Nghiên cứu hình ảnh thoi vô sắc của noãn người bằng kính hiển vi phân cực

ĐẶT VÁN ĐẺ VÀ MỤC TiÊU thái noãn chì đánh giá về mặt bào tương, thể cực, độ Mọt trong những bừớc quan trọng của thụ tinh dầy màng trong suốt, còn những bào quan quan tr[r]

NGHIÊN CỨU HÌNH ẢNH THOI VƠ SẮC CỦA NỖN NGƯỜI BẰNG KÍNH HIỂN VI PHÂN c ự c

s v Nguyên Phú Cường (S V năm th ứ 6, Học viện Quân y) sv Lê Ảnh Nguyệt, sv Lê Thị íh ù y Linh, s v Lê Thị Sang, s v Mai Thị Hồng Lan / Q l/ n ă m th i'v Hn/» ị/ ì â r t Q u ắ n /

Hướng đẫn: TS Nguyên Thanh Tùng ịB ộ m ôn M ô p h ô i, Học viện Quân y) TÓM TẤT

Đặt vấn đề: S dụng kính hiển vi phân cực, quan sảt hình thái thoi vơ sắc nỗn người, qua đảnh giá sự trưởng thành noăn chất lượng labo nũỉcấy noăn phơi.

Mục ĩiêu nghiên cứu: Đánh giá vị trí thoi vơ sắc noăn trưởng thành Đánh giá phát triển phôi từ nỗn nhìn thấy thoi vơ sắc noăn khơng nhìn thấy thoi vơ sắc.

Đối tượng phương pháp: nghiên cửu tiến cứu mô tả cắt ngang 250 noãn cửa bệnh nhãn định làm thụ tinh ống nghiệm Trung tâm đào tạo nghiên cứu công nghệ phôi - Học viện Quân y Sử dụng kính hiển vi phân cực quart sẩt thoi vơ sắc nỗn trường thành.

Kết quả: Trong 218 nỗn M il 170 nỗn M il nhìn thấy thoi vỗ sắc (77,98%), có 115 nỗn (67,65%) có thoi vơ sắc nằm gần thể cực 1, 55 nỗn (32,35%) có thoi vô sắc lệch so với thề cực 1 từ 300 đến 1800 Nỗn M il nhìn thấy thoi vơ sắc có tỉ lệ thụ tinh tỉ lệ p h õ itố t (69,41% 61,02%) cao so với nỗn M il khơng nhìn thấy thoi vơ sắc (39,58% 36,84%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 p <0,05

Bàn luận: Vị trí thoi vơ sắc thay đỗi so với vị trí thề cực Noẵn nhìn thấy thoi vơ sắc có tỉ lệ thụ tinh chất lượng phôi tốt cao nhóm nỗn khơng nhìn thấy thoi vơ sắc.

Từ khóa: Kính hiển VI phân cực, nỗn người. SUMMARY

STUDY ON THE SPINDLE IMAGE OF OOCYTE BY POLARIZED LIGHT MICROSCOPE

Author: Nguyen Phu Cuong, Le Anh Nguyet, Le Thi Sang, Mai Thi Hong Lan, Le Thi Thuy Linh (Vietnam Military Medical University) Background: Cytoplasm, zona pellucida, polar body can be observed by conventional Microscope but some other parts o f cell is invisible Polarized Microscope allows embryologist obverse morphology o f the spindle The appearance o f spindle helps us recognize either oocyte maturation o r the quality o f laboratory There are purposes in this Research: First, evaluation o f Spindle location o f Mature Oocyte Second, evaluation o f Embryos Development by Oocyte with Spindle and Oocyte with not observed Spindle Materials: to evaluate spindle position o f mataphase II oocyte and the development o f embryos origined from oocytes with spindle and without spindle Methods: 250 M il oocytes were analysed with polarized microscopy in IVF centre o f Viet Nam Military Medical University Results: Spindles were detected in 170 (77.98%) o f 218 metaphase II oocytes, 115 spindles (67.65%) o f M il oocytes is beneath or adjacent to the first polar body, 55 oocytes had the spindle located between 300 and 1800 angle away from the first polar body Fertilization rate and good quality embryos in oocytes with a visible spindle (69.41% and 61.02%) were higher than in oocytes without a visible spindle (39.58% and 36.84%), the difference was significantly with p < 0.001 a n d p < 0.05 Conclusions: spindle position ofmataphase II oocytes is not always beneath o r adjacent to the first polar body Fertilization rate and good quality embryos in oocytes with a visible spindle were higher than in oocytes without a visible spindle.

