trung bình yếu vị trí 1731 cm-1, 1045 cm -1 (G2.5); 1736 cm-1, 1646 cm-1 (G3.5) tương ứng với ν

C=O, νC-O nhóm chức

ester Một tín hiệu hấp thu có cường độ mạnh, mũi bầu rộng đặc trưng cho dao động nối –OH 3294 cm-1 (G2.5); 3302 cm-1 (G3.5); 3426 cm-1 (G4.5), tín

hiệu hấp thu amide nằm vùng bị tín hiệu nối –OH che khuất Tín hiệu đặc trưng cho dao động bất đối xứng nhóm –CH2, CH3, tín

hiệu đặc trưng cho dao động nối –CH3 2952 cm-1, 2832 cm-1 (G2.5); 2952

cm-1, 2830 cm-1 (G3.5), tín hiệu dao động biến dạng ngồi mặt phẳng nhóm

CH3 1360 cm-1 (G2.5), 1359 cm-1 (G3.5), 1399 cm-1 (G4.5)

Các mũi với tín hiệu dao động đặc trưng phù hợp với nhóm có cơng thức sản phẩm PAMAM dendrimer G2.5, 3.5, 4.5

Dao động liên kết

υ (cm-1)

G2.5

G2.5-CisPt G3.5

G3.5-CisPt G4.5

G4.5-CisPt -NH- ( bị che

OH)

3294,

3434 3417 3302

3411,

3268 3426 3261

CH2 2952 2952

CH3 2832 2830

C=O (ester) 1734 1736

(C=O)-NH

amide I 1648 1653 1646 1647 1639 1648

(C=O)-NH

amide II 1546 1581 1548 1586

C-H CH3

và đx COO- 1360 1396 1359 1387 1399 1384

83

So với PAMAM G2.5, 3.5, 4.5 phổ FTIR phức tương ứng PAMAM G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin, G4.5-Cisplatin có tín hiệu hấp thu tương tự Tuy nhiên, cường độ tín hiệu hấp thu có thay đổi rõ Do trình tạo phức, phần lớn nhóm ester ngồi PAMAM chuyển thành COO- nên dao động ν

C=O, νC-O nhóm ester có cường độ giảm

xuống Đồng thời, dao dộng hóa trị bất đối xứng, đối xứng nhóm COO

-chồng lên tín hiệu amide I, amide II δC-H nhóm CH3 nên cường độ tín

hiệu hấp thu tăng lên liên quan đến dao động kéo căng N-H Cisplatin [128] Kết cho thấy có hình thành liên kết phối trí ion Pt2+ với nhóm

carboxylate -COO- PAMAM dendrimer

3.2.2 Phổ FTIR phức PAMAM Dendrimer G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin

Phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0 G3.0-Cisplatin; G4.0 G4.0-Cisplatin cho thấy có dịch chuyển peak dao động biến dạng -NH 1643 cm-1 thành 1639 cm-1 (G3.0, G3.0-Cisplatin); 1643 cm-1 thành 1642 cm-1 (G4.0, G4.0-Cisplatin) Điều cho thấy có hình thành phức chất sở liên kết phối trí cation Pt2+ nhóm NH

2 bề mặt PAMAM

dendrimer G3.0 Ngồi ra, phổ FTIR cịn cho thấy suy giảm cường độ dịch chuyển peak dao động kéo căng đối xứng bất đối xứng nhóm -CH2 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM dendrimer G3.0 thành 2944 cm-1

2899 cm-1 phức G3.0-Cisplatin); 2944 cm-1 2839 cm-1 PAMAM

G4.0 thành 2975 cm-1 2884 cm-1 phức G4.0-Cisplatin, peak hấp thu dạng

mũi nhọn 3437 cm-1 (G3.0-Cisplatin) 3427 cm-1 (G4.0-Cisplatin) liên quan

đến dao động kéo căng N-H Cisplatin [133]

Bảng 3.4 Kết phổ FTIR PAMAM dendrimer G3.0, G4.0 phức G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin

Dao động liên kết

υ (cm-1)

G3.0 G3.0-CisPt G4.0 G4.0-CisPt

-NH- 3289 3437 3414 3427

84

CH2 2839 2899 2847 2884

-NH- 1643 1639 1643 1642

85 3.3 Phổ FTIR phức G3.0-PAA với Cisplatin

Bảng 3.5 Phổ FTIR G3.0-PAA phức G3.0-PAA-Cisplatin

G3.0-PAA Phức

G3.0-PAA-Cisplatin

υ (cm-1) υ (cm-1) Dao động liên kết

3434 3435 -NH-, -OH

2946 2947 CH2

1644 1642 NH amide I,

-COO

1571 1565 -NH amide II

1454 1453 -CH2, -CHCO

(PAA)

1409 1406

Hình 3.5 Phổ FTIR G3.0-PAA phức G3.0-PAA-Cisplatin

Phổ FTIR cho thấy dịch chuyển nhẹ peak dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH G3.0-PAA 1644 cm-1 1571

thành 1642 cm-1 1565 cm-1 G3.0-PAA-Cisplatin Các peak có cường độ

thấp dao động kéo dao động uốn -CH2 CH-CO G3.0-PAA

1454 cm-1 1409 cm-1 dịch chuyển tới 1453 cm-1 1406 cm-1

G3.0-PAA-Cisplatin [134], [135] Peak hấp thu mũi nhọn 3435 cm-1 liên quan đến 60 70 80 90 100 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 3435 2946 1642 1565 1406 3434 2947

1644 1571

1409

(b)

(a)

86

dao động kéo căng N-H Cisplatin Kết phổ cho thấy có tương tác cation Pt2+ với nhóm chức bề mặt -COO- G3.0-PAA

3.4 Phổ FTIR phức G4.0-PAA-Cisplatin

Bảng 3.6 Phổ FTIR G4.0-PAA phức G4.0-PAA-Cisplatin

G4.0-PAA Phức

G4.0-PAA-Cisplatin

υ (cm-1) υ (cm-1) Dao động liên kết

3203 3236, 3102 -NH-, -OH

2944 2943 CH2

1635 -NH amide I

1572 1564 -NH amide II

1454 1447 -CH2, -CHCO

(PAA)

1407 1400

Phổ FTIR cho thấy dịch chuyển nhẹ peak dao động kéo căng bất đối xứng -COO chồng lên peak amide -NH G4.0-PAA 1572 cm-1 thành

1564 cm-1 1635 cm-1 G4.0-PAA-Cisplatin Các peak có cường độ thấp

do dao động kéo dao động uốn -CH2 CH-CO G4.0-PAA 1454

cm-1 1407 cm-1 thành 1447 cm-1 1400 cm-1 G4.0-PAA-Cisplatin

[134], [135] Peak 3619 cm-1 liên quan đến dao động nối -O-H nhóm -COOH

3619 3203

1572

1407

1040

G4.0-PAA

3236

2944

2943

1635 1564

1447 1039

G4.0-PAA-CisPt

3102

Hình 3.6 Phổ FTIR G4.0-PAA phức G4.0-PAA-Cisplatin

Trans

mit

ta

87

của G4.0-PAA Kết phổ cho thấy có tương tác cation Pt2+ với nhóm

chức bề mặt -COO- G4.0-PAA

3.5 Kết phổ 1H-NMR PAMAM G3.0 G 3.5 biến tính với PNIPAM

Tiến hành tổng hợp G3.0-PNIPAM với tỉ lệ mol G3.0: PNIPAM là: 1:5; 1:8 1:10

Quan sát phổ 1H-NMR G3-PNIPAM (tỉ lệ mol 1:8) ta thấy peak đặc trưng PAMAM G3.0 cịn có peak đặc trưng PNIPAM-COOH peak nhóm –CH3 (f) vị trí từ 1,1-1,26 ppm với SH = 46.076,

-(CH3)2CHNH- (l) vị trí 3,99 ppm với SH = 7.514 Ngồi diện tích peak

nhóm –CH2CH2CONH (c) tăng từ 2,0 lên 2,68 ppm Cho ta thấy có hình

thành liên kết CO-NH PAMAM G3.0 với nhóm –COOH PNIPAM-COOH Kết cho ta thấy việc tổng hợp chất mang nano nhạy nhiệt dendrimer thành công [1]

Từ phổ 1H-NMR G3-PNIPAM ta tính hiệu suất số nhóm

PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 công thức:

88 %X =

SH(-CH (f)3) SH(-CH

2-)

(a) ∑H(-CH

3)

(f) ∑H(-CH

2-)

(a)

.100%

Trong đó:

%X : Mức độ phản ứng amide hóa

Ta có diện tích peak (a) 1,561 peak (f) 46,076

Tổng số proton nhóm –CH3 (f) có PNIPAM-COOH 366 Theo

lý thuyết PNIPAM-COOH phản ứng hết với 32 nhóm -NH2 PAMAM

G3.0 Vậy tổng số proton nhóm –CH3 theo lý thuyết 11.712

Tổng số proton cuả nhóm –CH2CH2N< 60

Theo cơng thức ta tính x% 15,12 %

Nếu PNIPAM-COOH phản ứng hết với 32 nhóm –NH2 cùa PAMAM G3.0

thì x% đạt 100% Với x% 15,12 % ta tính số nhóm PNIPAM-COOH gắn lên PAMAM G3.0 4,84 nhóm

Theo số liệu phản ứng ban đầu mục tiêu phản ứng gắn nhóm PNIPAM-COOH lên PAMAM G3.0 thành công

Vậy với số nhóm gắn lên 4,84 hiệu suất phản ứng đạt 96,8 %

Tính tốn tương tự dựa phổ 1H-NMR với tỉ lệ mol G3.0:

PNIPAM = 1:5 1:10, ta kết sau: SH(-CH

2-)

(a)

,SH(-CH

3)

(f)

: Diện tích peak peak (a) peak (f) xuất phổ 1H-NMR

∑H(-CH

2-)

(a)

, ∑H(-CH

3)

(f)

89

Bảng 3.7 Số nhóm PNIPAM gắn vào G3.0 ước lượng KLPT

Mẫu Số nhóm PNIPAM

gắn vào G3.0

KLPT tính theo

1H-NMR

(Da)

Nhiệt độ chuyển pha

G3.0-PNIPAM (1:5) 3,34 30.605 37,5 oC

G3.0-PNIPAM (1:8) 4,84 40.776 34 oC

G3.0-PNIPAM (1:10) 7,00 55.880 33 oC

Kết phân tích GPC mẫu G3.0-PNIPAM (1:8) cho thấy KLPT sản phẩm 39.600 gần giống với kết tính tốn dựa phổ 1H-NMR

Kết phổ 1H-NMR của chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM

cho thấy ngồi peak đặc trưng PNIPAM-COOH, cịn xuất thêm peak đặc trưng PAMAM dendrimer hệ G3.5 peak –COOCH3 (h)

(3,73-3,78 ppm); peak –CONHCH2CH2N- (e) (3,26-3,36 ppm); peak –CH2CH2N

(a) (2,57-2,63 ppm) Từ cho thấy có hình thành liên kết nhóm – COOCH3 với nhóm amin bề mặt phân tử G3.0-PNIPAM

90

Kết cho thấy việc tổng hợp nên chất mang nano nhạy nhiệt G3.5-PNIPAM thành công

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR G3.5-PNIPAM

3.6 Kết 1H-NMR PAMAM G3.0 biến tính với PAA

Phổ 1H-NMR G3.0-PAA cho thấy peak đặc trưng PAMAM dendrimer G3.0 như: peak –CH2CH2N (a) (2,63ppm), peak –CONHCH2CH2N- (e)

