Hai phổ gấn như trùng khớp, kết hợp với kểt quả HMBC, vậy V5 là neodiọsmin.. Bảng 0..[r]
(1)Trong íiệu phân tích taxifolin cho tháy rõ ràng khối lượng phân tử taxifolin-3-O- rhamnoside chất taxifoiin cùa chể độ positive mode là: 451.1215 305.0632
Như vậy,,dựa kểt phân tích sắc ký mỏng TLC, sắc ký lỏng (HPLC) sắc ký ỉỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS), chủng xác nhận tồng hợp hợp chất glycoside phương pháp chuyển hóa sinh học
KẾT LUẬN VA KIẾN NGHỊ
- Đã tiến hành thí nghiệm chuyển hóa sử dụng vi khuần cải biến di truyền Escherichia coli BL21(DE3)/Apgi/Azwf với chất taxifolin rhamnetin
- Đã kiểm tra íạo thành sản phẩm taxifolin-3-O-rhamnoside rhamnetin-3-O- rhamnoside kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sẳc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS va LC-TOF-MS)
- Kết cho thấy vi khuẩn tái tổ hợp có khả chuyển hóa chat flavonoid thành sản phẩm
glycoside theo dự kiến ban đầu
- Cần tiếp tục tiến hành tổi ưu hóa điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, oxy hịa ían, v.v) nhằm tang sinh suất sản phẩm tạo thành
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Petacci F, Freitas ss, Bruneíti IL, Khalil NM (2010), Biological Research, 43(1):63-74
2 Kim HS, BG Kim, s Sung, M Kim, H Mok, Y Chong, JH Ahn (2013), Pianta, 238(4):683-693 doi: 0 / S 0 - - 2 -
3 Ko JA, YB Ryu, TS Park, HJ Jeong, JH Kim, SJ Park, JS Kim, D Kim, YM Kim, w s Lee (2013), Journal of Microbiology and Biotechnology, 22(9):1224-1229
4 Pandey RP, s Ma!la, D Simkhada, BG Kim, JK Sohng (2012), Applied Microbiology and Bioiechnoly, 97(5):1889-1901
5 Thuan NH, RP Pandey, TTT Thuy, JW Park, JK Sohng (2013a), Applied Biotechnology and Biochemistry, 171(8):1956-1967
6 Thuan NH, Park JW, JK Sohng (2013b), Journal of process biochemistry, 48(11):1744-1748
PHÂN LẬP FLAVONOID VÀ IRIDOID MỚI TỪ CÂY NỮ LANG VALERIANA HARDWICKII WALL VALERI
DS Lê Thị Thu Hồng " Khoa D ược- ĐH Lạc Hồng H ướng dẫn: Th.s Huỳnh LỜI - Khoa D ược- Đ h Y Dược TP HCM ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU
Chi Valeriana L thuộc họ Valerianaceae, chi
khá lớn, gồm 200 loài, phân bố chủ yếu Châu Á, châu Au, châu Mỹ Một số loài chi valeriana sử dụng có tác dụng an thần, giảm lo lâu, chữa ngủ, đau dày, động kinh [1], [3] Việt Nam có hai lồi gồm V hardwickii Wall, gọi là "Nữ lang"; loài V jatamansi Jones gọi "Sì to", chúng dùng làm thuốc íàm thuốc số nơi Lồi V jastamansi Jones (sì to) có nhiều nghiên cứu công bố : Đỗ Ngọc Thanh (1989), Nguyễn DuỵThuần (2008) cịn lồi V hardwickiiV\laỉị
tác dụng dược lý loài V hardwickii Wall., đề tài “Phân lập flavonoid iridoỉd từ Nữ lang Valeriana hardwickii wall." thực hiện.