Keywords: Microscope, cell.

ĐẶT VÁN ĐẺ VÀ MỤC TiÊU thái nỗn chì đánh giá mặt bào tương, thể cực, độ Mọt bừớc quan trọng thụ tinh dầy màng suốt, bào quan quan trọng ống nghiệm (TĨTO N) kích thích buồng trứng lại quan sát Kinh hiển vi quang học có kiểm sốt để tạo nhieu nang nỗn nhiêu phơi sử dụng ánh sáng phân cực giúp cốc nha phoi học tổt giúp cho tỉ lệ thành cơng ngày nâng cao Tuy tháy hình thái thoi vơ sắc Sự xuất nhiên, vấn đề iớn kích thích buồng trứng cùa thoi vô sắc không đánh giá trường thành không tự nhiên vượt giới hạn sinh lý, tạo cùa nỗn mà cịn thơng qua đánh giá chất lượng nhữrìg nỗn bất thường mặt di truyền làm labo nuôi cấy nỗn phơi Do nghiên cứu có cho phơi khơng làm tổ chì phát triển đến hai mục tiêu sau:

một thời gian định Chính việc lựa chọn - Đánh giá vị trí thoi vơ sắc nỗn trưởng nỗn có chất lượng tốt khơng bấí thưởng vế mặt di thành.

truỵền kỹ thuật không xâm lấn cần - Đánh giá phât triển phôi từ nỗn nhìn thấy thiết Các nhà phơi học đâ đưa nhiều thang điểm thoi vô sắc nỗn khơng nhìn thoi vơ sắc.

hình tháỉ đề đánh giá chất íượng nỗn, lựa chọn cho Đ ố i JƯỢNG V À PHƯƠNG PHÁP NGHIẾN c ứ u việc tạo phôi cấy vào buồng tử cung Theo truyền Đối tư ợ ng nghiên cứu

thổng kính hiển vi quang học thơng thường, hình Nỗn trương thành cùa bệnh nhân chì định

làm thụ tinh ống nghiệm Trung tâm Công nghệ phôi - Học viện Quân y

* Tiêu chuẩn lự a chọn + Bệnh nhân dứới 35 tuổi + 3ng/m! < AMH < 10ng/ml

+ Số nang thứ cấp buồng trứng: - vào ngày chu kỳ kinh

* Tiêu chuẩn loại trừ

+ Bệnh nhân co buồng trứng đa nang, đáp ứng với kích thích buồng trưng

+ Thiểu số lượng tinh trùng bất thường nhiều hình thái tinh trùng

2 Phương pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên u

- Nghiên cưu tiến cứu mơ tả cẩí ngang cỏ phân tích

* Chỉ tiêu nghiên u

- Tuổi trung binh bệnh nhân - Liều FSH trung bình bệnh nhân - TT lệ trường thành noãn

- Tỉ lệ nỗn trưởng thành nhìn thấy thoi vơ sắc khơng nhìn thấy thoi vơ sẳc

- Vị trí thoi vơ sắc

- Tỉ lệ ỉhụ tinh nỗn nhìn thấy thoi vơ sắc khơng nhìn thấy thoi vô sắc

- Phân loại phôi ngày

* Phương pháp, k ỹ th u ậ t nghiên u

- Quy trinh kích thích nang noãn làm noãn + Phác đồ GnRHa: FSH (Gona! F Puregon) kích thích nang nỗn dùng ncjày chu kỳ, antagonist bổ sung ngày dùng FSH Siêu âm nang noãn hàng ngày siêu âm có £3 nang nỗn, kích thước 17 mm gây kích thích rụng trứng hCG 5Q00ÍU Sau 35 - 36h tiêm hCG tiến hành chọc húí nỗn

+ Nỗn sau chọc hút ủ tủ ấm 37°c, 5% C giờ, sau ỉàm khối tế bào bao quanh bắng enzym hyaluronidasekết hợp với pipette kéo có kích thước hợp íỷ Nỗn làm tế bào nang tiếp tục ủ ấm tủ ấm 37°c Trước thực thực ỈCSI noãn đánh giá mức độ trưởng thành đánh giá thoi vô sắc

- Kỹ íhuật ICSI (tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn) theo phương pháp Palermo (1992)

- Phương pháp đánh giá hỉnh thái noãn thụ tỉnh theo Kathy cs, 2000.

Mức độ trưởng

thành noãn Đặc điểm Noãn trưởng

thành

Trong bào tương khơng có íứi mầm, xuất thể cực khoang quanh noãn

qọi noãn MI!

Noãn chưa trường thành

Trong bào tương xuát túi mầm gọi noãn GV

Trong bào tương khơng cịn thấy túi mầm, chưa xuất thể cực gọi

noãn MI Noãn thụ tinh

bình thường

Xuất tiền rihârt đực tiền nhân bào tương, hai thể cực diện

trong khoang quanh noãn

- Nuôi cay theo dõi phôi

Sau 16 - 18 thực kỹ thuật ICSÍ, nỗn đánh giá thụ tinh, noãn thụ tinh bỉnh thường chuyển sang đĩa nuôi mớị môi trường G1 plus Phôi đánh giá phân loại ngày tiếp iục nuôi cấy môi trường G2 plus tủ ấm Cook Đến ngày thứ 3, phôi phân loại dựa đánh giá đồng thuận Alpha hiệp hội ESHRE 2011 [1],

- Xử !ý phân tích số liệu

Kết biến thể írị số trung bình biến thể số tì lệ % Sử dụng t-test student Chi- square (x2) để so sánh biến Các test có giá tri thống kê p < 0,05

KẾT QUẢ

-Tuổi trụng bình nhóm nghiên cứu là: 29,65 ± 2,87 tuổi Trong bệnh nhân trẻ nhấỉ 24 íuổi, lớn ỉà: 33 tuổi Liều FSH sử đụng kích thích trứng trung bỉnh bệnh nhân là: 192 ±29,69 IU/ngày So noãn thu trung bỉnh bệnh nhân 10 ± 1,61

- Tổng số noãn chọc hút 250 nỗn, có 32 nỗn chưa trưởng thành (10 noãn noãn kỳ đầu phân bào giảm nhiễm lần (noãn GV) chiếm tỉ lệ 4%, 22 nỗn kỳ phân bào giảm nhiễm íần i (nôn MI) chiếm tỉ !ệ 8,8% 218 nỗn trưởng thành (noân Mil) chiếm tỉ lệ 87,2%

1

1 1 * 1 1 1 | | i P i | J i | /

V.-'vvcv-' ;ị

Hình Nỗn quan sát kính hiển vỉ ánh sáng thương, đọ phóng đại 200x (hình 1: nỗn GV, hình 2: nỗn hình 3: nỗn Mil Mũi tên đậm: túi mâm; Mũi tên mảnh: cực cầu 1)

Mi,

- Trong 218 nỗn trưởng thành có 170 nỗn trường thành nhìn thấy thoi vơ sắc (77,98%) 48 nỗn trưởng thành khơng nhìn thấy thoi vơ sắc (22,02%)