(3,30 ppm) cịn có peak đặc trưng acid polyacrylic >CHCOOH (b) (2,07 ppm) >CHCH2CH< (c) (1,61 ppm) Như vậy, khẳng định có hình thành liên

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G3.0 biến tính với PAA

91

kết -CO-NH nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 với nhóm

-COOH PAA Kết cho thấy tổng hợp thành công chất mang G3.0-PAA

Từ kết phổ 1H-NMR G3.0-PAA, ta tính số nhóm PAA gắn

vào PAMAM dendrimer G3.0 6,01 nhóm Theo số liệu phản ứng mục tiêu ban đầu phản ứng gắn 12 nhóm PAA lên bề mặt G3.0 hiệu suất phản ứng đạt 50,1% Thực phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G3.0: PAA 1:6 cho kết số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G3.0 nhóm với hiệu suất phản ứng 83,3%

3.7 Kết 1H-NMR PAMAM G4.0 biến tính với PAA

Phổ 1H-NMR G4.0-PAA cho thấy peak đặc trưng PAMAM

dendrimer G4.0 như: peak –CH2CH2N (a) (2,69ppm), peak –CONHCH2CH2N- (e)

(3,31 ppm) cịn có peak đặc trưng acid polyacrylic >CHCOOH (b) (2,08 ppm) >CHCH2CH< (c) (1,62-1,63 ppm) Như vậy, khẳng định có hình thành

liên kết -CO-NH nhóm -NH2 bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 với

nhóm -COOH PAA Kết cho thấy tổng hợp thành công chất mang G4.0-PAA.Từ kết phổ 1H-NMR G3.0-PAA, ta tính số nhóm PAA

gắn vào PAMAM dendrimer G4.0 15,16 nhóm Theo số liệu phản ứng mục tiêu ban đầu phản ứng gắn 16 nhóm PAA lên bề mặt G4.0 hiệu suất phản ứng đạt 94,7% Thực phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA 1:8 cho kết số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 7,28 nhóm với hiệu suất phản ứng 91,0% Ngồi ra, chúng tơi tiến hành thực thêm phản ứng khác với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer G4.0: PAA 1: 24 phản ứng khơng thành cơng (xảy tượng đóng rắn bình phản ứng) Mặt khác, với số nhóm PAA 15 nhóm gắn bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 số nhóm -COOH (tính theo 1H-NMR) 405 nhóm lớn

92

Sau tổng hợp thành công hệ chất mang, tiến hành tổng hợp hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PAA PAMAM dendrimer G4.5-PAA sở phản úng nhóm -NH2 cịn lại hệ chất mang

PAMAM dendrimer G3.0-PAA PAMAM dendrimer G4.0-PAA với methyl acrylate nhằm mục đích làm tăng số nhóm chức -COOH bề mặt, tăng khả tạo phức với Cisplatin Tuy nhiên, phản ứng không thực hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.0-PAA PAMAM dendrimer G4.0-PAA hòa tan tốt nước khơng hịa tan dung mơi hữu

3.8 Kết đo hàm lượng Pt

Hàm lượng Pt mẫu phức chất xác định ICP-MS nội chuẩn Lutetium Phương trình hồi qui tuyến tính hàm lượng Pt [ppb] theo tỉ lệ tín hiệu (CPS) Pt/Lu sau: y = 0.5562x - 0.0031

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR PAMAM dendrimer G 4.0 biến tính với PAA

93

3.8.1 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ chẵn-Cisplatin

PAMAM dendrimer hệ chẵn G3.0 G4.0 cho từ từ vào dung dịch Cisplatin thực phản ứng theo qui trình mục 3.2 3.3 Hàm lượng Pt thể bảng sau:

Bảng 3.8 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ chẵn - Cisplatin (không thủy phân)

TT Tên mẫu %Pt %Cisplatin

1 G3.0-Cisplatin 6,26  0,95 9,63  1,47 G4.0-Cisplatin 11,02  0,84 16,95  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

3.8.2 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM dendrimer hệ lẻ– Cisplatin (không thủy phân)

Bảng 3.9 Hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (không thủy phân)

TT Tên mẫu %Pt %Cisplatin

1 PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin 10,33 ± 0,92 15,89 ± 1,41 PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin 5,14 ± 1,25 7,90 ± 1,92 PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin 3,84 ± 0,45 5,90 ± 0,68

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

Số liệu bảng 3.8 bảng 3.9 cho thấy hàm lượng Cisplatin PAMAM dendrimer G chẵn PAMAM G lẻ phụ thuộc vào hệ PAMAM theo

y = 0.5562x - 0.0031 R² =

0 10 15 20

0 10 15 20 25 30 35

Tí

n hiệu

(CPS) Pt/L

u

Pt [ppb]

94

hai chiều hướng khác Đối với PAMAM dendrimer G lẻ hàm lượng Cisplatin bị giảm hệ dendrimer tăng Mặc dù PAMAM dendrimer G2.5 cho thấy khả mang thuốc tốt so với PAMAM dendrimer G lẻ hệ cao hơn, nghiên cứu trước khả nhả thuốc PAMAM dendrimer hệ thấp không cao độc tính chúng cao mong đợi [136] Kết tương tự báo cáo trước Kirkpatrick cộng [113] Khả mang thuốc thấp PAMAM dendrimer G lẻ hệ cao giải thích cản trở khơng gian nhóm carboxylate bề mặt, nhóm có xu hướng co cụm lại dẫn đến giảm khả mang thuốc Cisplatin Ngược lại với PAMAM dendrimer hệ lẻ, hàm lượng Cisplatin PAMAM dendrimer hệ chẵn G4.0 tăng khoảng 1,7 lần so với PAMAM dendrimer G3.0 Đây tượng phổ biến PAMAM dendrimer chứa nhóm chức amin (-NH2) bề mặt [133]

3.8.3 Kết đo hàm lượng Pt phức PAMAM hệ lẻ– Cisplatin (thủy phân)

Thực trình tổng hợp phức carboxylate PAMAM dendrimer hệ lẻ với Cisplatin (thủy phân) có khơng có sử dụng siêu âm theo qui trình mục 3.4-3.7 với tỉ lệ mol PAMAM dendrimer: Cisplatin = 1: Z x 1,2 (trong đó, Z = số nhóm chức bề mặt PAMAM: 2) Kết đo hàm lượng Pt thu sau:

Bảng 3.10 Hàm lượng Pt phức G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin

TT Tên mẫu %Pt %Cisplatin

95

6 Carboxylate G4.5-Cisplatin (SA) 22,13  1,28 34,03  1,96

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3; SA: có sử dụng siêu âm

Kết cho thấy, hiệu gắn Cisplatin thu cao so với kết nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng [6] với kết hàm lượng Cisplatin phức G2.5-Cisplatin G3,5-Cisplatin 10,33% 2,3% Sự khác biệt lớn giải thích sau: Trong nghiên cứu trước đó, Cisplatin khơng thủy phân cách triệt để không sử dụng AgNO3 Trong luận án này, chúng tơi tiến hành thủy phân

Cisplatin có sử dụng AgNO3 Do phản ứng thủy phân Cisplatin phản ứng thuận

nghịch nên việc sử dụng AgNO3 để kết tủa Cl- giúp cho trình thủy phân

Cisplatin hồn tồn hơn, từ làm tăng hiệu suất phản ứng Bằng cách này, Cisplatin gần thủy phân hoàn toàn thành cation [Pt(NH3)2(H2O)]2+

nên hiệu gắn Cisplatin vào PAMAM dendrimer hệ lẻ tăng lên nhiều Khi hệ PAMAM dendrimer tăng lên số nhóm bề mặt tăng số phân tử Cisplatin gắn vào PAMAM dendrimer tăng lên Tuy nhiên, so với gia tăng nhóm bề mặt hiệu gắn Cisplatin vào PAMAM giảm hệ dendrimer tăng Kirkpatrick [113] cho hệ dendrimer tăng việc chuyển nhóm ngồi PAMAM dendrimer thành nhóm carboxylate khó khăn Hơn nữa, lúc hiệu ứng khơng gian tăng lên làm giảm khả phản ứng Cisplatin với nhóm amine amide bên PAMAM dendrimer, qua làm giảm hiệu gắn Cisplatin [113]

96

âm ứng dụng nhiều phản ứng tổng hợp hữu [137] Chẳng hạn phản ứng ester hóa, phản ứng xà phịng hóa, phản ứng thế, phản ứng cộng hợp, phản ứng alkyl hóa, phản ứng oxy hóa, phản ứng khử, phản ứng Wittig, Grignard 3.8.4 Kết đo hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) có sử dụng siêu âm

PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 biến tính bề mặt với polymer nhạy pH Poly acrylic acid (PAA) với tỉ lệ mol 1:6, 1:12 G3.0 tỉ lệ mol 1:8, 1:16 G4.0 Kết xác định hàm lượng Cisplatin gắn lên PAMAM dendrimer biến tính sau:

Bảng 3.11 Hàm lượng Pt phức G3.0-PAA-Cisplatin (thủy phân) G4.0-PAA-Cisplatin (thủy phân)

TT Tên mẫu %Pt %Cisplatin

1 PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin (1:6)

8,41  1,04 12,93  1,60

2 PAMAM dendrimer G3.0-PAA-Cisplatin (1:12)

9,03  0,91 13,89  1,39

3 PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin (1:8)

13,15  0,93 20,22  1,44

4 PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin (1:16)

26,29  0,84 40,44  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

Hàm lượng Cisplatin tăng tăng tỉ lệ mol polymer nhạy pH Poly acrylic acid (PAA) So sánh hàm lượng Cisplatin G3.0-Cisplatin, G4.0-Cisplatin với G3.0-PAA-G4.0-Cisplatin, G4.0-PAA-G4.0-Cisplatin ta thấy có mặt PAA làm tăng hàm lượng Cisplatin Điều giải thích PAA có nhiều nhóm -COOH nên tăng khả hình thành liên kết phức chất Pt-COO- tăng

khả mang thuốc Cisplatin

97

Bảng 3.12 Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer

TT Hệ chất mang Số nhóm chức

bề mặt

% Cisplatin -NH2 -COOH

1 PAMAM dendrimer G2.5-COOH 32 15,89  1,41 PAMAM dendrimer G3.5-COOH 64 7,90  1,92 PAMAM dendrimer G4.5-COOH 128 5,90  0,68 PAMAM dendrimer G4.0-PAA

(1:16)

49 405 19,06  1,44

5 PAMAM dendrimer G3.0-NH2 32 9,63  1,47

6 PAMAM dendrimer G4.0-NH2 64 16,95  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

Khả mang thuốc Cisplatin (không thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer tóm tắt bảng 3.12 Kết cho thấy hệ chất mang không mang nhiều thuốc Cisplatin so với nghiên cứu trước [114], [117] Tuy nhiên, tiến hành thủy phân cách triệt để Cisplatin AgNO3 để tạo thành dạng [Pt(NH3)2(H2O)n]2+ khả tạo phức Pt2+

Cispaltin với nhóm bề mặt -COOH hệ chất mang PAMAM dendrimer tăng lên làm tăng đáng kể khả mang thuốc Cisplatin hệ chất mang (bảng 3.13) Mặt khác, liên kết Pt2+ nhóm amine bề mặt -NH

2

hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ chẵn (G3.0; G4.0) tương đối bền Cisplatin khó giải phóng khỏi hệ chất mang không tiến hành khảo sát khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) PAMAM dendrimer có nhóm amine -NH2 bề mặt Kết bảng 3.13 cho

98

Bảng 3.13 Khả mang thuốc Cisplatin (thủy phân) hệ chất mang PAMAM dendrimer

TT Hệ chất mang Số nhóm chức bề

mặt

% Cisplatin -NH2 -COOH

1 PAMAM dendrimer G2.5-COOH

0 32 31,82  1,39

2 PAMAM dendrimer G3.5-COOH

0 64 33,01  1,56

3 PAMAM dendrimer G4.5-COOH

0 128 34,03  1,96 4 PAMAM dendrimer G3.0-PAA

(1:6)

27 75 12,93  1,60 5 PAMAM dendrimer G3.0-PAA

(1:12)

26 90 13,89  1,39

6 PAMAM dendrimer G4.0-PAA (1:8)

57 189 20,22  1,44 7 PAMAM dendrimer G4.0-PAA

(1:16)

49 405 40,44  1,29

Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

3.10 Thử nghiệm khả mang đồng thời hai thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM

Hệ chất mang G3.5-PNIPAM tổng hợp từ PAMAM dendrimer G3.0 -PNIAM carboxylate hóa nhóm -COOCH3 ngồi thành nhóm -COO

-có khả tạo phức với Cisplatin Hơn nữa, nhóm PNIPAM nhạy nhiệt bề mặt hệ chất mang thuộc loại polymer nhạy nhiệt có nhiệt độ tới hạn thấp (LCST, 320C) Ở điều kiện nhiệt độ điểm LCST, PNIPAM trương nở cực đại

99

Tiến hành nang hóa 30mg 5-FU vào 100 mg hệ copolymer PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM hệ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin Kết thu sau:

Bảng 3.14 Kết nang hóa 5-FU vào phức G3.5-PNIPAM-Cisplatin 5FU khơng

nang hóa 5-FU nang hóa

mg mg %DL % EE

PAMAM

dendrimer G3.5- PNIPAM-5FU-CisPt

4.32  0.26 25.68  0.26 20.43  0.17 85.61  0.88

PAMAM

dendrimer G3.5-PNIPAM-5FU

3.73  0.29 26.27  0.29 20.81  0.18 87.57  0.97

PNIPAM-CisPt-5FU 11.90  0.27 18.10  0.27 15.32  0.20 60.33  0.91 Kết biểu diễn dạng: trung bình  SD (độ lệch chuẩn), số lần đo n=3

PNIPAM-Cisplatin nang hóa 60,33%, kết phân tích phương sai ANOVA cho thấy lượng 5-FU PAMAM dendrimer PNIPAM-Cisplatin (85,61%) khác biệt không đáng kể so với PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM không liên hợp Cisplatin (87,57%)

Kết phân tích hàm lượng Pt có phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin 22,90 % tương ứng với hàm lượng Cisplatin hệ chất mang 35,22%

100

tác dụng phụ thuốc Do hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU Cisplatin hệ mang thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn

3.11 Kết đo TEM, DLS zeta

Ảnh TEM hình 3.13 cho thấy phức chất PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5-Cisplatin có kích thước tương đối đồng nằm khoảng 5-10 nm

101

Kết TEM cho thấy kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tồn dung dịch 190 nm So với kích thuớc ban đầu PAMAM dendrimer G3.0 (3-4 nm) kích thước hạt PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM tăng lên nhiều làm tăng khả mang thuốc hạt Kích thước hạt hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin dung dịch 184 nm lớn nhiều polymer PNIPAM bao bọc phía bên ngồi hạt PAMAM dendrimer G3.5 Ảnh TEM (hình 3.16) mẫu PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-Cisplatin cho thấy có khả Cisplatin tạo liên kết chéo với hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM

102

Ảnh TEM PAMAM dendrimer G4.0 chứng minh hình thành hạt nano hình cầu đồng với đường kính khoảng 4,0 nm, gần giống với kết đo DLS 7,8 ± 2,4nm Kích thước hệ chất mang nano G4.0-PAA (28 nm) tăng Hình 3.15 Ảnh TEM mẫu Cisplatin DLS mẫu

G3.5-PNIPAM-Cisplatin mẫu PNIPAM-G3.5-PNIPAM-Cisplatin

103

gần 3,6 lần so với PAMAM dendrimer G4.0 Kích thước hạt tăng lên nhiều mang thuốc Cisplatin

Kết đo zeta hệ chất mang G3.0-PAA (tỉ lệ mol 1:12); G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) G4.0-G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:16) cho thấy zeta hệ chất mang phụ thuộc vào giá trị pH dung dịch Trong mơi trường trung tính mơi trường kiềm, nhóm -COOH PAA bị proton chuyển thành COO

-nên giá trị zeta hệ chất mang có giá trị âm Trong môi trường acid pH 5,5, nhóm -COO- PAA bị proton hóa chuyển thành -COOH nên zeta

hệ chất mang có giá trị dương Như vậy, hệ chất mang tiếp xúc với khối u môi trường pH khối u môi trường thuận lợi để proton hóa nhóm -COO- PAA làm cho hệ chất mang điện dương gắn vào

các màng tế bào mang điện âm gây rối loạn ổn định màng tế bào làm tăng khả giết chết tế bào

Các hệ chất mang tương đối ổn định pH trung tính pH 7,4 Hệ G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 với số nhóm G4.0-PAA nhiều (15 nhóm) dễ bị kết tụ pH 5,5 với ζ= 7,3 mV Giá trị zeta hệ chất mang nằm khoảng (-10 đến + 10 mV) cho thấy không ổn định hạt dẫn đến khả hạt bị kết tụ

104

kích thước hạt tăng nên hạt khuếch tán vào hệ thống mạch bạch huyết lại gia tăng việc tích tụ mơi trường khối u Đồng thời với việc tích tụ khối u, pH 5,5 khối u độ bền liên kết phối trí Pt2+ nhóm -COO

-của PAA giảm khả giải phóng thuốc Cisplatin khỏi hệ chất mang tăng lên tăng khả diệt khối u thuốc Trong pH 7,4, G4.0-PAA tỉ lệ mol 1:16 có ζ= -58,6 mV cho thấy hệ chất mang ổn định [138] môi trường plasma nên làm tăng tính tuần hồn thuốc hệ thống mạch máu tăng khả thuốc vận chuyển đến khối u

-13,9 mV -14,6 mV

19,0 mV b)

c) a)

105

a) b)

c)

-23,2 mV -17,2 mV

14,1 mV

Hình 3.19 Thế zeta hệ chất mang G4.0-PAA (tỉ lệ mol 1:8) thay đổi theo pH: a pH 7,4; b pH 7,0 c pH 5,5

a) b)

c)

-58,6 mV -19,2 mV

7,3 mV

106

Điểm đục hệ chất mang G3.0-PAA 1:12, PAA 1:8 G4.0-PAA 1:16 (tỉ lệ mol) điều kiện pH môi trường khác tiến hành khảo sát cách đo độ truyền qua dung dịch máy quang phổ UV-Vis bước sóng 550 nm (các polymer khơng hấp thu bước sóng 550nm) [139] Kết thực nghiệm (Hình 3.21) cho thấy, độ hòa tan hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8 G4.0-PAA 1:16 phụ thuộc pH theo ba vùng pH: vùng pH thấp, vùng kết tủa (vùng trung gian) vùng pH cao Tại vùng trung gian pH 3,5 - 5,5 (hệ G4.0-PAA 1:16), pH 4,0 - 6,0 (hệ G3.0-PAA 1:12, G4.0-PAA 1:8) hệ chất mang bị trung hịa điện tích pH dung dịch  pH đẳng điện gây tượng kết tụ hệ chất mang

3.12 Kết bàn luận khả giải phóng thuốc in vitro

3.12.1 Khả giải phóng thuốc phức PAMAM hệ lẻ - Cisplatin (thủy phân)

Kết giải phóng thuốc Cisplatin phức PAMAM dendrimer G 2.5 – Cisplatin, PAMAM dendrimer G 3.5 – Cisplatin PAMAM dendrimer G 4.5 - Cisplatin pH 7,4 pH 5,5 trình bày bảng 3.15

0 20 40 60 80 100

2 10

Transmitt

an

ce

[%]

pH

G3PAA 1:12 G4PAA 1:16 G4PAA 1:8

107

Bảng 3.15 Kết giải phóng thuốc in vitro của phứcPAMAM dendrimer: G2.5-Cisplatin, G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin

Thời gian (giờ)

G2.5-Cisplatin G3.5-Cisplatin G4.5 - Cisplatin

%Cisplatin %Cisplatin %Cisplatin

pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4

0 0 0 0

6 30,42  1,20

22,78 

0,81

31,72 

1,00

27,17 

0,91

34,96 

1,08

28,23 

0,81 12 37,18 

1,48

28,35 

1,01

39,04 

1,25

35,12 

1,12

45,52 

1,30

33,12 

1,03 24 43,10 

1,70

31,84 

1,14

44,94 

1,41

38,64 

1,16

47,86

1,04

43,48 

1,20 48 45,98 

1,82

34,61 

1,23

47,93 

1,50

41,35 

1,18

53,18 

1,47

48,03 

1,51 60 48,18 

1,90

36,29 

1,29

50,24 

1,62

43,76 

1,28

55,07 

1,51

48,91 

1,54 72 51,05 

2,02

36,54 

1,30

53,24 

1,67

45,69 

1,37

55,49 

1,54

49,19 

1,54 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%

0 12 24 36 48 60 72

% Nhả thu ố c Cisp latin

Thời gian (h)

pH 5.5 (G2.5cis) pH 7.4 (G2.5cis) pH 5.5 (G3.5cis) pH 7.4 (G3.5cis) pH 5.5 (G4.5cis) pH 7.4 (G4.5cis)

Hình 3.22 Khảo sát giải phóng thuốc Cisplatin in vitro hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 môi trường đệm PBS

108

Kết giải phóng thuốc in vitro cho thấy Cisplatin giải phóng khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer hệ lẻ (Hình 3.22) Sau 24 giờ, môi trường đệm ABS pH 5,5 lượng Cisplatin giải phóng đạt 43,10%, 44,94% 47,96% tương ứng với việc tăng dần hệ lẻ chất mang PAMAM dendrimer G2.5, PAMAM dendrimer G3.5 PAMAM dendrimer G4.5

Kết phân tích phương sai ANOVA cho thấy hàm lượng Cisplatin giải phóng khỏi hệ chất mang PAMAM dendrimer phụ thuộc vào thời gian, pH khảo sát hệ dendrimer dùng làm chất mang Trong hệ PAMAM dendrimer, lượng Cisplatin giải phóng pH 5,5 cao pH 7,4 khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Lượng Cisplatin giải phóng tăng dần theo thời gian, sau 60 lượng Cisplatin giải phóng khơng có khác biệt đáng kể mặt thống kê

