Công nghệ Protease
LỜI MỞ ĐẦUNgày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm chúng tôi đã lựa chọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm làm đề tài báo cáo.DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ3 TrangBảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat 14Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá 27Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) . 6Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin) 7Hình 3: Bào tử xạ khuẩn . 10Hình 4: Sản xuất Fomat 13Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease 10Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền 25Sơ đồ 3: qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật 26Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm . 28Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật 29Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân 304 NỘI DUNGQua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20 – 30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết.Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%).1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE1.1. Giới thiệu chung Nhóm enzyme protease (peptidase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin.Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.5 Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitd định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,…Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các acid amin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa.Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm.6 Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia). Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin)1.2. Phân loại protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme; Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase; Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptit; Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: 7 chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Protease acid: pH = 2 – 4; Protease trung tính: pH = 7 – 8; Protease kiềm: pH = 9 – 11.1.3. Nguồn thu protease vi sinh vậtTrong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.1.3.1.Vi khuẩn:Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease 8 của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein.Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12.1.3.2.Nấm mốc:Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất fomat.1.3.3.Xạ khuẩn:Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus . 9 Hình 3: Bào tử xạ khuẩnCác chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt.Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vậtSự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt thành sơ đồ như sau:Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease10 1.4.1. Tuyển chọn chủng:Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn.Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme.1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease:Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp sau: Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng; Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng.1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme:Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau: Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật lý, hóa học, cơ học…;11 Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có pH ổn định và phù hợp với enzyme; Lọc, ly tâm; Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối, điểm đẳng điện pH = pI; Ly tâm, tách tủa; Sấy kết tủa cho đến khô.Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn tinh sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như sau: Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua; Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa; Phương pháp điện di; Phương pháp lọc gel (gel Sephadex); Phương pháp sắc ký.2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]:Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease.Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm như pepton, acid amin, Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong sữa. Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC. Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểm tra chất lượng sữa.12 [...]... Quốc”, người Nhật gọi là Sufu 2.5 Protease trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp 2.5.1 Trong công nghệ chế biến thịt Trong công nghiệp chế biến thịt, các enzyme phân giải protein cũng được sử dụng trong việc làm mềm thịt Kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt Ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định-... Amidase: chúng sẽ tấn công các muối amid để hình thành NH3 và acid amin, góp phần làm thay đổi tính chất và hàm lượng của protein trong hạt malt, các enzyme amidase có pHopt = 7.3 - 8.0, topt = 45 - 500C 3 KẾT LUẬN Công nghệ enzyme nói chung và công nghệ protease nói riêng đã, đang và sẽ có những bước phát triển đáng kể, mang lại những ứng dụng to lớn cho đời sống con người Trong đó thì công nghệ chế biến... hàng ngàn năm ở Nam Mỹ Nó được bán như là 1 thành phần trong bột làm mềm thịt có sẵn ở hầu hết các siêu thị 2.5.2 Trong công nghệ đồ hộp [2][4] Hỗn hợp enzyme pectinase, protease, hemicellulase làm trong và tách dịch quả (3 – 6g/l, giữ ở nhiệt độ 40 – 450C trong 2 – 4giờ) 35 Trong công nghệ chế biến cá hộp, cần chú ý các điều kiện để ức chế các hoạt động của vi sinh vật nhằm ngăn cản quá trình sản xuất... sản phẩm, để làm tăng đáng kể chất lượng cảm quan của sản phẩm; nếu không có sự có mặt của nó thì quá trình chế biến không thành công Với những vai trò trên thì rõ ràng việc ứng dụng protease trong công nghệ chế biến thực phẩm là không thể thiếu Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng protease thì hiệu suất không cao và việc sử dụng kết hợp một cách hợp lý và hiệu quả với các phương pháp khác là cần thiết để có... loại muối - Ảnh hưởng của nhiệt độ 2.6 Một số ứng dụng khác của protease 2.6.1 Trong sản xuất bánh mì [6] Trong hạt mì cũng có chứa các protease làm giảm chất lượng bột nhào do sự phân giải protein cấu trúc bậc ba khiến gluten bị vụn nát Protease bột mì hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 45 – 47oC, pH = 4,5 – 5,6 Khi bổ sung chất khử thì hoạt độ của protease tăng nhưng với chất oxy hóa và muối ăn thì bị kìm hãm... peptid hoặc gắn thêm các acid amin không thay thế Protease cũng được dùng để xử lý, tận dụng các phế liệu từ thịt, hoặc các nguyên liệu có nguồn gốc từ protein (thịt vụn, xương, gelatin…) để tạo ra các sản phẩm có giá trị như dịch protein, chất tăng vị, chất cải thiện mùi… Enzyme Papain [5]: Papain là một protease điển hình được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến thịt, có trong cây đu đủ và đu đủ... NaCl ngăn chặn sự hư hỏng chượp cá 2.3 Protease trong công nghệ sản xuất tương [1] Xì dầu hay nước tương (phương ngữ miền Nam Việt Nam) là một loại nước chấm được sản xuất bằng cách lên men hạt đậu tương, ngũ cốc rang chín, nước và muối ăn Nước chấm này, có nguồn gốc từ Trung Quốc, được sử dụng khá phổ biến trong ẩm thực châu Á tại khu vực Đông Á và Đông Nam Á Trong công nghiệp nước tương thường được sản... dung dịch enzyme vào mô thịt Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân 34 Các enzyme papain, bromelin, pepsin hoặc các protease vi khuẩn từ Aspergillus, Bacillus…., được sử dụng làm mềm thịt, hòa tan các protein cá,…nói chung thủy phân bằng protease làm tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc... trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác Quá trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat Protease được thu nhận từ một số vi sinh vật như Asp candidus, P roquerti, Bac mesentericus,… Bảng... giải thành pepton, acid amin và một ít NH3 Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa 2.2 Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi sinh vật sống . trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm chúng tôi đã lựa chọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực. ký.2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế