Nghiên cứu cấu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide monooxygenase bằng tính toán lượng tử

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Nghiên cứu cầu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide monooxygenase tính tốn lượng tử Số hợp đồng: Chủ nhiệm đề tài: Lê Ngọc Chính Đơn vị cơng tác: Viên kỹ thuật công nghệ cao Ntt Thời gian thực hiện: năm TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng năm 2019 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Nghiên cứu cấu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide monooxygenase tính tốn lượng tử Số hợp đồng : Chủ nhiệm đề tài: Lê Ngọc Chính Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao Ntt Thời gian thực hiện: năm Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan cơng tác Vũ Bảo Khánh Hóa học Viện KT-CNC TNT Lê Ngọc Chính Vật lý Viện KT-CNC NTT Ký tên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PMO - Polisaccharide monooxygenases Q166 – Glutamine 166 Q166A - Dạng đột biến glutamine 166 thành alanine A – Alanine F – Phenylalanine T – Tyrosine E – Glutamic acid DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.0 – trang Hình 1.2 – trang Hình 2.2 – trang Hình 3.1 – trang 10 Hình 3.2 – trang 11 Hình 3.3 – trang 12 Hình 3.4 – trang 12 Hình 3.5 – trang 13 Bảng – trang Bảng – trang Bảng – trang TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm thực đạt Sán phẩn đăng ký thuyết minh Cấu trúc tối ưu hóa dạng tự Cấu trúc tối ưu hóa dạng tự nhiên dạng đột biến tâm hoạt nhiên dạng đột biến tâm hoạt động hai protein MtPMO3* (PDB ID động hai protein MtPMO3* (PDB ID 5UFV) CelS2 (PDB ID 4OY7) 5UFV) CelS2 (PDB ID 4OY7) Một báo cấp trường Một báo cấp trường Thời gian đăng ký : từ tháng 3/2018 đến tháng 3/2019 Thời gian 28/3/201 nộp báo cáo: ngày MỞ ĐẦU Nghiên cứu sử dụng cơng cụ tính tốn lượng tử nhằm mục đích thực tính tốn tối ưu hóa cấu trúc không gian cấu trúc electron tâm hoạt động protein CelS2 MtPMO3* dạng tự nhiên đột biến CelS2 MtPMO3* enzyme thuộc họ enzyme polysaccharide monooxygenase, họ enzyme có khả làm tăng mạnh hoạt tính thủy phân cellulose có đóng vai trị lớn cơng nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học Qua tính tốn, thu thành công cấu trúc tối ưu hóa dạng đột biến dạng tự nhiên hai enzyme kể đưa kết luận sau: Thứ nhất, cấu trúc dạng tự nhiên CelS2 có khả nhận thêm phân tử nước để tạo thành dạng phối trí lưỡng chóp tam giác; cấu trúc dạng đột biến gợi ý số phối trí tối đa mà CelS2 nhận Thứ hai, cấu trúc dạng tự nhiên đột biến cho thấy quan trọng phối tử Q166 việc ổn định cấu trúc mạng lưới liên kết hidro tâm hoạt động MtPMO3* Thứ ba, kết tính tốn cấu trúc CelS2 đưa giả thuyết mối tương quan cấu trúc tranh tiến hóa PMO, giả thuyết cần làm rõ thêm nghiên cứu ` Hình 1.0: A: Mơ hình phân hủy cellulose PMOs enzyme cellulase B: Cấu trúc PMO tâm hoạt động đơn nhân đồng bề mặt cellulose C: Phân cắt lien kết glycosidic phản ứng oxi hóa xúc tác PMO CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nhiên liệu sinh học sản suất từ sinh khối (biomass) phát triển mạnh mẽ giới Theo báo cáo Năng lượng Hoa Kì, 1.3 tỉ sinh khối thực vật sản xuất cung cấp cho khoảng 30% nhu cầu nhiên liệu Hoa Kì [1], sản phẩm lượng sinh học hóa học có xuất xứ từ thực vật cho tỉ suất lợi nhuận cao dầu mỏ Thanh phần sinh khối dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học cellulose Thủy phân cellulose thành loại đường lên men giai đoạn chậm có chi phí cao q trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối [2] Trong cơng nghiệp, để hóa lỏng cellulose, người ta sử dụng phối hợp nhiều loại enzyme cellulase khác nhau, bao gồm cellobiohydrolase I (CBHI), cellobiohydrolase I (CBHII), endoglucanase, beta-glucosidase [3] Các liên kết hydro phức tạp phân tử cellulose cản trở enzyme tách chuỗi cellulose khỏi chất, qua làm chậm phản ứng thủy phân [4] Gần đây, polysaccharide monooxygenase (PMO) phát có khả làm tăng mạnh hoạt tính thủy phân cellulose cellulose PMO bẻ gãy lien kết bề mặt chất cellulose, tạ đầu chuỗi dễ dàng bị thủy phân celullase (Hình 1A) Phối trộn PMO với cellulose làm tăng hoạt tính thủy phân lên ần, qua giúp làm giảm phần lớn chi phí giai đoạn Tâm hoạt động đơn nhân đồng phối trí nguyên tử nitrogen đơn phân histidine, His1 (ở đầu N) phối trí dạng (Hình 1B) Các liên kết Cu-Nε2 Cu-Nδ1 có độ dài ~2.00 Å) ngắn so với liên kết Cu-Nam (~2.2 Å) Ngoài phối tử N, trạng thái oxy hóa, trung tâm Cu(II) cịn phối trí phối tử O từ phân tử nước (O aq1 Oaq2) Trong nhiều PMOs, đơn phân tyrosine (Y168) tham gia phối trí với trung tâm Cu(II) thông qua nguyên tử OTyr Tạo cấu trút bát diện kéo dài Tâm hoạt động hoạt hóa O2 bẻ gẫy liên kết glycosidic thơng qua phản ứng hydroxy hóa liên kết C-H (Hình 1C) Cấu trúc tính chất điện tử tâm hoạt động vi chỉnh amino acid nằm vịng bán kính 5-6 Å tính từ tâm đồng Các amino acid với số phân tử nước tạo thành hệ thống liên kết hidro với phối tử trung tâm Cu(II) Các liên kết hydro làm thay đổi mật độ electron phối tử, qua làm thay đổi tính chất điện tử ion Cu(II) Hơn nữa, liên kết hydro góp phần vi chỉnh vị trí phối tử Oaq1 Oaq2 3 PMO sử dụng trung tâm hoạt động đơn nhân đồng để hoạt hóa oxy Cấu trúc tính hất điện tử trung tâm hoạt động đóng vai trị định đến hoạt tính enzyme Những thay đổi nhỏ cấu trúc trung tâm hoạt động dẫn tới việc giảm mạnh hoạt tính PMO [5,7] Cấu trúc trung tâm Cu(II) thường bị quang khử (photoreducted) phần toàn thành Cu(I) chùm tia X-ray cường độ cao sử dụng thí nghiệm nhiễu xạ đơn tinh thể protein Các cấu trúc tinh thể thường không phản ánh chất trung tâm Cu(II) PMO, qua làm cản trở hiểu biết chế hoạt động PMO hạn chế việc phát triển ứng dụng enzyme Do đó, việc nghiên cứu cấu trúc trung tâm Cu(II) PMO phương pháp tính tốn lượng tử cần thiết Trong PMO MtPMO3* có nguồn gốc từ nấm sợi Myceliophthora thermophile (PDB ID 5ufv), glutamine Q166 thay alanine (A166), liên kết hydro Q166 OTyr Oaq1 (Hình 2A) bị phá vỡ Dạng tự nhiên thể đột biến Q166A (Q166A-MtPMO3*) nghiên cứu phổ cộng hưởng từ electron (EPR), loại phổ cho thông tin trực tiếp cấu trúc electron trung tâm thuận từ Cu(II) Tín hiệu EPR Q166A-MtPMO3* thay đổi đáng kể so với dạng tự nhiên, dẫn tới giả thuyết OTyr liên kết yếu với ion Cu(II) [5] Tuy nhiên, giả thuyết chưa kiểm chứng nghiên cứu cấu trúc hay tính toán lượng tử Trong dạng tự nhiên PMO CelS2 có nguồn gốc từ Streptomyces coelicolor (PDB ID 4oy7), Y168 thay amino acid phenylalanine (F168) Phenylalanine có cấu trúc tương tự tyrosine nhưn khơng chứa nhóm OTyr, khơng phối trí với trung tâm Cu(II) (Hình 2B) Hệ liên kết hydro CelS2 khác biệt đáng kể so với hệ liên kết hydro MtPMO3* Sự