Phát hiện gen mã hóa Beta-Lactamase phổ rộng blaTEM và blaCTX - M

Kêt quả khuêch đại g n bldcrx-M bằng phản ứng PCR đ n mồi: Với các chủng vi khuẩn có kiểu h nh ESBL (+), ngoài phát hiện gen bỉa-TBM, phản ứng PCR đơn mồi cũng được sử dụng để khuểch đại[r]

PHÁT HIỆN GEN MÃ HÓA BETA-LACTAMASE PHỐ RỘNG bỉarm VÀ blacTx-u Ở VI KHUẨN E COLI VÀ KLEBSIELLA PNEUMONIAE BẰNG

PHẢN ỨNG MULTIPLEX-PCR

Ths H oàng T h ị Hoa Diễm*

Hường dẫn: TS Nguyễn Đắc Trung* TÓM TẤT

Trong vài thập niên gần vi khuẩn kháng kháng sinh tạo vấn đề nghiệm trọng diều trị bệnh nhiễm khuẩn Sự xuất vi khuẩn sinh beta­lactamase phổ rộng (ESBLs, Extended spectrum beta lactamases), đặc biệt làE.coỉivàKlbsilla,pnumoniahiện mối quan tâm hàng đầu cho phát triển phương thức điều trị bệnh nhiễm khuẩn ESBLs gồm nhóm ỉà: TEM, CTX­M SHV, Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát gen ESBLbla-TEMvàblacĩM-Màcác chủngE.colivàKlbsilla,pnumoniaphân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm

sàng kỹ thuật multipiex­PCR Đối tượng nghiên cứu: 43 chủng E coli 24 chủng Kl bsi lla, pn umonia

phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên Bệnh viện Đại học Y khoa Thái

Nguyên Phương pháp nghiên cún: Các chủng vi khuẩn phân lập định đanh hệ thống máy tự động Viiek

2 compact 60 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn kiểm tra phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (Kỹ íhuật Kirby ­ Bauer) Khả sinh ESBL chủng vi khuẩn sàng lọc phương pháp khoanh giấy đôi (double­disk test) Gen mã hóa ESBLbla-ỉEMvàblữcix-uđược phát phản ứng PCR đơn mồi multiplex­PCR K ết quả: 17 chủngE.coỉi(39,53%) chủngK.pnumonia(33,33%) sinh ESBL; Có gia tăng

về mửc độ kháng kháng sinh chủng E coli K pn umonia sinh ESBL so vói chủng khơng sinh ESBL, đặc

biệt kháng sinh cephalosprin hệ 3; Như có liên quan khả sinh ESBL với mức độ đề kháng kháng sinh vi khuẩn Có chủngE.colivà chủngK.pnumonia mang gen bla-TEM(970 bp), gen

blaCTM­M(540 bp) t m thấy chủng E coỉi chủng K pn umonia Đặc biệt, chủng E coli mang đồng thời

cà genbla-muvàblữcm-u,có chủngE.colivà chủngK.pnumoniakhông t m thấy genbỉanào kể ưên Có

thể ESBL chủng vi khuẩn đo gen cịn lại bỉasỵv mã hóa Kết luận: Gen bỉa-TEMvà ủ/ữcTM­Mniã hóa beta­ lactamase phổ rộng t m sổ chùng vi khuẩn E coli K pn umonia nghiên cứu Hai gen

ESBL không tồn ỉại riêng lẻ mà t m thấy tồn số chủng vi khuẩn

* Từ khóa: Beta­lactamase phổ rộng; blarm t bỉacm-wí\ E coỉv, Kl bsi lla pn umonia ;Multiplex­PCR

Detection o f bỉdtem and blactx.m genes in c coli and Klebsiella pneumoniae strains by

muUiplex-PCR

Summary

For several decades, antibiotic­resistant bacteria have created a constant problem in therapy of bacterial infection The

emergence of extended­spectrum beta­lactamase (ESBL)­producing bacteria, particularly E coli and K pn umonia , is now a

critical concern for the development of therapies against bacterial infection ESBLs consist of major genetic groups: TEM, SHV, and CTX­M types This study was undertaken to detect genbla-TEMandblacm-Min £•coliandKlbsillapnumonia

isolated in Thai Nguyen Methods: A total of 43 strains of E coli and 24 strains of Kl bsi lla pn umonia isolated from

clinical specimens All strains were tested for antibiotic susceptibility and screened for production of extended­spectrum beta­ Iactamases (ESBLs) by double­disk test The amplification for ESBL genes ofbla-TEMandblacrx-Mwas also undertaken by single PCR and multiplex­PCR Results: The presence of ESBL was found in 17 of 43 isolates ofE.coli(39.53%) and of

24 isolates of K pn umonia (33.33%) There was an increase in the level of antibiotic resistance, especially with the third­

generation cephalosprins in strains ofE.coliandK.pnumoniaESBL(+) compared to non­ESBL strains There might be an

association between ESBL production to level of antibiotic resistance of these bacteria With ESBL­producing strains, gene

W^TEM(970 bp) was harbored by of 17 strains o fE COỈỈ and by o f strains of K pn umonia , of 17 strains of £ COỈÌ and

5 of strains of K pn umonia possesed gene bldcm-M (540 bp) Especially, two strains of E coli were found to carry both

genebla-TEMandblctcrM­M­ In fact, no targeted geneblawas detected in strains ofE.colland strain ofK.pnumonia. ESBLs in these strains could be encoded by genesbldsHv■Conclusion: Genes bla.1EM and bỉứcm-Mencoding extended­

spectrum beta­lactamases were found in several strains of E coli and K pn umonia Two ESBL genes existed not only

individually but also were found to co­exist in a number of bacterial species

Trong nhiều thập kỷ qua, áp lực chọn lọc kháng sinh tr lên vi khuẩn gây bệnh, đo kháng sinh không sử dụng hợp lý điều trị lâm sàng bệnh nhiễm khuẩn Áp lực chọn lọc làm xuất beta­lactamase khác số vi khuẩn gây bệnh Các beta­lactamase phổ rộng (ESBLs, extended­spectrum beta­lactamases) beta­lactamase tạo vi khuẩn gram âm, có khả thủy phân kháng sinh p­lactam có chứa nhóm oxyimino (cephalosporins hệ aztreonam), chúng lại bị ức ché chất ức chế p­lactamase acid clavulanic, sulbactam tazobactam [2] ESBLs thường mã hóa gen nằm plasmid t m thấy E coli, Kl bsi lla vi khuẩn gram âm khác [6] ESBLs phân thành loại ỉà TEM, SHV CTX­M [1, 10] Ở Việt Nam, việc phát chủng vi khuẩn gram âm sinh ESBLs dựa vào kết kỹ thuật khoanh giấy đôi (double­disk test) chưa phải xét nghiệm thường quy Thất bại việc phát khả h nh thành ESBLs kỹ thuật kháng sinh khuếch tán ghi nhận giới [7] Nhiều phịng xét nghiệm khơng ý thức vai írị ESBLs làm để phát chúng Sự thiếu hiểu biết thiếu nguồn lực để kiểm soát lan truyền ché đề kháng dẫn đến thất bại liên tiếp việc t m phương cách thích hợp giúp ngăn chặn xuất rộng rãi vi khuẩn gây bệnh sinh p­lactamase [9] Mục tiêu nghiên cứu: Phát g n ESBL blũTEM blcicTM-hí ỏ' chủng E coỉi Kl bsi lla pn um onia phân lập từ m ẫu bệnh p h ấ n lâm sàng kỹ thuật tnultìpỉ x-PCR

n ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Đổi tượng nghiên cứu

43 chủng E coli 24 chủng Kl bsi lla pn umonia phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên Bệnh viện Đại học Y khoa Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn phân lập định đanh hệ thống máy tự động Vitek compact 60 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn kiểm tra phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (Kỹ thuật Kirby ­ Bauer) Khả sinh ESBL chủng vi khuẩn sàng lọc phương pháp khoanh giấy đôi (double­disk test) Ở chủng vi khuẩn sàng lọc có kiểu h nh ESBL dương tính, cặp mồi tham khảo sử dụng để phát gen ESBL đặc hiệu tương ứng bla-yEM[4] bỉđcrx-M [8] phản ứng PCR đơn mồi phát đồng thời gen phản ứng multiplex­PCR DNA khuôn cho phản ứng PCR tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn theo phương pháp Cebula c s [5] Sử dụng mồi cho phàn ứng PCR đơn mồi multip ex­PCR bao gồm:

MOTBM-f: -TcggggaaaTgTgcgcg-3 ,

WaTEM­R^­TGCTTAATCAGTGAGGCACC^’, bỉacĩXM-V- 5’­ATGTGCAGYACCAGTAARGT­3\ bỉacrx-M-R: 5’­TGGGTRAARTARGTSACCAGA­3*

Hỗn hợp mix (hãng Thermo Scientific) cho phản ứng muItiplex­PCR gồm: 200 ịiM loại đNTP; 2,5 mM MgCI2; 0,2 pmol loại ADN mồi; Ư Taq ADN polymerase Ix đệm PCR (20 mM Tris­HCI, pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước khử ion tới thể tích 25 ịil Phản ứng PCR thực hệ thống luân nhiệt vói chu tr nh nhiệt: phút biến tính 94°c, 30 chu kỳ (94°C/50 giây­50°C/40 giây­ 72°c/l phút), chu kỳ tổng hợp cuối 72°c/10 phút Kiểm tra hiệu tr nh khuếch đại kích thước sản pham PCR gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide

r a KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh cửa E coli Kl bsi lla pn umonia sinh ESBL

Sau có kết kháng sinh đồ với chủng E coli K pn umonia , chủng vi khuẩn nghi ngờ sinh ESBL (có đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh: cefotaxime < 27 mm, ceftriaxone < 25 mm ceftazidime < 22 mm) kiểm tra khả sinh ESBL (kiểu h nh ESBL (+)) phương pháp khoanh giấy đơi Kết cho thấy có 17/43 chủng E coli (39,53%) 8/24 chủng K pn umonia (33,33%) có kiểu h nh ESBL ( +)

Thực tế íừ số kết nghiên cứu thực Việt Nam giới gần cho thấy khả sinh ESBL hai loại vi khuẩn ỉuôn khác [3 ,4 ,7J

ESBL(-) 52.94 50.00“_ 50.00

7.05ũ m -»47.05

AMC CXM CR O C TX CAZ FEP MEM

Kháng sinh DO CIP OFX

Biểu đồ Tỷ íệ kháng kháng kháng sinh E coli ESBL(+) E coli ESBL(­)

Tỷ lệ

100 ị

90 80 -70

60 i

50 -40 30 -20 - 8.7 10

-0

85.70 ESBL(­)ESBL(+)

AMC CXM CRO CTX CAZ FEP MEM DO CIP

K háng sinh

Biểu đồ Tỷ lệ kháng kháng sinh K pn umonia ESBLO) K pn umoniá ESBL(­)

3.2 Kết khuếch đại gen ESBL b ng kỹ thuật PCR

3.2.1 Kết qaả khuếch đại gen ESBL b ng kỹ thuật PCR đơn mồi

Kêt khuếch đại g n bla-TEMbằng phàn ứng PCR đ n mồi: Theo tính tốn lý thuyết, với việc sử dụng cặp môi bỉa-rm phản ứng PCR, mộE đoạn băng ADN có kích thước 970 bp khuếch đại chủng gen genome cho kết âm tính

1500 bp 1000 bp 750bp 500 bp 25Gbp

H nh Kết khuếch đại gen bỉa-YEMbằng PCR đơn mồi

M Mark r G nRul r™ ìkb; ỉ A25; CỈ5; B5; C5; C10; C12; C27; Chứng âm

Phân tích kết điện di h nh cho thấy phân đoạn ADN khuếch đại có kích thước khoảng 970 bp hồn tồn phù họp vói tính tốn lý thuyết Trên đường chạy số 1, ­ tương ứng với chủng A25 B5 C5, CỈ0, C Ỉ2 C27 thấy xuất băng ADN có kích thước khoảng 970 bp Như những chủng đeu cho ket dương tính với gen bỉãTEM- Riêng chủng € 15 không thấy xuất băng ADN tương tự (âm tính với gen blajEu) Có thể chủng vi khuẩn mang gen lại blacTK-Mvà blaSHV? Két phản ứng PCR với cặp mồi bỉa-xm cho thấy: chủng vi khuẩn E coli ESBL (+) va chung K pn umonia ESBL (+) mang gen blãjEM­

Kêt khuêch đại g n bldcrx-M phản ứng PCR đ n mồi: Với chủng vi khuẩn có kiểu h nh ESBL (+), ngồi phát gen bỉa-TBM, phản ứng PCR đơn mồi sử dụng để khuểch đại gen bỉacrx-M­ Sử dụng cặp mơi tương ứng cho gen blaCTx-Mvà tính tốn lý thuyết, phản ứng PCR tạo sản phẩm băng ADN đặc hiệu có kích thước khoảng 540 bp

1500bp lOGObp 750bp 500bp 250bp

H nh Kết khuếch đại gen bỉãcTK-Mbằng PCR đơn mồi

Kết điện di h nh cho thấy phân đoạn ADN khuếch đại vói cặp mồi bldcTĩt­M có kích thước khoảng 540 bp, hồn tồn phù hợp với lý thuyết tính tốn Trên đường chạy sổ 1, ­ tương ứng với chủng vi khuẩn A25, C12, C15, C17, C Ỉ8 C19 cho kết dương tính với gen Wacrx­M (xuất băng ADN có kích thước khoảng 540 bp) Riêng chủng B5 C20 không xuất bang ADN vị trí tương tự chủng cho két dương tính với gen đích cần phát Có thể ESBL chủng vi khuẩn gen cồn lại bldsm mã hóa? Với việc sử dụng cặp mồi blacTx-M, kêt phản ứng PCR cho thấy: chủng vi khuẩn E: coỉi ESBL (+) chủng K pn umonia ESBL (­f) mang gen bỉacTX­M­

Kết từ phản ứng PCR với hai cặp mồi riêng rẽbỉa-ỉẼMvà bỉacTx-M cho thây chủng E coỉi U C Ị ) T } H ỉcuỉg u v u g lu v /i v a iíữ i g v i im ^ ữ f k r w « v vr

Từ kết khuếch đại gen đích phản ứngPCR với cặp mồi đơn nghiên cứu cho thấy: chủng vi khuẩn A22, A28 C20 cho kết âm tính với gen, chúng có kiểu h nh ESB L (+) Có thể gen mã hóa cho ESBL chủng vi khuẩn thuộc nhóm gen khác với gen cần t m mà khuôn khổ nghiên cứu chưa có điều kiện t m hiểu thêm gen Trên thực tê, với số lượng kiểu gen ESBL vô phong phú (đo đột biến gen ESBL t m thấy đầu tiên), việc sử dụng vài cặp mồi để phát gen đích ESBL bỏ sót khơng t m thấy gen chủng vi khuẩn sinh ESBL Hiện tượng không t m thấy gen ESBL chủng K pn umonia chủng E coli kháng cephalosporin phổ rộng đề cập tởi nghiên cứu Van Cao c s tiến hành Việt Nam năm 2001 [4] Két thực té gợi ý xuất ESBL chủng vi khuẩn chúng cần nghiên cứu bổ sung Kết phan ứng PCR đơn mồi nghiên cứu cho thấy có chủng vi khuẩn E coli ESBL (+)

mang đồng thời hai gen ESBL làbiaTEMvàblacDC­M­ Hiện tượng chủng vi khuẩn gram âm It c

mang hai nhiều loại gen ESBL khác số nghiên cứu ữên giới Việt Nam đề cập tới,

v í dụ kết hợ p củabla-TEM+ bidsHV,bỉacĩỉÍ­M+bĩaSHV[1, ,7 ], bỉa-YEM+bỉacrx­M [5 ,7 ],bla-TEM+ bỉacrx-M