- Kết qua bảng cho thấy 170 noan trưởng thành nhìn thấy thoi vơ sắc có 115 nỗn (67,65%) có thoi vô sắc nằm sát với thể cực 1,40 nỗn (23,53%) có thoi vơ sắc lệch so vởi thề cực íừ 300 đển 600,10 nỗn (5,88%) có thoi vồ sắc vị trí từ 600 đến 1200 so với ỉhể cực 1, noãn (2,94%) cỏ thoi vơ sắc vị trí 00-18 00

Hình Nỗn Mil quan sáỉ kính hiển vi phân cực, độ phóng đại 200X (Mũi tên mảnh: thể cực Mũi ỉên đậm: thoi vơ sắc,hình phài thoi nằm bên thề cực 1, hình trái thoi vơ sắc cách thể cực góc 700)

- Nỗn trưởng thành nhin thấy thoi vơ sắc có tl lệ thụ tinh 69,41% nỗn trưởng thành khơng có thoi vơ sắc có íỉ lệ thụ tinh 39,58% Tỉ lệ thụ tinh hai nhóm có khác biệt có ý nghĩa thống kê với p

<0,0 1.

- Noãn trường thành nhìn thấy thoi vơ sắc có tỉ lệ phơi tốt 61,02% cao tỉ íệ phơi tốt nỗn trưởng thành không nhln thấy thoi vô sắc 36,84% Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0.05

BÀN LUẬN

- Trong nghiên cứu noãn phân tích thoi vơ sắc thời điểm 39 sau tiêm hCG, ià thời điểm mà Cohen cs 2004 quan sát thấy thói vơ sắc nỗn Mil có tỉ lệ cao nhát 81,5% [2] Quan sát 218 nỗn Mil có 170 nỗn nhìn tháy thoi vô sắc chiếm tỉ lệ 77,98%, kết tương đồng với kết Cohen cs 2004, Heindryckx cs 2011 P M ._

- Trong nghiên cứu, có 48 nỗn xuất thể cực lại khơng nhìn thấy thoi vơ sắc chiếm tỉ lệ 22,02% Đe giải thích nỗn xuất thể cực khơng nhìn thấy thoi vô sắc, Montag CS 2006 tiến hành quan sát ni cấy nỗn non kỹ thuật quay phim ngắt quãng cho thấy noãn MI đẩy cực cầu ra, thoi vô sắc tạo nên sợi liên kết cực cầu bào tương noãn thời gian 75 “ 90 phút Hình ảnh ghi nhận noãn kỳ cuối phân bào giảm nhiễm lần kính hiển vi phân cực Ngay sau ià thời gian trùng hợp thoi vô sắc khoảng 40 - 60 phút Như sau xuất the cực 1, phải sau 115 - 150 phút, thoi vô sắc lắp ráp bên thể cực Cho nên khơng tháy thoi vơ sắc nỗn ià nỗn trải q q trình phân bào giảm nhiễm [7]

- Trong kỹ thuật ICSÍ, vị trí thoi phân bào nỗn trưởng thành thường liên quan đến vị trị cùa thể cực Kim ICSI cần phải tránh thoi phân bào tiêm tinh trùng Tuy nhiên số nghiên cứu công bố thể

cực khơng dự đốn xác vị trí thoi phân bào [9] Do thoi vơ sắc tổn thương nằm cách xa thể cực Sử dụng kỉnh hiển V! phân cực giảm tổn thương thoi vơ sắc q trình ICSI Trong nghiên cứu cho thấy cỏ 10 noãn (5.88%) nằm vị trí từ 600 đến 1200 so với thể cực 1, vị trí kim tiêm tinh trùng xuyên qua nỗn vị trí gây tổn thương thoi vơ sắc Đề giải thích thay đổi Vị trí thoi vơ sắc so với cực cầu 1, người ta cho trinh tách tế bào nang bao quanh noãn cớ học làm xê dịch thể cực Một ỉý íà dịch lỏng màng bao quanh thoi vô sắc làm cho thoi vô sắc dịch chuyển [6]