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHẢP NGHIÊN u Đổi tượng nghiên cứu
Phần mặt đất Nữ lang Valeriana hardwickii thu hái vào tháng 11/2011 cổng Trời, Đả Lạt Nguyên liệu định danh cách so sánh hình íhái học với tài liệu chuyên ngành [1]
Phương pháp nghiên cứu
Các phươnq pháp chiết xuất, phân lập sử dụng: chiết ngấm kiệt ethanol 96%, lắc phân bố với hệ dung mơi có độ phân cực tăng dần, sẩc ký cột silica gel, sắc ký rây phân tử, sắc ký lớp mỏng Ngồi cịn có HPLC, MS, NMR, sư đụng đề xác định cấu trúc chất
Kết bàn luận
Chiết x u ấ ỉ phân lập
Nguyên liệu (7 kg) ngấm kiệt với ethanol 96%, loại dung môi thu dịch chiểt nước, lắc phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần, loại dung môi thu cao petroleum ether (32,88 g), ethyl aceíat (70,64 g), butanol (38,73 g) Cao butanol tủa methanol, làm tủa thu V1 15 mg Phần cao butanol sau đỏ triển khai qua sắc ký cột siiica gei với hệ dung môi rửa giải ethyl acetat:methanol (100:0 -> 70:30) thu 15 phân đoạn
Phân đoạn cô bớt dung mơi, làm íạnh thu kết tinh hình kirĩVmảu trâng xanh (KT6 830 mg) Kếí tinh KT6 chưa xử iỷ qua than hoạt, kểt tinh lại íhu chất V2, có khối lượng 730 mg, màu trắng
Phân đoạn có tủa, tủa làm cách tùa lại methano! 30 mg tủa 7A làm sạ ch , có màu trắng
Phân đoạn 8, 10 thu tủa, tủa tiến hành triển khai qua sephadex Ket chất V3(11 mg), V4(30 mg), V5(P mg) phân lập
Xác định câu trú c
Các chất phân lập kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng, HPLC, xác định cấu írúc MS NMR
(2)V2: Cảm quan: V2 chất kết tinh màu trắng MeOH Tính tan: dễ tan nước (30 mg/100 ụi) tan methanoi (1 m g /15 ỊJÌ), thực tế khơng tan ethyỉ acetat (1 m g /11 mi), khó tan cloroform (2mg/ml) Năng suất quay cực: [ a ] £ £ = + 47,3 Phản ứng với ìhuốc ỉhử: có màu xám tím với thuốc thử vs, khơng phản ứng với thuốc thử acid acetic băng - acid
Bảng 1) xác định công thức V2 !à 6-hydroxy- Bảng Két NMR V2
hyđroclorid (8:2) UV: Amax 205 nm Điểm chảy:127,2 oc Phổ !R(KBr): 3320 (-OH), 2940 (C~H), 1700 (C=0), 1480,1400,1300, 1190, 1100, 900 cm-1 Phổ MS V2 cỏ mảnh [M+22,9892]+ có đỉnh m/z 239,0919 Sơ xác định M V2 íà 216,1027 Kếỉ hợp với phổ Phổ 1H NMR (500 MHz, pyrìđỉn-d5), 13C-NMR {125 MHz, pyridin-d5), DEPT, HSQC, HMBC, COSY, N O ESY(
4,7-bis(hydroxymethyl) hexahydrocyc!openta[cỊpyran-1 (3H)-on(6,hexahydrocyc!openta[cỊpyran-10,hexahydrocyc!openta[cỊpyran-1hexahydrocyc!openta[cỊpyran-1-trihydroxy dihydronepetaiacton)