+ blasHv [5, 7] Việc chủng vi khuẩn gây bệnh lúc sở hữu nhiều gen ESBL khác giúp chúng tăng khả đề kháng kháng sinh p­lactam, đặc biệt, kháng sinh có phổ tác dụng rộng thuộc nhóm Hiện tượng cho thấy áp lực chọn lọc kháng sinh ngày gia tăng, vi khuẩn gây bệnh đần h nh thành cỡ chế đề kháng phức tạp, phối hợp nhiều cách thức đề kháng khác để làm giảm hiệu lực tác động kháng sinh lên chúng

3.2.2 Kết khuếch đại gen ESBL b ng kỹ thuật multiplex-PCR

Bằng phản ứng PCR đơn mồi, sử đụng cặp mồi riêng rẽ với tất chủng E coli K pn umonia sinh ESBL, kết phát hai gen bla-ĩĩM bỉaCTX-M- Từ kết đó, phản ứng muỉtiplex­PCR thực vói việc sử đụng hai cặp mồi cho kết PCR dương tính blaTEMvà bỉacTK-M đê khuêch đại đồng thời hai gen ESBL tương ứng

H nh Kết khuếch đại gen blajEMvà bỉacTx-M multiplex­PCR

M Mark r GẻnRuỉ /M ỉkb; l Chúng âm; B5 (bỉa-ĩm); B5 ịbỉdcĩXM); 4, B5 (mulúpl x-PCR bỉaTEM

blacrx-ù),' A25 (bĩarm )ỉ ổ A25 (bla rx-i/ủỉ 7' ^ 25 (multipỉ x-PCR blarm bỉacĩx-M); CỈ5 (bỉữrm);

­ Chủng B5: đưòng chạy số (PCR với bỉaTEìÀ) đường chạy số (multiplex­PCR) xuất băng ADN có kích thước khoảng 970 bp; đường chạy số (PCR với bỉacrx-ù) không xuất băng ADN Kết luận: chủng B5 mang gen bla-ĩEM

­ Chủng A25: đường chạy số (PCR vói bla-mù) đường chạy số (multiplex­PCR) xuất băng ADN có kích thước khoảng 970 bp; đường chạy số (PCR với bỉacrx-ù) đường chạy số (multiplex­PCR) xuất băng ADN có kích thước khoảng 540 bp Kết luận: chủng A25 mang gen blữTEM

bỉacĩx-M Ghùng C15: đường chạy số (PCR với bỉdcTx-M) đường chạy số 10 (multiplex­PCR) xuất

1 băng ADN có kích thước khoảng 540 bp; đường chạy số (PCR với bỉa-mÀ) không xuất băng ADN Kết luận: chủng B5 chi mang gen

blacĩx-u-Các phản ứng multiplex­PCR với tất chủng vi khuẩn ESBL (+) nghiên cứu cho kết phù hợp với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đơn lẻ {bla-ĩKM bỉacrx-M)- Như vậy, cho kết giống nhau, nhận thấy việc tiến hành phạn ứng multiplex­PCR để phát gen bla có hiệu cao so với việc tiến hành phản ứng PCR đơn mồi, VỚI hiệù tiết kiệm thời gian thực phản ứng, tiết kiệm hóa chất, vật tư tiêu hao

Bảng Kiểu gen ESBL bla t m thấy chủng vi khuẩn

Kết điện di từ h nh cho thấy:

Vi khuẩn (Sổ chửng) Sổ chiíng vỉ khuẩn mang gen

bỉữjẼM blacm.-u è^TEM+CTX Âm tính

E.coli( 17) 2

K pn umonia (8)

Tổng số (25) 11(44,0%) 9(36,0%) (8,0%) (12,0%)