diện A142 vị trí axial gây cản trở cho việc tham gia phối trí Oaq2 dẫn tới việc phối tử không quan sát thấy cấu trúc tinh thể CelS2 Như cấu trúc quan sát trung tâm Cu(II) CelS2 có dạng gần vng phẳng Hình 2B [6] Tuy nhiên, vắng mặt Oaq2 gây quang khử (photoreduction) ion Cu(II) thành Cu(I) tia X-ray có cường độ cao sử dụng thí nghiệm nhiễu xạ đơn tinh thể cho protein Ngoài ra, F168 CelS2 thay tyrosine alanine, tín hiệu EPR thay đổi tương tự quan sát trường hợp MtPMO3* Sự thay đổi việc xếp lại vị trí Oaq1 tham gia phối trí phối tử [7] Như vậy, tính tốn lượng tử cần thực để hiểu rõ chất trung tâm Cu(II) CelS2 4 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để thực nghiên cứu, cấu trúc đầu vào chọn từ cấu trúc X-ray đơn tinh thể enzyme chỉnh sửa lại với phần mềm Pymol Các cấu trúc tối ưu hóa chọn khoảng cách 5-6 angstrom tính từ tâm đồng Các phối tử chọn bị cap nhóm NME (-CH3-NH) nhóm ACE(CO-CH3) Một số nguyên tử cố định để làm giảm thời gian tính tốn Một số phân tử nước đưa vào cấu trúc số vị trí để xem xét khả nhận thêm nước tạo phối trí với tâm hoạt động đồng Tính tốn lượng tử sử dụng hệ máy tính trang bị với CPU Dual Xenon E52670 16core/32theards, RAM DDR3 EEC 32GB Tồn tính tốn thực phần mềm Gaussian 09 với phiếm hàm B3LYP bassic set 6-31g(d) Mỗi loại cấu trúc tối ưu hóa mơ hình chất điện mơi bao gồm nước, diethylether chân khơng Tối ưu hóa mơi trường chất điện môi thay đổi giúp cho có mối tương quan thay đổi số điện môi cấu trúc tâm hoạt động Các cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến tối ưu hóa để so sánh với dạng tự nhiên chúng: Trong họ PMO, tyrosine thường phối tử nằm trục dọc đa số cấu trúc tâm hoạt động, với AA10, tyrosine bị thay thành phenylalanine Ở CelS2, việc tạo đột biến cho phối tử phenylalanine thành tyrosine alanine nhằm nêu bật lên vai trò phối tử đến cấu trúc tâm hoạt động Ở enzyme MtPMO3*, phối tử glutamine bị thay thành glutamic acid alanine Glutamine phối tử phân cực, glutamic acid phối tử có điện tích alanine phối tử không mang điện Sự thay đổi phối tử nhằm mục đích quan sát biến đổi mạng lưới liên kết hidro Mạng lưới liên kết có vai trị quan trọng chuỗi phản ứng việc ổn định cấu trúc Hình 1.2: A: Cấu trúc điển hình tâm hoạt động PMO dạng oxi hóa Cu(II) với tyrosine phân tử nước hai đầu trục dọc cấu trúc bát diện Các nguyên tử Cu, C, O, N, H hiển thị màu cam, xanh ghi, đỏ, xanh dương, trắng Các đường nét đứt màu vàng hiển thị liên kết hydro B: Cấu trúc CelS2 (PDB ID 4oy7) Các nguyên tử Cu, C, O, N, H hiển thị màu cam, xanh nhạt, đỏ, xanh dương, trắng Các đường nét đứt hiển thị liên kết hydro Hình 2.2: A: cấu trúc input mơ hình CelS2 dạng tự nhiên, B: cấu trúc input mơ hình 4oy7 dạng đột biến F168Y, C: cấu trúc input mơ hình 4oy7 dạng đột biến F168A D: cấu trúc input mơ hình MtPMO3* dạng tự nhiên, E: cấu trúc input mơ hình 5ufv dạng đột biến từ Q166E, F: cấu trúc input mơ hình 5ufv dạng đột biến Q166A 6 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ CelS2 (PDB id: 4oy7) Cũng cấu trúc toàn thể tâm hoạt động, phối tử Phenylalanine không cho thấy thay đổi lớn q trình tính tốn Thêm nữa, với phương pháp tính tốn cho trường hợp 4opb 5tki, kết lý thuyết thực nghiệm thu trùng khớp Từ đó, ta có sở để tự tin vào phương pháp mơ hình hóa kết tính tốn cho phối tử bị đột biến Bởi cấu trúc trường