c DEPT õcppm Ỗ H ppm, m, (J,Hz) HMBC (H->Cn) COSY NOESY
c=0 176,6 ■
-6 F CH-0 73,5 4,81t 8,5 H~5,H-3
3 c h2-0 70,6 4,69ơđ(10,5;3) 8,4,11,1
4,37t 8,4,11,1 H-4
10 CH2-0 62,4 4,53 dd (10.5:4,5) 9,7,6
4,47 dd (10,5;7,5) 9,7,6
11 CHa-0 62,2 3,95 <*/(11:4,5) 8,4,3
3,74 dd (11,7,5) 8,4,3
7 CH 51,8 2,89 m 9, 10, (1) H-10;H-9 H-6, H-5(1,54)
4 CH 44,9 1,98 m 8, 10, 9(5), H-8, H-11, H-3 H-5, H-11(3.95), H-3(4,69)
9 CH 42,8 3,33 ơơ(11,5;9,5) 8* 5.7, 10, H-7, H-8 H-8, H-10, H-3
5 c h2 42,4 2,37ơơ(12,5;325) 8, 9, 7, H-8
1,54 m ’ 8,4* H-8 H-4, H-6, H-7
8 CH 37,7 3,08 m 5,9,11,(1) H-5, H-4, H-7 H-5, H-9, H-11, H-3
luận sơ phân tử khối V3 578 So sánh phổ NMR 13C, 1H V3 với apigenin 7-O-neohesperidosid (Rhoifolin) [41- Từ kết so sánh Bâng 2, hai phổ gần trùng khớp Vậy V3 íà apigenin-7-O- neohesperidosid
V4: có màu vàng nhạt; phổ ES- có đỉnh m/z [M-H]=737, ES+ có đỉnh [M+H]=739, sơ kết luận phân tử khối V4 ià 738 Ngồi ES- có đỉnh m/z 283, M=738=[284+162+146+146] Kết iuận sơ V4 Acacẽtin 7- (2G-rhamnosyi)-rutinosid hay cịn có tên khác Neobudofficid
VỊ trí V3 Rhoifolin [41
ốc (125 MHz, p p m ) ÕHÍ500 MHz, p p m ) ( J ,Hz) ổ c { MHz, p p m ) 0h(300 MHz, p p m ) ( J , Hz)
2 164,2 - 164,2
3 103,2 6,88 s 103,1 6,84 s
4 181,9 - 181,9
• 161,3 12,92 s 161,3 12,95 s
6 99,3 6,37c/.(2,0 Hz) 99,3 6,38 Ơ (1.8Hz)
7 162,5 - 162,5
8 94,5 6,79 Ơ (2 Hz) 94,5 6,79 d (1,8 Hz)
9 156,9 - 156,9
10 105,4 ~ 105,4
1' 121,1 - 120,9
2’ 128,5 7,94 d (8,5 Hz) 128,5 7,93 d (8,7 Hz)
3’ 116,0 6,94 d (8,5 Hz) 116,0 6,95 Ơ (8,7 Hz)
4’ 161,1 - 161,1
5’ 116,0 ,9 d (8 ,5 Hz) 116,0 6,95 d ( , 7 Hz)
6’ 128,5 6,94 d(8,5 Hz) 128.5 7,93 d (8,7 Hz)
Gỉc-1” 97,8 5,23 d (7,5 Hz) 97,9 5,22 d(7 Hz)
Gic-21' 77,0 3,51 m 77,0
Gic-3” 76,3 3,46 m 76,3
Gic-4” 70,5 3,21 m 70,5
Gic-5” 76,2 3,69 m 77,2
Gic-6” 60,5 3,75 m, 3,46 m 60,5
F^ia-1‘” 100,4 5,13 m 100,4 5,09 s
Rha-2’" 70,4 3,74 m 70,3
Rha-3'" 69,6 3,36 m 69,7
(3)-Rha-4’” 71,9 3,21 m 71,8
Rha-5”' 68,3 3,46 m 68,3
Rha-6’” 18,0 1,20 d {6,5 Hz) 18,0 1,23 (6,2Hz)
V5: có màu trăng vàng, ES+ cùa V5 có [M+H]+ tín hiệu m/z 609, phố ÉS- có [M-H]- tín hiệu m/z 607 , kết luận sơ phân íư khối V3 608 So sánh phổ NMR 13C, 1H V5 với neodiosmin (5,7,3’ - trihydroxy-4’ -methoxyflavon 7Ị3-neohesperidosid) [2] (Bảng ) Hai phổ gấn trùng khớp, kết hợp với kểt HMBC, V5 neodiọsmin
Bảng So sánh phổ NMR V5 neodiosmin DMSO-dg
Vi trí V5 Neodiosmin f21
õc(125 MHz, ppm) ÕH (500 MHz, ppm) (J,Hz) ỗc(75 MHz, ppm) 0h(300 MHz, ppm) fJ.Hz)