109

Kết giải phóng thuốc mơi trường acid đệm ABS pH 5,5 cho kết cao mơi trường đệm PBS pH 7,4 Điều giải thích mơi trường acid nhóm carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ bị proton hóa chuyển thành dạng -COOH làm giảm độ bền phức PAMAM dendrimer hệ lẻ - Cisplatin Lượng Cisplatin giải phóng 72 khỏi hệ chất mang PAMAM G2.5, PAMAM G3.5 PAMAM G4.5 51,05%, 53,24% 55,49% Lượng Cisplatin cịn lại khơng phóng thích Theo Kirkpatrick [113], Pellechia [114] Bellis [115] Cisplatin tạo liên kết Pt2+ với nhóm amine bậc 2, bậc PAMAM dendrimer khó giải phóng

ra khỏi hệ chất mang

Lượng Cispatin giải phóng tăng tăng hệ PAMAM dendrimer từ G2.5 đến G4.5 Điều giải thích tăng hệ PAMAM dendrimer số nhóm chức -COO- bề mặt tăng nên số phân tử Cisplatin tham gia phản ứng tạo

phức Liên kết Pt2+ với nhóm -COO- bền liên kết Pt2+ với N amine

nên phân tử Cisplatin dễ phóng thích khỏi hệ chất mang

3.12.2 Khả giải phóng thuốc 5-FU Cisplatin hệ chất mang hai thuốc G3.5-PNIPAM-Cispaltin – 5FU

Kết khảo sát (Bảng 3.16) cho thấy, lượng thuốc 5-FU giải phóng từ chất mang polymer PNIPAM-Cisplatin không phụ thuộc vào pH môi trường Lượng thuốc giải phóng tăng dần theo thời gian lên đến 32,23% sau 72 môi trường plasma nhân tạo pH 7,4 Tuy nhiên, có khác biệt rõ rệt pH 5,5 (môi trường nội bào khối u) lượng thuốc %-FU giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt chiếm ưu với 39,60 % lượng thuốc giải phóng 24 so với 17,27% từ hệ PNIPAM-CisPt đạt giá trị 47,87% sau 72 Lượng thuốc mang vào giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, ổn định hai môi trường pH 7,4 pH 5,5 Tính chất thúc đẩy tiềm ổn định tính vận chuyển thuốc thể

110

Cisplatin hệ chất mang nhiên không phát tín hiệu Pt phương pháp ICP-MS Kết cho thấy Cisplatin bị giữ chặt hệ mang thuốc cisplatin thủy phân tạo liên kết với nhóm amine bậc 2, bậc dendrimer PNIPAM Kết tương tự nghiên cứu trước Kirkpatrick [113], Pellechia [114] Bellis [115]

Bảng 3.16 Khảo sát khả giải phóng thuốc 5FU hệ chất mang G3.5-PNIPAM-CisPt G3.5-PNIPAM-CisPt

Thời gian (giờ)

% 5-FU giải phóng

G3.5-PNIPAM-CisPt PNIPAM-CisPt pH 5,5 pH 7,4 pH 5,5 pH 7,4

0 0 0

1 14,40  1,19 8,29  1,02 5,47  0,95 5,84  1,01 33,29  1,09 18,33  1,01 11,67  1,11 9,86  1,39 33,77  1,02 21,31  1,41 12,92  1,01 10,18  0,99 24 39,60  1,01 26,50  1,14 17,27  1,12 17,19  1,04 48 43,89  1,00 31,98  0,99 24,19  1,02 24,31  0,92 72 47,87  1,06 37,38  1,10 34,53  1,19 32,23  1,04

0 10 20 30 40 50 60

0 10 20 30 40 50 60 70 80

%

-FU

giả

i

p

hó

ng

Thời gian (h)

G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU pH = 5,5 G3.5-PNIPAM-CisPt-5FU pH = 7,4

111

Hình 3.24 Biểu đồ giải phóng thuốc 5-Flourouracil (5-FU) mơi trường pH 7,4 pH 5,5 nhiệt độ 37oC

3.12.3 Khả giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA

Bảng 3.17 Kết giải phóng thuốc Cisplatin hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA

Thời gian (giờ) % Cisplatin giải phóng

pH 5,5 pH 7,4

0 0

4 25,17  1,08 11,42  0,75

12 34,42  1,51 21,40  0,62 24 40,97  0,92 28,75  0,84 32 44,96  0,88 33,02  0,90 48 52,02  0,94 42,72  1,29 55 56,51  0,84 45,46  1,38 72 59,13  2,10 48,32  1,48

0 10 20 30 40 50 60

0 10 20 30 40 50 60 70 80

%Cispla

tin

giải

phóng

Thời gian (giờ)

112

Hình 3.25 Biểu đồ giải phóng thuốc Cisplatin mơi trường pH 7,4 pH 5,5 Biểu đồ giải phóng thuốc hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA nhìn chung tương đồng với hệ chất mang khác có nhóm chức bề mặt carboxylate Tuy nhiên, q trình giải phóng thuốc đệm PBS pH 7,4 PAMAM dendrimer G4.0-PAA có khác biệt Sự diện ion clorua hệ đệm PBS dẫn đến tạo phức ion clorua với Cisplatin chất mang làm tăng việc giải phóng Cisplatin sau 24 Lượng Cisplatin giải phóng từ PAMAM dendrimer G4.0-PAA tăng dần từ 11,42 % lên 33,02 % 32 môi trường đệm PBS pH 7,4 So sánh với biểu đồ nhả thuốc hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5, lượng Cisplatin giải phóng từ PAMAM dendrimer G4.5 tăng nhanh khoảng thời gian 24 (đạt 43,48%) Cisplatin tích lũy đệm PBS pH 7,4 (49,19 %) gần tương tự đệm ABS pH 5,5 lúc 72h Trong đó, Cisplatin giải phóng từ hệ PAMAM dendrimer G4.0-PAA 28,75% (trong 24h) thấp gần lần so với hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.5 Qua cho thấy khác biệt cấu trúc nhóm chức bề mặt gây xu hướng nhả thuốc khác PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA Mặc dù PAMAM dendrimer G4.0-PAA có nhóm amine -NH2 bề

mặt làm giảm khả giải phóng thuốc Cisplatin độ bền liên kết Pt2+-NH

2, kết thực nghiệm cho thấy phân tử Cisplatin giải

phóng từ hệ chất mang PAMAM dendrimer G4.0-PAA hai môi trường đệm pH kể Điều giải thích số lượng nhóm bề mặt carboxylate vượt trội so với nhóm amin G4.0-PAA giúp giảm xác suất hình thành liên kết Pt2+-NH

2

3.13 Động học q trình giải phóng thuốc Cisplatin

113

Mơ hình động học phù hợp với giải phóng thuốc đánh giá qua tiêu chuẩn AIC (tiêu chuẩn thông tin Akaike) R2

hc (R2 hiệu chỉnh) tính

tốn phần mềm R [140] Kết đánh giá động học giải phóng thuốc Cisplatin từ hệ chất mang trình bày bảng 3.18

Bảng 3.18 Giá trị AIC R2

hc theo mơ hình động học hệ mang

thuốc Cisplatin pH 5,5 pH 7,4 G2.5-CisPt G3.5-CisPt G4.5-CisPt G4.0- PAA-CisPt pH 5,5

Bậc R

2

hc 0,527 0,523 0,465 0,759

AIC 58,397 59,032 60,893 62,509

Bậc R

2

hc 0,638 0,641 0,585 0,875

AIC -15,041 -14,256 -11,745 -22,971 Higuchi R

2

hc 0,804 0,801 0,756 0,95

AIC 52,236 52,915 55,397 49,911 Korsmeyer

-Peppas

R2

hc 0,964 0,961 0,9056 0,992

AIC -29,183 -28,682 -24,469 -38,636 Hixson

Crowell

R2

hc 0,601 0,602 0,544 0,840

AIC 1,827 2,561 4,835 -3,071

pH 7,4

Bậc R

2

hc 0,493 0,506 0,577 0,892

AIC 54,611 57,251 57,843 54,069

Bậc R

2

hc 0,562 0,5986 0,675 0,943

AIC -19,490 -16,389 -15,440 -32,894 Higuchi R

2

hc 0,781 0,787 0,846 0,994

AIC 48,749 51,354 50,776 30,847 Korsmeyer

-Peppas

R2

hc 0,953 0,929 0,948 0,994

AIC -28,110 -25,232 -24,412 -32,765 Hixson

Crowell

R2

hc 0,539 0,5674 0,643 0,928

114 y = 0.2995x + 1.2135

R² = 0.9933

y = 0.5127x + 0.7544 R² = 0.9947

1 1.2 1.4 1.6 1.8

0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8

lo g(% Cis plat in giải p hó ng) log(Thời gian) G4.0-PAA-CisPt pH =5,5 G4.0-PAA-CisPt pH =7,4

y = 0.1709x + 1.4384 R² = 0.9245

y = 0.2349x + 1.2778 R² = 0.9581

1.4 1.45 1.5 1.55 1.6 1.65 1.7 1.75 1.8

0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9

lo g(%Cisp latin giải ph ó ng) log(thời gian) G4.5-CisPt pH =5,5 G4.5-CisPt pH = 7,4

y = 0.1909x + 1.37 R² = 0.9686

y = 0.1868x + 1.3143 R² = 0.9432

1.4 1.45 1.5 1.55 1.6 1.65 1.7 1.75

0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9

lo g(%Cisp latin giải ph ó ng) log(thời gian) G3.5-CisPt pH =5,5 G3.5-CisPt pH = 7,4

y = 0.1921x + 1.3497 R² = 0.9714

y = 0.1817x + 1.2367 R² = 0.9621

1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55 1.6 1.65 1.7 1.75

0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9

lo g(%Cisp latin giải ph ó ng) log(thời gian) G2.5CisPt pH =5,5 G2.5CisPt pH = 7,4

115

Kết bảng 3.18 hình 3.26 cho thấy mơ hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas cho giá trị R2

hc lớn AIC nhỏ tất hệ

mang thuốc giá trị pH 5,5 pH 7,4 Vì vậy, mơ hình giải phóng thuốc Korsmeyer-Peppas phù hợp để giải thích chế giải phóng thuốc hệ chất mang Đây mơ hình đặc trưng cho q trình giải phóng thuốc từ hệ chất mang polymer [131]

3.14 Dự đốn mơ hình dược động học hệ mang thuốc

Hình 3.27 biễu diễn biến thiên nồng độ thuốc (dự đoán) máu theo thời gian, biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc đưa vào tuần hoàn

0 10 12 14 16 18 20

0 50 100 150 200

Cis plat in tro ng plas ma (ng/ mL)

Thời gian (giờ)

G2.5CisPt pH = 5,5 G3.5CisPt pH = 5,5 G4.5CisPt pH = 5,5

0 10 12 14 16 18

0 50 100 150 200

Cis plat in tro ng plas ma (ng/ mL)

Thời gian (giờ)

G2.5CisPt pH =7,4 G3.5CisPt pH =7,4 G4.5CisPt pH =7,4

0 10 12 14 16

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Nồ ng độ Cis plat in tro ng plas ma (ng/ mL)

thời gian (giờ)

G4.0-PAA-CisPt pH = 5,5

G4.0-PAA-CisPt pH = 7,4

116

dạng cịn hoạt tính sau thời gian t Đường cong xây dựng dựa số liệu khảo sát q trình giải phóng thuốc Cisplatin từ hệ chất mang Vùng đường cong nồng độ thuốc huyết tương (AUC) phản ánh mức độ phơi nhiễm thực tế thể với thuốc sau dùng liều thuốc biểu thị mg.giờ/L Giá trị AUC phụ thuộc vào tốc độ đào thải thuốc khỏi thể liều dùng Kết tính tốn giá trị AUC hệ mang thuốc Cisplatin khác trình bày bảng 3.19 Tại pH 5,5 hệ chất mang giải phóng thuốc Cisplatin nhiều pH 7,4 nên giá trị AUC pH 5,5 cao giá trị AUC pH 7,4 Nồng độ thuốc cực đại (Cmax) máu PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin pH 5,5 pH 7,4 15,92 13,75 ng/mL sau khoảng thời gian 48-55 Nồng độ Cispaltin giải phóng từ hệ chất mang PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin PAMAM dendrimer G4.5-Cispaltin đạt giá trị cực đại sau 12-24h Các kết cho thấy hệ chất mang có khả giải phóng thuốc chậm dó làm tăng hiệu lực thuốc, giảm độ độc thuốc làm giảm tác dụng phụ thuốc

Bảng 3.19 Các thông số dược động học hệ mang thuốc Cisplatin Cmax (ng/mL) AUC

(g.giờ/mL)

Tmax (giờ)

G4.0-PAA-CisPt

pH 5,5 15,92 1,79 48-55

pH 7,4 13,75 1,47 48-55

G4.5-CisPt pH 5,5 19,19 1,73 12

pH 7,4 16,46 1,55 24

G3.5-CisPt pH 5,5 16,51 1,65 12-24

pH 7,4 14,80 1,42 12

G2.5-CisPt pH 5,5 15,86 1,59 12-24

117

3.15 Kết bàn luận khả gây độc tế bào

3.15.1 Kết bàn luận khả gây độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của hệ chất mang PAMAM G4.5

Độc tính tế bào carboxylate PAMAM dendrimer G4.5, Cisplatin phức PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin xác định dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 người Kết nghiên cứu in vitro (Bảng 3.20) PAMAM carboxylate hóa tương thích tế bào, Cisplatin tự có độc tính cao giá trị IC50 1,00 ± 0,11 μg /mL ức chế 50% tăng trưởng tế

bào Tuy nhiên, gắn vào hệ chất mang PAMAM dendrimer carboxylated, độc tính tế bào Cisplatin giảm lần, giá trị IC50 3,23 ± 0,06 μg/mL Mặc

dù hàm lượng Cisplatin PAMAM dendrimer carboxylated G4.5 thấp trì hoạt động kháng tăng sinh đáng kể tế bào ung thư NCI-H460

Bảng 3.20 Độc tính tế bào in vitro của Carboxylate PAMAM dendrimer G4.5, Cisplatin phức chất PAMAM G4.5-Cisplatin

Mẫu Nồng độ

(g/mL)

Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460) Carboxylated PAMAM

dendrimer G4.5 100 112,25  0,87% phát triển tế bào Cisplatin 1,00 ± 0,11 Ức chế 50% phát triển tế bào PAMAM G4.5-Cisplatin

(34,01 % Cisplatin) 3,23  0,06 Ức chế 50% phát triển tế bào 3.15.2 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang G4.0-PAA

118

Bảng 3.21 Độc tính tế bào in vitro của PAMAM G4.0-PAA, Cisplatin phức chất PAMAM G4.0-PAA-Cisplatin

Mẫu Nồng độ

(g/mL)

Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460) PAMAM G4.0-PAA 100 115,40  3,57% phát triển tế bào Cisplatin 0,98 ± 0,09 Ức chế 50% phát triển tế bào Phức G4.0-PAA-Cisplatin

(40,44 % Cisplatin) 2,88  0,08 Ức chế 50% phát triển tế bào Ngoài ra, độc tế bào G4.0-PAA kiểm tra so sánh với PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.5 Độc tế bào chất mang đánh giá dòng tế bào MCF-7 cách sử dụng xét nghiệm SRB

Như kết thể hình 3.28, khả gây độc tế bào PAMAM dendrimer G4.0 cao đáng kể so với PAMAM dendrimer G4.5 Điều giải thích PAMAM dendrimer G4.0 với nhóm amine (-NH2) bề

mặt có độ gây độc tế bào cao PAMAM dendrimer G4.5 với nhóm carboxylate (-COO-) bề mặt Nhìn chung, PAMAM dendrimer G4.5 khơng gây độc đối

với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 khoảng nồng độ 30-150 ppm Ngược lại, tỷ lệ ức chế phát triển tế bào MCF-7 tăng tuyến tính với gia tăng nồng độ PAMAM dendrimer G4.0 Ở nồng độ 90 g/mL, 51,22 ± 1,6% tế bào sống sót Ở nồng độ cao 100 g/mL, phần trăm tế bào MCF-7 sống sót giảm 31,97 ± 0,8%, thấp lần so với G4.5 nồng độ Độc tế bào hệ PAMAM G4.0-PAA gần giống với PAMAM dendrimer G4.5 khoảng nồng độ 90-150ppm Đáng ý, nồng độ chất mang làm giảm 50% tăng trưởng tế bào (IC50) cao giá trị 100 mg/mL PAMAM dendrimer G4.5

119

tế bào màu đỏ khơng có giếng nuôi cấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA, PAMAM dendrimer G4.5 nồng độ thử nghiệm (100 g/mL) Kết thử

120

nghiệm cho thấy nhóm amine -NH2 cịn lại hệ chất mang PAMAM

dendrimer G4.0-PAA không gây độc tế bào MCF-7 Tính cho thấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA có ưu điểm vượt trội so với PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.5 sử dụng làm chất mang thuốc/thuốc điều trị ung thư [141], [142]

Tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào nguyên bào sợi cho số hệ chất mang nồng độ 100ppm để đánh giá mức độ tương hợp sinh học PAMAM dendrimer G4.0-PAA dùng làm hệ mang thuốc Trong đầu tiên, tất hệ chất mang dường không gây độc nguyên bào sợi (Hình 3.29) Tuy nhiên, sau 48 ni cấy mơi trường có chứa chất

mang, PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA nồng độ 100

ppm cho kết tương tự thử nghiệm dòng tế bào MCF-7 Dendrimer cation (PAMAM dendrimer G4.0) thể độc tính dendrimer anion (PAMAM dendrimer G4.5 G4.0-PAA không gây độc nguyên bào sợi Khi có mặt PAMAM dendrimer G4.0, tỉ lệ sống (%) nguyên bào sợi giảm mạnh 9,32 ± 1,07% tỷ lệ chết 100% ghi nhận vào thời điểm 168

Hình 3.29 Tỷ lệ sống sót nguyên bào sợi người xử lý với hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0, PAMAM dendrimer G4.5, PAMAM dendrimer G4.0-PAA, Camptothecin (kiểm soát dương tính) PBS 1X (kiểm sốt âm tính)

121

giờ Ngược lại, nguyên bào sợi nuôi cấy môi trường chứa G4.0-PAA PAMAM dendrimer G4.5 trì tỉ lệ sống 100%

Quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) hoại tử (necrosis) sau xử lý với hệ mang thuốc khảo sát dựa phương pháp nhuộm kép AO/EB Hình ảnh quan sát kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang (hình 3.30)

Hình 3.30 Hình ảnh huỳnh quang thu từ kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang - nguyên bào sợi nhuộm acridine cam (AO) ethidium

122

các nhân màu vàng-xanh đỏ cam cho thấy PAMAM dendrimer G4.0 gây chết lượng lớn tế bào theo chương trình (apoptosis) Mức độ apoptosis PAMAM dendrimer G4.0 gây tương tự so với kiểm sốt dương tính Các ngun bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.0 có dạng hình cọc sợi ngắn hơn, mật độ thấp độ bám dính thấp so với tế bào ủ với kiểm sốt âm tính Hơn nữa, kết nối nguyên bào sợi biến có mặt PAMAM dendrimer cation G4.0 môi trường nuôi cấy Mặt khác, nguyên bào sợi xử lý với PAMAM dendrimer G4.5 PAMAM dendrimer G4.0-PAA có hình thái đồng hiển thị huỳnh quang màu xanh tương tự kiểm sốt âm tính Những tế bào có hình dạng cọc sợi dài ổn định Các nguyên bào sợi cho thấy độ bám dính tốt kết nối tốt Như vậy, PAMAM dendrimer cation G4.0 gây hại cho tế bào MCF7 nguyên bào sợi Việc biến tính PAMAM dendrimer G4.0 với PAA làm giảm đáng kể độc tính PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.0-PAA không gây apoptosis tế bào MCF-7 ác tế bào thường Đặc điểm cho thấy PAMAM dendrimer G4.0-PAA có ưu điểm vượt trội so với PAMAM dendrimer G4.0 PAMAM dendrimer G4.5 ứng dụng làm chất mang thuốc điều trị ung thư

3.15.3 Kết bàn luận khả gây độc tế bào hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang hai thuốc cispaltin 5-FU

Kết kiểm tra lượng thuốc 5-FU tự do, 5-FU nang hóa PAMAM dendrimer dẫn xuất ảnh hưởng đến phát triển tế bào phương pháp SRB dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Kết cho thấy, PAMAM dendrimer G3.5 dẫn xuất khơng gây độc cho tế bào kiện sàng lọc môi trường thí nghiệm nồng độ, thuốc 5-FU nang hóa gel hệ nano cho thấy ức chế cao khả tăng sinh tế bào ung thư 5-FU tự có khả tiêu diệt tế bào ung thư gây độc mạnh cho tế bào thường

Bảng 3.22 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 mẫu

Mẫu Nồng độ

thử

Tỉ lệ (%) gây độc tế bào

123

G3.5-NIPAM-5FU 100 µg/mL 68,17 69,57 68,41 68,72 ± 0,75 G3.5-NIPAM-CisPt-5FU 100 µg/mL 78,78 79,57 76,59 78,32 ± 1,55 Tỷ lệ gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 Cisplatin, phức xác định nồng độ sàng lọc (100 µg/mL) Kết khảo sát cho thấy PAMAM dendrimer G3.5 PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM hồn tồn khơng gây độc với tế bào ung thư Dù vậy, sau nang hóa thuốc, cacboxylate PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-5-FU có khả gây độc cho tế bào cao, khoảng 68,17% Không thế, việc mang đồng thời hai thuốc phức PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU giúp cho hoạt lực ức chế tế bào tăng mạnh (78,78%) lượng Cisplatin hệ chất mang cao (35,22%) Điều chứng tỏ phức chất PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU có hoạt tính chống ung thư hiệu

Mặt khác, IC50 tiến hành cho hệ phức PAMAM dendrimer

G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU 5-FU tự để xác định xác độc tính thuốc Kết cho thấy, giá trị IC50 cacboxylate PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-cisPt-5FU (1,625 ± 0,419 µg/mL) không thấp đáng kể so với 5-FU tự (2,6 ± 0,31 µg/mL) dẫn xuất PAMAM G3.5 mang đồng thời hai thuốc Cisplatin 5-FU Do đó, hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM mang đồng thời hai thuốc áp dụng hiệu với loại thuốc kháng ung thư khác

Bảng 3.23 Độc tính tế bào in vitro của PAMAM dendrimer G3.PNIPAM, 5-FU PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM-CisPt-55-FU

Mẫu Nồng độ

(g/mL)

Hoạt động tăng sinh (dòng tế bào NCI-H460) PAMAM dendrimer G3.5 100 110,22 0,85% phát triển tế bào PAMAM G3.5-PNIPAM 100 115,22  0,98% phát triển tế bào

5-FU 2,6 ± 0,31 Ức chế 50% phát triển tế bào

124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Từ kết nghiên cứu hoàn thành nội dung luận án, rút kết luận sau:

(1) Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM từ hệ G-0.5 đến hệ G4.5 Sản phẩm PAMAM dendrimer hệ từ G-0.5 đến G4.5 xác định cấu trúc phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR tính tốn khối lượng phân

tử sở liệu phổ 1H-NMR

(2) Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin (9,63% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.0-Cisplatin (16,95% Cisplatin)

(3) Đã tổng hợp thành công phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (28,99% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (30,23% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (31,11% Cisplatin) Kết phân tích hàm lượng Pt ICP-MS cho thấy, phương pháp tổng hợp có hỗ trợ siêu âm hàm lượng Cisplatin phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin (31,82% Cisplatin), PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin (33,01% Cisplatin) PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin (34,03% Cisplatin) cao so với phương pháp tổng hợp không sử dụng siêu âm Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin AgNO3 trước thực phản ứng tạo phức với nhóm

carboxylate bề mặt PAMAM dendrimer hệ lẻ làm tăng đáng kể hàm lượng Pt sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin Sản phẩm dạng bột màu vàng nhạt

(4) Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N-isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với tỉ lệ mol khác tổng hợp thành công hệ chất mang G3.5-PNIPAM Tính tốn số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 tính KPLPT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR

125

(5) Đã biến tính thành cơng PAMAM dendrimer G3.0 G4.0 với acid poly acrylic (PAA) với tỉ lệ mol khác Tính tốn số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer tính KPLT sản phẩm dựa phổ 1H-NMR Hệ chất

mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 15 nhóm thể khả mang thuốc Cisplatin tốt (40,44% Cisplatin) Phức G4.0-PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự (có IC50 cao gấp lần

Cisplatin tự do) thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 thể hoạt tính ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư thể khả nhả thuốc tốt môi trường acid pH 5,5

(6) Kết chụp TEM đo DLS cho thấy hệ chất mang tổng hợp có kích nano phân bố đồng dung dịch

(7) Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5, G3,5, G4.5, G3.5-PNIPAM G4PAA cho thấy khả nhả thuốc chậm ổn định điều kiện in vitro

126 KIẾN NGHỊ

Khảo sát hoạt tính hệ Carboxylate PAMAM G3.5-PNIPAM, G4.0-PAA mang thuốc chống ung thư Cisplatin thể chuột mang khối u ung thư phổi Khảo sát khả gây độc chúng số dòng tế bào ung thư khác in vitro lẫn in vivo, đặc biệt dòng tế bào ung thư kháng Cisplatin

Khảo sát in vivo dược động học hệ mang thuốc PAMAM dendrimer G4.0-PAA-Cisplatin

Khảo sát khả mang đồng thời thuốc chống ung thư chứa Platin 5-FU hệ chất mang PAMAM dendrimer G3.0-PNIPAM, PAMAM dendrimer G3.5-PNIPAM, PAMAM dendrimer G4.0-PNIPAM PAMAM dendrimer G4.5-PNIPAM

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH

1 Ngoc Hoa Nguyen, Le Hang Dang, Dang Nam Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Polyacrylic-conjugated polyamidoamine G4.0 dendrimer as a potetial nanocarrier for effectively delivery of Cisplatin, Bulletin of materials science (chấp nhận đăng: Nov 2020)

2 Phung Ngan Le, Ngoc Hoa Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Smart dendrimer-based nanogel for enhancing 5-fluorouracil loading efficiency against MCF7 cancer cell growth, Bulletin of Materials Science 39(6):1493-1500, 2016

3 Hoang Nguyen, Ngoc Hoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen, Improved loading method for Cisplatin in dendrimer carriers and behavior of the complex nanoparticles against NCI-H460 lung cancer cell, Int J Nanotechnology, Vol 15, N0 6, june 2015, pp 4106-4110 (5), 2015

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] D A Tomalia et al., “A new class of polymers: Starburst-dendritic macromolecules.,” Polymer Journal, vol 17, no pp 117–132, 1985 [2] D A Tomalia, A M Naylor, and W A Goddard, “Starburst Dendrimers:

Molecular-Level Control of Size, Shape, Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matteritle,” Angew Chemie Int Ed., vol 29, no 2, pp 138–175, 1990

[3] P Kesharwani, K Jain, and N K Jain, “Dendrimer as nanocarrier for drug delivery,” Prog Polym Sci., vol 39, no 2, pp 268–307, 2014

[4] J R Silva, F P M Chorilli, and M Chorilli, “Dendrimers as potential platform in nanotechnology-based drug delivery systems,” IOSR J Pharm., vol 2, no 5, pp 23–30, 2013

[5] Z H Siddik, “Cisplatin: Mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance,” Oncogene, vol 22, no 47 REV ISS 6, pp 7265–7279, 2003 [6] N Cửu Khoa, Dendrimer tổng hợp ứng dụng Hà Nội: NXB Khoa học tự

nhiên công nghệ, 2015

[7] Y Haiyang, T Zhaohui, S Wantong, D Mingxiao, and C Xuesi, “Current Status and Future Prospects of Polymeric Nanocarrier for Tumor Targeting,”

Chem J Chinese Univ., vol 35, pp 903–916, 2014

[8] M J O, B B S, Q Nicoletta, E Michael, F Mauro, and T Ennio, “Multifunctional to multistage delivery systems : The evolution of nanoparticles for biomedical applications,” Chinese Sci Bull., vol 57, no 31, pp 3961–3971, 2012

[9] P Kesharwani, M C I M Amin, N Giri, A Jain, and V Gajbhiye, “Dendrimers in Targeting and Delivery of Drugs,” in Nanotechnology-Based Approaches for Targeting and Delivery of Drugs and Genes, Elsevier Inc., 2017, pp 363–388

[10] K Jain, P Kesharwani, U Gupta, and N K Jain, “Dendrimer toxicity: Let’s meet the challenge,” Int J Pharm., vol 394, no 1–2, pp 122–142, 2010 [11] C J Hawker and J M J Fréchet, “Preparation of Polymers with Controlled

Molecular Architecture A New Convergent Approach to Dendritic Macromolecules,” J Am Chem Soc., vol 112, no 21, pp 7638–7647, 1990

[12] A S Chauhan, “Dendrimers for Drug Delivery,” Molecules, vol 23, no 4, 2018

[13] C C Lee, J A MacKay, J M J Fréchet, and F C Szoka, “Designing dendrimers for biological applications,” Nat Biotechnol., vol 23, no 12, pp 1517–1526, 2005

[14] J H Kim, W S Shin, B.-K Kim, J W Lee, S.-H Jin, and J H Kim, “Convergent synthesis of PAMAM dendrimers using click chemistry of azide-functionalized PAMAM dendrons,” Tetrahedron, vol 62, no 39, pp 9193–9200, 2006

[15] V Biricova and A Laznickova, “Dendrimers: Analytical characterization and applications,” Bioorg Chem., vol 37, no 6, pp 185–192, 2009

dendrimers,” Adv Drug Deliv Rev., vol 57, no 15, pp 2130–2146, 2005 [17] R B Kolhatkar, K M Kitchens, P W Swaan, and H Ghandehari, “Surface

acetylation of polyamidoamine (PAMAM) dendrimers decreases cytotoxicity while maintaining membrane permeability,” Bioconjug Chem., vol 18, no 6, pp 2054–2060, 2007

[18] N T B Trâm, “Luận án tiến sĩ: ‘Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (pamam) biến tính có khả hướng đích đến tế bào ung thư,’” Graduate University of Science and Technology, 2016

[19] T B T Nguyen, T T C Nguyen, H C Tran, C K Nguyen, and N Q Tran, “1H NMR Spectroscopy as an Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and Their Derivatives,”

Int J Polym Anal Charact., vol 20, no 1, pp 57–68, 2015

[20] S K Parajapati, S D Maurya, M K Das, V K Tilak, K K Verma, and R C Dhakar, “Potential Application of Dendrimers in Drug Delivery: a Concise Review and Update,” J Drug Deliv Ther., vol 6, no 2, pp 71–88, 2016

[21] D Tyssen et al., “Structure activity relationship of dendrimer microbicides with dual action antiviral activity,” PLoS One, vol 5, no 8, 2010

[22] B Wang et al., “Inhibition of bacterial growth and intramniotic infection in a guinea pig model of chorioamnionitis using PAMAM dendrimers,” Int J Pharm., vol 395, no 1–2, pp 298–308, 2010

[23] T Barata, I Teo, S Lalwani, E Simanek, M Zloh, and S Shaunak, “Computational design principles for bioactive dendrimer based constructs as antagonists of the TLR4-MD-2-LPS complex,” Biomaterials, vol 32, no 33, pp 8702–8711, 2011

[24] U Gupta, H B Agashe, and N K Jain, “Polypropylene imine dendrimer mediated solubility enhancement: Effect of pH and functional groups of hydrophobes,” J Pharm Pharm Sci., vol 10, no 3, pp 358–367, 2007 [25] B Devarakonda, N Li, and M M de Villiers, “Effect of polyamidoamine

(PAMAM) dendrimers on the in vitro release of water-insoluble nifedipine from aqueous gels,” AAPS PharmSciTech, vol 6, no 3, pp E504–E512, 2006

[26] N K Jain and U Gupta, “Application of dendrimer–drug complexation in the enhancement of drug solubility and bioavailability,” Expert Opin Drug Metab Toxicol., vol 4, no 8, pp 1035–1052, 2008

[27] S Choudhary, L Gupta, S Rani, K Dave, and U Gupta, “Impact of dendrimers on solubility of hydrophobic drug molecules,” Frontiers in Pharmacology, vol 8, no MAY 2017

[28] F E Koỗ and M enel, Solubility enhancement of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) using polypolypropylene oxide core PAMAM dendrimers,” Int J Pharm., vol 451, no 1–2, pp 18–22, 2013 [29] N Dib et al., “Formation of dendrimer-guest complexes as a strategy to

increase the solubility of a phenazine N, N′-dioxide derivative with antitumor activity,” Heliyon, vol 5, no 4, 2019

bioavailability of indomethacin,” J Control Release, vol 90, no 3, pp 335–343, 2003

[31] C YIYUN et al., “Transdermal Delivery of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs Mediated by Polyamidoamine (PAMAM) Dendrimers,” J Pharm Sci., vol 96, no 3, pp 595–602, 2007

[32] R Jevprasesphant, J Penny, D Attwood, N B McKeown, and A D’Emanuele, “Engineering of Dendrimer Surfaces to Enhance Transepithelial Transport and Reduce Cytotoxicity,” Pharm Res., vol 20, no 10, pp 1543–1550, 2003

[33] J F Kukowska-Latallo, K A Candido, and Z Cao, “Nanoparticle targeting of anticancer drug improves therapeutic response in animal model of human epithelial cancer.,” Cancer Res., vol 65, no 12, pp 5317–5324, 2005 [34] N K Jain, V Gajbhiye, N Ganesh, and J Barve, “Synthesis,

characterization and targeting potential of zidovudine loaded sialic acid conjugated-mannosylated poly(propyleneimine) dendrimers,” Eur J Pharm Sci., vol 48, no 4–5, pp 668–679, 2013

[35] S Dasari and P Bernard Tchounwou, “Cisplatin in cancer therapy: Molecular mechanisms of action,” Eur J Pharmacol., vol 740, pp 364– 378, 2014