- Lựa chọn noãn kỉnh hiển vi ánh sáng phân cực chứng minh dự đoán cao chất lượng noãn Như ket nghiên cứu Woodward 2008, nỗn trưởng thành nhìn thấy thoi vồ sắc thực ICSI cỏ tĩ lệ thụ tinh cao chất lượng phôi tạo vào ngày cao so với noân trưởng thành khơng nhìn thấy thoi vơ sắc [10] Trong nghiên cứu này, tỉ lệ thụ tỉnh hai nhóm nỗn trưởng thành nhìn thấy thoi vơ sắc khơng thấy thoi vơ sắc khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05) Kết nghiên cứu tương đồng với kết quà Cohen cs 2004, Heindryckx 2011 [2],[4]

- Có nhiều nguyên nhân iám cho IVF thất bại, trona ngun nhân bất thường nhiễm sắc the phôi 80% phôi lệch bội tạo IVF ià lôi phân bào giảm nhiễm noãn [3] Lỗi chia tách nhiễm sắc thể thường xảy trình phân bào giảm nhiễm lần Cơ chế có thễ íà iối giao thoa nhiễm sắc thể tương đồng ợ kỳ đầu phân bào giảm nhiễm !ần 1, xáo trộn tố hợp chia tách sớm nhiễm sắc tử Thoi vơ sắc kiểm sốt di chuyển nhiễm sắc thể xuyên suổt qua giai đoạn khác phân bào giảm nhiễm, đóng vai trò trung tâm thành cồng phân bào giảm nhiễm [2] Trong nghiên cứu nhóm nỗn nhìn thấy thoi vơ sắc có

tĩ lệ phơi tốt cao nhóm nỗn khơng nhìn thấy thoi vơ sắc Trong nghiên cứu Moon cs 2003 thực 626 nỗn Mil, nhóm nỗn cỏ íhoi vơ sắc cổ tỉ lệ phơi tốt 64,2% cao nhóm nỗn không thấy thoi vô sắc với tỷ lệ phôi tốt 35,9% (p <0,01), đồng thời tỉ lệ thụ tinh bị đa nhân (3PN, 4PN) nhóm nỗn nhỉn thấy thoi vơ sắc giảm so với nhỏm nỗn khơng nhìn thấy thoi vơ sac (5,9% 10,7%) [6]

KẾT LUẬN

Qua khảo sát đánh giá hình thái thoi vơ sắc kính hiển vi quang học có ánh sáng phân cực 218 noãn trường thành bệnh nhân thực kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm, chúng tơi sơ có số kết luận sau:

- Vị trí thoi vơ sắc thay đổi so với vị trí cực cầu 1, 67,65% nỗn có íhoi vơ sắc nằm gần kề với cực cầu 1, 5,88 % nỗn có thoi vơ sắc nằm gần vị trí điểm giờ, nơi kim tiêm tinh ỉrùng đâm vào nỗn kĩ thuật ICSI thơng thường Cịn lại 26,47% nỗn co thoi vơ sắc vị trí khác.

- Nhóm nỗn nhìn thấy thoi vồ sắc có tỉ !ệ thụ tinh chất íượng phơi tốt ngày cao nhóm nỗn khồng nhìn thay thoi vơ sắc

KĨÉN NGHỊ

Khi lựa chọn phôi chuyển vào buồng từ cung nên kết hợp đánh giá hình thái phơi VỚI chọn phơi có nauồn gốc từ nỗn trưởng thành đầy đủ có thoi vơ sac

HƯỚNG NGHIỀN c ứ u TIẾP THEO

Nghiên cứu bệnh nhân có độ tuổi khác nhau7

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Alpha Sciêntists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryo (2011) “The

Istabui consensus workshop on embryo assessment proceedings of an expert meeting” Human Reproduction 26(6): 1270-1283

2 Cohen Y, Malcov M, Schwartz, Raz Mey N, Carmon A, Cohen T, Amit A and Azem F (2004) “Spindle iamging: a new marker for optima! timing of iCSI?” Human Reproduction Vol.19, No.3 pp.649-654