2 164,2 - 164,8
-3 103,9 6,86 s 104,0 6,80 s
4 182,9 - 182,1
-5 161,1 161,3
-6 99,4 6,38s 99,5 6,37 d (2 Hz)
7 162,6 - 162,7
8 94,5 6,77 s 94,7 6,75 d (2,1 Hz)
9 157,0 - 157,2
10 105,5 - 105,6
1’ 122,9 - 123,0
2’ 113,1 7,52 d (7,5 Hz) 113,2 7,41 d (1,9 Hz)
3’ 146,9 6,94 d (8,5 Hz) 147,0
-4’ 151,4 - 151,5
5’ 112,2 7,07 d (8,5 Hz) 112,3 7,08 d (8,7 Hz)
6’ 118,8 7,52 d(7,5 Hz) 119,0 7,54ơđ(2,0;19,2 Hz)
OMe 55,8 3,84 s 55,9 3,84 s
Glo-1" 97,8 5,21 d (7,0 Hz) 98,0 5,26 d (6,85 Hz)
Glc-2” 76,3 3,48 m 76,6
Glc-3” 77,0 3,45 m 77,1
Gìc-4" 70,5 3,19m 70,6
Glc-5” 77,1 3,69 m 77,3
Glc-6” 60,5 3,67 m, 3,47 m 60,7
Rha-1’" 100,5 5,11 s 100,7 5,13 s
Rha-2”' 70,4 3,69 m 70,6
Rha-3”' 69,7 3,43 m 69,9
Rha-4’" 71,9 3,20 m 72,1
Rha-5’” 68,3 3,45 m 68,5
Rha-6’” 18,0 1,18 ơ(6,0 Hz) 18,3 1,22 d (6.1 Hz)
5-OH 12,92 s
ỎH õ
V1 linarin
ÕH
V3 rhoifolin
ỎH
V5 nediosmin O H
V4 neobudofficid
(4)-3.95
V2 6,10,11 -trihydroxy dihydronepetalacton Hinh Công thức cấu tạo V1, V2, V3, V4, V5
Cao BuOH Tủa/ C Ồ I196
38,7 í? 't
Cao BuOH sau Tùa 35 g
1, SKCCK
T?aB PĐ1-5 PĐ ố
Tủa lại/ ,McOH V I (i5 m g )
PĐ
K T (830 mg) Than ho?t
PĐ
Tủa A,B,C
PĐ P ĐỈ O PĐ 11-15
Tủa T8 (150mg) Tủalại / MeOH V2
(730 mg) Ị
7 A s?ch (30 rag)
S'
iinarin ,1 ,1 1-trihycli'oxy dihydroncpcíalacíon
PĐ 10B
sephadex
V3
(11
sephadex
3l PĐ iOD
Tùa/ MeOH V4 (30 mg)
linarin A p ig iu in -7 -O- neohesperidosid
V5 (8 mg)
Neobudofficicl Neođiosmin
S đồ Tóm tắt q trình phân lập ch ấ ỉ cao BuOH KẾT LUẬN
Đề tài phân lập chất ià
V1 (Linarin); V2(6,10,11-trihydroxy
dihydronepetalacton); V3(apigenin-7~0-neohesperidosỉd (rhoifolin)); V4 (neobudofficid) V5(neodiosmin) Trong V3, V5 lần phân lập Nữ lang Valeriana hardwickii\Na\\:, V2(6,10,11-trihydroxy đihydronepeíalacỉon) la
Chat mơi phân lập lan đầu iiên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.ĐỖ Huy Bích , Đặng Quang Trung (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa
học Kỹ thuật, Hà Nội
2 Del Rio Jose Aritonio, Benavente Obdulỉo, et al (1992), "Neodiosmin, a fiavone glycoside of Citrus aurantium", Phytochemistry 31 (2), pp 723-724.
3 Huynh Loi, Pacher Thomas, et (2013), "Comparative analysis of the essential oils of Valeriana hardwickii Wail, from Vietnam and Vaieriana officinalis L from Austria”, Taylor & Francis 1, pp 1-3.
4 Son Kun Ho, Park Jung Ok, et al (1992), "Fiavonoids from the aerial parts ofrtonicera japonica", Archives o f Pharmacal Research 15 (4), pp 365-370.