[36] S Schmitt et al., “Novel Metals and Metal Complexes as Platforms for Cancer Therapy,” Curr Pharm Des., vol 16, no 16, pp 1813–1825, 2010 [37] L Kelland, “The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy,” Nat

Rev Cancer, vol 7, no 8, pp 573–584, 2007

[38] S Ishida, J Lee, D J Thiele, and I Herskowitz, “Ishida et al - 2002 - Uptake of the anticancer drug cisplatin mediated by the copper transporter Ctr1 in yeast and mammals.pdf,” vol 99, no 22, 2002

[39] S A Aldossary, “Review on pharmacology of cisplatin: Clinical use, toxicity and mechanism of resistance of cisplatin,” Biomed Pharmacol J., vol 12, no 1, pp 7–15, 2019

[40] L Amable, “Cisplatin resistance and opportunities for precision medicine,”

Pharmacol Res., vol 106, pp 27–36, 2016

[41] B P J Hesketh et al., “The Oral Neurokinin-1 Antagonist Aprepitant for the Prevention of Chemotherapy-Induced Nausea and Vomiting : A Trial in Patients Receiving High-Dose Cisplatin — The Aprepitant Protocol 052 Study Group,” Society, vol 21, no 22, pp 4112–4119, 2003

[42] T L Cornelison and E Reed, “Nephrotoxicity and hydration management for cisplatin, carboplatin, and ormaplatin,” Gynecol Oncol., vol 50, pp 147–158, 1993

[43] R Zajaczkowską, M Kocot-Kępska, W Leppert, A Wrzosek, J Mika, and J Wordliczek, “Mechanisms of chemotherapy-induced peripheral neuropathy,” Int J Mol Sci., vol 20, no 6, 2019

[44] H T Lynch et al., “Hereditary ovarian carcinoma: Heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management,” Mol Oncol., vol 3, no 2, pp 97– 137, 2009

resistance to chemotherapy,” Nat Rev Cancer, vol 3, no 7, pp 502–516, 2003

[46] B T Hennessy, R L Coleman, and M Markman, “Ovarian cancer,”

Lancet, vol 374, pp 1371–1382, 2009

[47] M Wiese et al., “Overcoming chemotherapy resistance of ovarian cancer cells by liposomal cisplatin: Molecular mechanisms unveiled by gene expression profiling,” Biochem Pharmacol., vol 85, no 8, pp 1077–1090, 2013

[48] P J Loehrer et al., “A randomized comparison of cisplatin alone or in combination with methotrexate, vinblastine, and doxorubicin in patients with metastatic urothelial carcinoma: A cooperative group study,” J Clin Oncol., vol 10, no 7, pp 1066–1073, 1992

[49] M Masahiro, T Atsushi, K Shuuichi, T Akio, T Yoshio, and K Kimio, “Pathological complete response to gemcitabine and cisplatin chemotherapy for advanced upper tract urothelial carcinoma: A case report,” Japanese Urol Assoc., vol 55, pp 155–158, 2012

[50] A M Tsimberidou, F Braiteh, D J Stewart, and R Kurzrock, “Ultimate fate of oncology drugs approved by the US food and drug administration without a randomized trial,” J Clin Oncol., vol 27, no 36, pp 6243–6250, 2009

[51] S Dhar, N Kolishetti, S J Lippard, and O C Farokhzad, “Targeted delivery of a cisplatin prodrug for safer and more effective prostate cancer therapy in vivo,” Proc Natl Acad Sci., vol 108, no 5, pp 1850–1855, 2011

[52] H B Armah, “Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial,”

Yearb Pathol Lab Med., vol 2010, no 5, pp 183–185, 2012

[53] A B Khan et al., “Cisplatin therapy in recurrent childhood brain tumors,”

Cancer Treat Rep., vol 66, no 12, p 2013—2020, Dec 1982

[54] R B Weiss and M C Christian, “New Cisplatin Analogues in Development: A Review,” Drugs, vol 46, no 3, pp 360–377, 1993

[55] G Natarajan, R Malathi, and E Holler, “Increased DNA-binding activity of cis-1,1-cyclobutanedicarboxylatodiammineplatinum(II) (carboplatin) in the presence of nucleophiles and human breast cancer MCF-7 cell cytoplasmic extracts: Activation theory revisited,” Biochem Pharmacol., vol 58, no 10, pp 1625–1629, 1999

[56] A H Calvert et al., “Carboplatin dosage: prospective evaluation of a simple formula based on renal function.,” J Clin Oncol., vol 7, no 11, pp 1748– 1756, 2017

[57] R Canetta, M Rozencweig, and S K Carter, “Carboplatin: the clinical spectrum to date,” Cancer Treat Rev., vol 12, no SUPPL A, pp 125–136, 1985

J Control Release, vol 65, no 1–2, pp 271–284, Mar 2000

[59] Y Matsumura and H Maeda, “A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.,” Cancer Res., vol 46, no 12, pp 6387–92, 1986

[60] H S Oberoi, N V Nukolova, A V Kabanov, and T K Bronich, “Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs,” Adv Drug Deliv Rev., vol 65, no 13–14, pp 1667–1685, 2013

[61] A D Bangham, M M Standish, and J C Watkins, “Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids,” J Mol Biol., vol 13, no 1, pp 238-IN27, Aug 1965

[62] V P Torchilin, “Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers,” Nat Rev Drug Discov., vol 4, no 2, pp 145–160, 2005

[63] R R Sawant and V P Torchilin, “Liposomes as’smart’ pharmaceutical nanocarriers,” Soft Matter, vol 6, no 17, pp 4026–4044, 2010

[64] H M Kieler-Ferguson et al., Encapsulation, controlled release, and antitumor efficacy of cisplatin delivered in liposomes composed of sterol-modified phospholipids, vol 103 Elsevier B.V, 2017

[65] D P Stölting, M Koch, M Wiese, H D Royer, and G Bendas, “Liposomal cisplatin can overcome chemotherapy resistance of A2780 ovarian cancer cells by inducing the extrinsic apoptotic pathway.,” Int J Clin Pharmacol Ther., vol 52, no 1, pp 78–81, 2014

[66] D Catanzaro et al., “Cisplatin liposome and 6-amino nicotinamide combination to overcome drug resistance in ovarian cancer cells,”

Oncotarget, vol 9, no 24, pp 16847–16860, 2018

[67] T Boulikas, “Low toxicity and anticancer activity of a novel liposomal cisplatin (Lipoplatin) in mouse xenografts,” Oncol Rep., vol 12, no 1, pp 3–12, 2004

[68] P H Bomans et al., “Nanocapsules: lipid-coated aggregates of cisplatin with high cytotoxicity,” Nat Med., vol 8, no 1, pp 81–84, 2002

[69] V Chupin, A I P M De Kroon, and B De Kruijff, “Molecular architecture of nanocapsules, bilayer-enclosed solid particles of cisplatin,” J Am Chem Soc., vol 126, no 42, pp 13816–13821, 2004

[70] S Guo et al., “Lipid-coated Cisplatin nanoparticles induce neighboring effect and exhibit enhanced anticancer efficacy,” ACS Nano, vol 7, no 11, pp 9896–904, 2013

[71] I H L Hamelers et al., “High cytotoxicity of cisplatin nanocapsuies in ovarian carcinoma cells depends on uptake by caveolae-mediated endocytosis,” Clin Cancer Res., vol 15, no 4, pp 1259–1268, 2009 [72] I H L Hamelers, “Carboplatin nanocapsules: a highly cytotoxic,

phospholipid-based formulation of carboplatin,” Mol Cancer Ther., vol 5, no 8, pp 2007–2012, 2006

Discov., vol 2, no 5, pp 347–360, 2003

[75] J Kopeček and P Kopečková, “HPMA copolymers: Origins, early developments, present, and future,” Adv Drug Deliv Rev., vol 62, no 2, pp 122–149, 2010

[76] K J HAXTON and H M BURT, “Polymeric Drug Delivery of Platinum-Based Anticancer Agents,” J Pharm Sci., vol 98, pp 2299–2316, 2009 [77] E Gianasi, R G Buckley, J Latigo, M Wasil, and R Duncan, “HPMA

copolymers platinates containing dicarboxylato ligands Preparation, characterisation and in vitro and in vivo evaluation,” J Drug Target., vol 10, no 7, pp 549–556, 2002

[78] J M Rademaker-Lakhai et al., “A phase I study of the safety and pharmacokinetics (PK) of XMT-1001 given as an intravenous (IV) infusion once every three weeks to patients with advanced solid tumors,” Clin Cancer Res., vol 10, pp 3386–3395, 2009

[79] Maria Serova et al., “ProLindac (AP5346) is a novel hydrophilic biocompatible co-polymer acting as a macromolecular carrier of bioactive DACH-platinum (Pt) complexes and has recently entered clinical trials The pH-dependent polymer delivery system is intended to improve the s,” in

Platinum and Other Heavy Metal Compounds in Cancer Chemotherapy, Springer Link, 2009, pp 41–47

[80] J R Rice, “Preclinical Efficacy and Pharmacokinetics of AP5346, A Novel Diaminocyclohexane-Platinum Tumor-Targeting Drug Delivery System,”

Clin Cancer Res., vol 12, no 7, pp 2248–2254, 2006

[81] E Stoyanova, P Petrov, I Karadjova, G Momekov, and N Koseva, “Cisplatin delivery vehicles based on stabilized polymeric aggregates comprising poly(acrylic acid) chains,” Polym J., vol 49, no 8, pp 607– 615, 2017

[82] X Yan and R A Gemeinhart, “Cisplatin delivery from poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) microparticles,” J Control Release, vol 106, no 1–2, pp 198–208, 2005

[83] S Matsumura, K Ajima, M Yudasaka, S Iijima, and K Shiba, “Dispersion of cisplatin-loaded carbon nanohorns with a conjugate comprised of an artificial peptide aptamer and polyethylene glycol,” Mol Pharm., vol 4, no 5, pp 723–729, 2007

[84] S T Yang et al., “Long-term accumulation and low toxicity of single-walled carbon nanotubes in intravenously exposed mice,” Toxicol Lett., vol 181, no 3, pp 182–189, 2008

[85] A Maigné, K Ajima, S Iijima, T Murakami, K Shiba, and M Yudasaka, “Carbon Nanohorns as Anticancer Drug Carriers,” Mol Pharm., vol 2, no 6, pp 475–480, 2005

[86] T A Hilder and J M Hill, “Carbon nanotubes as drug delivery nanocapsules,” Curr Appl Phys., vol 8, no 3–4, pp 258–261, 2008 [87] K Ajima et al., “Enhancement of In Vivo Anticancer Inside Single-Wall

cisplatin,” Acta Biomater., vol 58, pp 466–478, 2017

[89] G Riess, “Micellization of block copolymers,” Prog Polym Sci., vol 28, no 7, pp 1107–1170, 2003

[90] C Allen, D Maysinger, and A Eisenberg, “Nano-engineering block copolymer aggregates for drug delivery,” Colloids Surfaces B Biointerfaces, vol 16, no 1–4, pp 3–27, 1999

[91] V P Torchilin, “Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems,” J Control Release, vol 73, no 2–3, pp 137–172, 2001 [92] A Harada and K Kataoka, “Formation of Polyion Complex Micelles in an Aqueous Milieu from a Pair of Oppositely-Charged Block Copolymers with Poly(ethylene glycol) Segments,” Macromolecules, vol 28, no 15, pp 5294–5299, 1995