3 Hassoid T, Hunt p (2001) “To err (meioticaily) is human the genesis of human aneuploidy” Not Rev Genet; :2 -2

4 Heindryckx B, Gheseile D s, Lierman s, Gerris J and Sutter D p (2011) “Efficiency of palarized microscopy as a predictive tooi for human ooộyte quality” Human Reproduction, Vol.26, No pp.535-544 _

5 Kathy L, Sharpe T, Randall L, Zimmer (2000), “Oocyte and Pre-Embryo Classification”, Hand book of the assisted reproduction laboratory, pp 179 -196

6 Moon J H, Hyun Ch s, Lee s w , Son w Y, Yoon s H, Lim J H (2003).”Visualization of the metaphase il meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSl” Human Reproduction Vo! 18; No Pp.817-820

7 Montag M, Schimming t, van der Ven H (2006) “•Spindie imaging in human oocyte the impact of the meiotic cell cycle Repro Biomed Online; 12:442-440

8 Palermo G, Joris H, Devroey p, Van steirteghem AC (1992) "Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte , Lancet, 340(8810), pp.17-18

9 Silva c s, Kapura K, Oldenboug R and Keefe D L (1999) “The first polar body doesn’t not predict accurately the location of the metaphase II meiotic spindle in mammalian oocytes, Fertii Reprod, 13, 719-721

10 Woodward B, Montgomery s, Hartshome G, Campbell K, Kennedy R (2008) “Spindle position assessment prior to ICS! does not benefit fertilization or early embryo quality Repro Biomed Online; 16: 232-238

CN Lê Đông Trúc

(Học viên Cao học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ ại hoc Quốc Gia TP.HỒ Chi Minh)

Hướng dằn: TS.BS Mai Phương Thảo

(Bộ mơn Sinh lý học, Khố Y, Đại học Y Dược TP.HỒ C hi Minh)

ĐẶT VẤN Đ ê - MỤC TIÊU

Bẹnh lý thần kinh di truyền Charcot-Marie-Tooth (CMT), hay gọi bệnh thần kinh vận động/cảm giác di truyền (HMSN - hereditary motor/sensory neuropathies} nhỏm rối loạn ảnh hưởng đa dây than kinh vận động cảm giác mãn tĩnh Trên giới có khoảng 2,6 trĩệu người mắc bệnh với tần suất mắc bệnh 1/2500 [2] Bệnh nhân CMT có triệu chứng điển hình la yếu chi teo cơ, thường kèm theo cảm giác rrìưc độ nhẹ - trung bình, giam phản xạ gân xương có biến dạng bàn chân hình vịm (pes cavus foot) Bệnh khơng gây tử vong tổn thương dây thần kinh dan đến yếu tiến tnen, biến dạng chi, cảm giác, khiến người bệnh lại khó khăn ảnh hưởng chất iượng sống Bệnh khởi phát độ tuổi với mức độ biểu lâm sàng

khác bệnh nhân £2,5] Chẩn đoán CMT dựa triệu chứng lâm sàng, kết hợp với bất thường kết điẹn ký va phân tích phả hệ, gen gay bệnh đỏng vai trị viẹc chần đốn xác định bệnh, phân type subtype CMT phân thành nhóm sáu: CMT type (thể tổn thương myelin), CMT type (thề tổn thương sợi trục),

CMT type (thể hỗn hợp) và CMT X (liên kết VỚI

nhiễm sac thể giới tính X) [3]

Phần lớn, bệnh CMT bị gây đột biến gen mã hoá protein có ỉiên quan đen cáu trúc chức sợi trục bao myelin dây thần kinh Đến nay, nghiên cứu phát 80 gen chịu trách nhiẹm gây bệnh CMT Bệnh di truyền trội lặn, nhiễm sắc thể thường hay liên kết với nhiểm sắc thể giới tính X Cùng kiểu hình (phenotype) CMT độí biến