Bằng phản ứng PCR đơn mồi muitipIex­PCR khuếch đại gen ESBL cần t m, kết cho thấy gen blaTEMvà bldcĩx-M t m thấy vi khuẩn E coli K pn umonia Trong đó, 44% số chủng ESBL (+)

mang genbỉa-ĩEMvà 36% mang genbỉacTK-M• GenbỉaTEM chủ yếu t m thấy ởE.coli, đó, gen

bỉcicTX­Mlại thường t m thấy vi khuẩn K pn umonia Sự kết họp hai gen bla-ĩEM bỉacm-M t m

thấy du y chủng E coỉi C ả hai gen bla-TEM blũcĩXM khôn g t m th chủng E, colỉ chủng

K pn umonia

Trong nghiên cứu này, tượng vi khuẩn E coli K pn umonia mang chủ yếu gen bỉa-TEM bỉacTX­Mcũng tương ứng với kết nghiên cứu Van Cao c s tiến hành Việt Nam

Nghiên cứu tiến hành 43 chủng E coli 24 chùng Kl bsi lla pn umonia , kết thu sau:

­ Có 17 chủng E coỉi (39,53%) chủng Kl bsi lla pn umonia (33,33%) sinh ESBL,

­ Tỷ lệ kháng kháng sinh cephalosporin hệ gia tăng (cefuroxime, ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime) chủng E coỉi K pn umonia sinh ESBL so với chủng vi khuẩn không sinh ESBL

­ Gen bla-TEM (970 bp) t m thấy 9/17 chủng E coli ESBL (+) 2/8 chủng Kl bsi lla pn umonia ESBL O)

» Gen Mỡctx­m (540 bp) t m thấy 4/17 chủng E coỉi ESBL (+) 5/8 chủng Kl bsi lla pn umonia ESBL(+)

­ Có chủng E coli ESBL (+) mang gen bỉa-ĩEMvà bldcrx­M­

­ Có chủng K coli ESBL (+) chủng Kl bsi lla pn umonia ESBL (+) không t m thấy gen bla đích KHUYẾN N GHỊ

­ Tiếp tục nghiên cứu thêm phân bố gen ESBL chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp ­ Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen ESBL t m thấy

TÀI LIỆU THAM KHẢO

i Bonnet R Growing group of extendcd­spectram Ị3­lactamases: the CTX­M enzymes Antìmicrob Ag nts Ch moth r

2004,48:1­14,

2 Bradford PA Extenđed­spectrum p­lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat Clin Microbiol R v 2001,14:933­951

3 Canton R, Novais A, Valverde A, Machado E, Peixe L, Baquero F, et al Prevalence and spread of exiended­ spectrum beta­Iactamase­producing Ent robact riac a in Europe Clin Microbiol Inf ct 2008,14(1):144­I53

4 Cao V, Lambert T, Nhu DQ, et al Distribution of extended­spectrum P­lactamases in clinical isolates of

Entrobactriacain Vietnam.Antimicrobialagntsandchmothrary.2002,46(12):3739­3743

5 Cebula TA, Payne WL and Fegn p Simulataneous identification of strains of Esch richia coli serotype Oi57:H7 and theữ Shiga­like toxin type by mismatch amplification mutation assay multiplex­PCR J Clin Microbiol 1995,

33(1):248­250

6 Emery CL, Weymouth LA Detection and clinical signifi cance of extended­ spectrum p­lactamases in a tertiary­ care medical center J Clin Microbiol 1997, 35:2061­2067

7 Jacob s, Shiri NV, Inna c , Orly HM, Azita L, Howard SG, et al Extended­spectrum beta­lactamases among Ent robact r isolates obtained in Tel Aviv, Israel Antimicrobial agents and chemotherapy 2005,49(3):1150­1156

8 Jemima SA, Verghese s Multiplex PCR for Ễỉữcix­M and blasm in the extended spectrum beta lactamase (ESBL) producing Gram­negative isolates Indian J M d R s 2008, 128:313­317

9 Paterson DL,Yu VL Extended spectrum beta­lactamases: a call for improved detection and control.ClinInfct

Dis.1999,29:1419­1422

10 Pitout JD, Wei Y, Church DL, Gregson DB Surveillance for plasmidmediated quinolone resistance determinants in Ent robact riac a within the Calgary Health Region, Canada: the emergence of aac(6_)­Ib­cr J Antimicrob Ch moth r 2008, 61:999­1002