[93] A V Kabanov, T K Bronich, V A Kabanov, K Yu, and A Eisenberg, “Soluble Stoichiometric Complexes from Poly( N -ethyl-4-vinylpyridinium) Cations and Poly(ethylene oxide)- block -polymethacrylate Anions,”

Macromolecules, vol 29, no 21, pp 6797–6802, 1996

[94] A V Kabanov and V A Kabanov, “Interpolyelectrolyte and block ionomer complexes for gene delivery: Physico-chemical aspects,” Adv Drug Deliv Rev., vol 30, no 1–3, pp 49–60, 1998

[95] M C Jones and J C Leroux, “Polymeric micelles - A new generation of colloidal drug carriers,” Eur J Pharm Biopharm., vol 48, no 2, pp 101– 111, 1999

[96] K Kataoka, A Harada, and Y Nagasaki, “Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance,” vol 47, pp 113–131, 2001

[97] R Luxenhofer et al., “Doubly amphiphilic poly(2-oxazoline)s as high-capacity delivery systems for hydrophobic drugs,” Biomaterials, vol 31, no 18, pp 4972–4979, 2010

[98] Y Han et al., “Synergistic combinations of multiple chemotherapeutic agents in high capacity poly(2-oxazoline) micelles,” Mol Pharm., vol 9, no 8, pp 2302–2313, 2012

[99] N Nishiyama, M Yokoyama, T Aoyagi, T Okano, Y Sakurai, and K Kataoka, “Preparation and Characterization of Self-Assembled Polymer Metal Complex Micelle from cis -Dichlorodiammineplatinum(II) and Poly(ethylene glycol) Poly( α ,β-aspartic acid) Block Copolymer in an Aqueous Medium,” Langmuir, vol 15, no 2, pp 377–383, 1999

[100] J O Kim, N V Nukolova, H S Oberoi, T K Bronich, and A V Kabanov, “Block ionomer complex micelles with cross-linked cores for drug delivery,” Polym Sci Ser A, vol 51, no 6, pp 708–718, 2009

[101] H S Oberoi, F C Laquer, L A Marky, A V Kabanov, and T K Bronich, “Core cross-linked block ionomer micelles as pH-responsive carriers for cis-diamminedichloroplatinum(II),” J Control Release, vol 153, no 1, pp 64– 72, 2011

54, no 2, pp 169–190, Feb 2002

[103] N Nishiyama and K Kataoka, “Preparation and characterization of size-controlled polymeric micelle containing cis-dichlorodiammineplatinum(II) in the core,” J Control Release, vol 74, no 1–3, pp 83–94, Jul 2001 [104] N Nishiyama, Y Kato, Y Sugiyama, and K Kataoka, “Cisplatin-loaded

polymer-metal complex micelle with time-modulated decaying property as a novel drug delivery system,” Pharm Res., vol 18, no 7, pp 1035–1041, 2001

[105] M Baba et al., “Micellization of cisplatin (NC-6004) reduces its ototoxicity in guinea pigs,” J Control Release, vol 157, no 1, pp 112–117, 2012 [106] H Calvert et al., “A Phase I clinical study of cisplatin-incorporated

polymeric micelles (NC-6004) in patients with solid tumours,” Br J Cancer, vol 104, no 4, pp 593–598, 2011

[107] Y Matsumoto et al., “Improving Drug Potency and Efficacy by Nanocarrier-Mediated Subcellular Targeting,” Sci Transl Med., vol 3, no 64, pp 64ra2-64ra2, 2011

[108] R W J Scott, O M Wilson, and R M Crooks, “Synthesis, characterization, and applications of dendrimer-encapsulated nanoparticles,” J Phys Chem B, vol 109, no 2, pp 692–704, 2005

[109] U Boas and P M H Heegaard, “Dendrimers in drug reaseach,” Chem Soc Rev., vol 33, no August 2003, pp 43–63, 2004

[110] R Esfand and D A Tomalia, “Poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications,” DDT, vol 6, no 8, pp 427–436, 2001

[111] N Malik et al., “Dendrimers: Relationship between structure and biocompatibility in vitro, and preliminary studies on the biodistribution of I-labelled 125 polyamidoamine dendrimers in vivo,” J Control Release, vol 65, pp 133–148, 2000

[112] N Malik, E G Evagorou, and R B Duncan, “Dendrimer-platinate: a novel approach to cancer chemotherapy,” Anticancer Drugs, vol 10, no 8, pp 767–76, 1999

[113] G J Kirkpatrick, J A Plumb, O B Sutcliffe, D J Flint, and N J Wheate, “Evaluation of anionic half generation 3.5–6.5 poly(amidoamine) dendrimers as delivery vehicles for the active component of the anticancer drug cisplatin,” J Inorg Biochem., vol 105, no 9, pp 1115–1122, 2011 [114] P J Pellechia, J Gao, Y Gu, H J Ploehn, and C J Murphy, “Platinum Ion

Uptake by Dendrimers: An NMR and AFM Study,” Inorg Chem., vol 43, no 4, pp 1421–1428, 2004

[115] E Bellis, K Sándor, B Kovács, L Kollár, L Hajba, and G Kokotos, “Three generations of α,γ-diaminobutyric acid modified poly(propyleneimine) dendrimers and their cisplatin-type platinum complexes,” J Biochem Biophys Methods, vol 69, no 1–2, pp 151–161, 2006

[117] H Kulhari, D Pooja, M K Singh, and A S Chauhan, “Optimization of carboxylate-terminated poly(amidoamine) dendrimer-mediated cisplatin formulation,” Drug Dev Ind Pharm., vol 41, no 2, pp 232–238, 2015 [118] A Kesavan et al., “Tumor targeting using polyamidoamine

dendrimer-cisplatin nanoparticles functionalized with diglycolamic acid and herceptin,” Eur J Pharm Biopharm., vol 96, no August, pp 255–263, 2015

[119] M A Sherwani, S Tufail, A A Khan, and M Owais, “Dendrimer-PLGA based multifunctional immuno-nanocomposite mediated synchronous and tumor selective delivery of siRNA and cisplatin: Potential in treatment of hepatocellular carcinoma,” RSC Adv., vol 5, no 49, pp 39512–39531, 2015

[120] N T T Chau, “Luận án tiến sĩ ‘Nghiên cứu biến tính dendrimer pamam biopolymer ứng dụng mang thuốc,’” Graduate University of Science and Technology, 2017

[121] H J Huang, Y L Tsai, S H Lin, and S H Hsu, “Smart polymers for cell therapy and precision medicine,” J Biomed Sci., vol 26, no 1, pp 1–11, 2019

[122] A Bordat, T Boissenot, J Nicolas, and N Tsapis, “Thermoresponsive polymer nanocarriers for biomedical applications,” Adv Drug Deliv Rev., vol 138, pp 167–192, 2019

[123] Q Chai, Y Jiao, and X Yu, “Hydrogels for Biomedical Applications: Their Characteristics and the Mechanisms behind Them,” Gels, vol 3, no 1, p 6, 2017

[124] G Kocak, C Tuncer, and V Bütün, “PH-Responsive polymers,” Polym Chem., vol 8, no 1, pp 144–176, 2017

[125] M Rizwan et al., “pH sensitive hydrogels in drug delivery: Brief history, properties, swelling, and release mechanism, material selection and applications,” Polymers (Basel)., vol 9, no 4, 2017

[126] S Das and U Subuddhi, “PH-Responsive guar gum hydrogels for controlled delivery of dexamethasone to the intestine,” Int J Biol Macromol., vol 79, pp 856–863, 2015

[127] L Liu, W D Yao, Y F Rao, X Y Lu, and J Q Gao, “pH-responsive carriers for oral drug delivery: Challenges and opportunities of current platforms,” Drug Deliv., vol 24, no 1, pp 569–581, 2017

[128] X Gao, C He, C Xiao, X Zhuang, and X Chen, “Synthesis and characterization of biodegradable pH-sensitive poly(acrylic acid) hydrogels crosslinked by 2-hydroxyethyl methacrylate modified poly(L-glutamic acid),” Mater Lett., vol 77, pp 74–77, 2012

[129] G LI, S SONG, L GUO, and S MA, “Self-Assembly of Thermo- and pH-Responsive Poly(acrylic acid)-b-poly(N-isopropylacrylamide) Micelles for Drug Delivery,” J Polym Sci Part A Polym Chem., vol 46, pp 5028– 5035, 2008

behavior for oral delivery of insulin,” Polymer (Guildf)., vol 54, no 7, pp 1786–1793, 2013

[131] M Bruschi, “Mathematical models of drug release,” in Strategies to Modify the Drug Release from Pharmaceutical Systems, Woodhead Publishing, 2015, pp 63–86

[132] H Baishya, “Application of Mathematical Models in Drug Release Kinetics of Carbidopa and Levodopa ER Tablets,” J Dev Drugs, vol 06, no 02, pp 1–8, 2017

[133] A Abderrezak, P Bourassa, J S Mandeville, R Sedaghat-Herati, and H A Tajmir-Riahi, “Dendrimers bind antioxidant polyphenols and cisplatin drug,” PLoS One, vol 7, no 3, pp 1–12, 2012

[134] P Ghorbaniazar, A Sepehrianazar, M Eskandani, M Nabi-Meibodi, M Kouhsoltani, and H Hamishehkar, “Preparation of poly acrylic acid-poly acrylamide composite nanogels by radiation technique,” Adv Pharm Bull., vol 5, no 2, pp 269–275, 2015

[135] M A Moharram and M G Khafagi, “Application of FTIR Spectroscopy for Structural Characterization of Ternary Poly(acrylic acid)– Metal– Poly(vinyl pyrrolidone) Complexes,” J Appl Polym Sci., vol 105, pp 1888–1893, 2007

[136] L M Kaminskas, B J Boyd, and C J H Porter, “Dendrimer pharmacokinetics: The effect of size, structure and surface characteristics on ADME properties,” Nanomedicine, vol 6, no 6, pp 1063–1084, 2011 [137] P Hayati et al., “Sonochemical synthesis, characterization, and effects of

temperature, power ultrasound and reaction time on the morphological properties of two new nanostructured mercury(II) coordination supramolecule compounds,” Ultrason Sonochem., vol 37, pp 382–393, 2017

[138] G W Lu and P Gao, “Emulsions and Microemulsions for Topical and Transdermal Drug Delivery,” in Handbook of Non-Invasive Drug Delivery Systems, V S Kulkarni, Ed William Andrew Publishing, 2010, pp 59–94 [139] S L Perry, Y Li, D Priftis, L Leon, and M Tirrell, “The effect of salt on the complex coacervation of vinyl polyelectrolytes,” Polymers (Basel)., vol 6, no 6, pp 1756–1772, 2014

[140] N Prins and F A A Kingdom, “Model Comparisons.,” in Psychophysics, Elsevier Ltd, 2016, pp 247–307

[141] L Bodewein, F Schmelter, S Di Fiore, H Hollert, R Fischer, and M Fenske, “Differences in toxicity of anionic and cationic PAMAM and PPI dendrimers in zebrafish embryos and cancer cell lines,” Toxicol Appl Pharmacol., vol 305, pp 83–92, 2016

[142] M Farshbaf, S Davaran, A Zarebkohan, N Annabi, A Akbarzadeh, and R Salehi, “Significant role of cationic polymers in drug delivery systems,”