hợp đột biến phenylalanine thành tyrosine (F166Y) chưa xác định, tyrosine cố định alpha carbon thả tự trình tối ưu hóa Cấu trúc tối ưu hóa trường hợp đột biến tyrosine cho thấy vặn xoắn cấu trúc ligand tyrosine, tyrosine bị xoay ba trường hợp chất điện môi Điều cho thấy cấu trúc không gian CelS2 hạn chế dẫn đến việc khoảng không cho tyrosine không đủ để phối tử cố định cách bình thường cấu trúc active-site Trong đó, kết trường hợp đột biếnvới alanine không ngạc nhiên, thay phối tử chiếm khoảng không lớn thành phối tử chiếm không gian nhỏ giúp cho phân tử nước di chuyển vào phối trí với đồng thành dạng chóp phẳng ` Bảng 1: Các thông số cấu trúc tâm hoạt động chọn lọc từ kết tính tốn mơ hình enzyme CelS2 (4oy7) Với Phe kí hiệu cho mơ hình dạng tự nhiên, Tyr kí hiệu cho mơ hình dạng đột biến từ phenylalanine thành tyrosine(F166Y), Ala kí hiệu cho mơ hình dạng đột biến từ phenylalanine thành alanine(F166A) vac kí hiệu cho chất điện mơi chân khơng, sol kí hiệu cho chất điện mơi diethylether wat kí hiệu cho chất điện mơi nước Cu- Nδ chiều dài từ Cu đến Nδ, tương tự cho cột khác Các cột chiều dài có đơn vị angstrom Cột cuối góc hợp vector Cu- Nδ vector Cu- Nε, có đơn vị độ Chỉ có mơ hình Tyr_vac, Tyr_sol Tyr_wat có chiều dài khoảng cách Cu nguyên tử oxi tyrosine.AA13 kí hiệu cho mơ hình tối ưu hóa protein NCU08746thuộc họ AA13 AA9 kí hiệu cho mơ hình tối ưu hóa protein NCU01050thuộc họ AA9.Phần bơi đen thuộc khoảng cách đồng nguyên tử oxi tất mơ hình có tyrosine Tất liệu tính tốn AA13 AA9 chưa công bố [8] 7 Cu-Nδ Cu-Nε Cu-Nam Cu-Ow/Otyr Cu-Ow Theta Phe_vac 2.15 2.24 2.087 2.495 1.894 8.0 Phe_sol 2.127 2.263 2.077 2.497 1.907 8.0 Phe_wat 2.118 2.275 2.074 2.493 1.914 8.1 Tyr_vac 2.117 2.357 2.059 2.183 1.961 20.7 Tyr_sol 2.403 2.046 2.199 1.963 20.5 Tyr_wat 2.061 2.46 2.037 2.184 1.962 22.3 Ala_vac 2.075 2.081 2.096 2.2 1.977 8.1 Ala_sol 2.051 2.098 2.09 2.21 1.99 8.1 Ala_wat 2.043 2.105 2.091 2.21 1.992 8.1 AA13_vac 1.951 1.977 2.065 2.326 2.098 25.3 AA13_sol 1.946 1.975 2.069 2.379 2.081 24.0 AA13_wat 1.945 1.977 2.072 2.413 2.061 23.6 AA9_vac 1.918 1.914 2.048 2.356 2.079 3.238 19.2 AA9_sol 1.91 1.91 2.044 2.591 2.067 2.653 10.8 AA9_wat 1.905 1.91 2.044 2.875 2.067 2.438 4.7 2.086 Bảng 2: Natural spin density số nguyên tử chọn lọc Đơn vị a.u – atomic unit Cu Nδ Nε Nam Ow Ow2 Phe_vac 0.634 0.087 0.081 0.068 0.127 Phe_sol 0.637 0.095 0.077 0.076 0.115 -0.001 Phe_wat 0.639 0.098 0.075 0.08 0.108 -0.001 Tyr_vac 0.652 0.085 0.057 0.111 0.077 0.002 0.012 Tyr_sol 0.652 0.093 0.05 0.116 0.073 0.01 0.012 Tyr_wat 0.653 0.096 0.043 0.119 0.073 0.01 0.014 Tyr_vac 0.651 0.088 0.1 0.095 0.068 0.01 Tyr_sol 0.65 0.096 0.09 0.102 0.066 0.01 Tyr_wat 0.65 0.1 0.86 0.102 0.066 0.01 Otyr/Ow3 Mật độ spin cấu trúc đưa bảng Ta thấy có thay đổi lẫn mật độ spin tăng số điện môi lên Giữa mơ hình đột biến dạng tự nhiên, có thay đổi lớn mật độ spin phối tử nước planar Trong đó, mật độ spin phối tử nước planar bị sụt giảm dạng đột biến so với dạng tự nhiên Điều khả trao nhận electron phối tử axial protein bị suy giảm đáng kể làm ảnh hưởng đến khả phản ứng MtPMO3* (PDB id: 5ufv) Bảng 3: Cấu trúc tối ưu hóa mơ hình MtPMO3* với kí hiệu tương tự với mơ hình CelS2 Cu-Ow1 chiều dài Cu oxi phối tử nước vị trí axial, Cu-Ow2 chiều dài Cu oxi phối tử nước vị trí planar Đơn vị chiều dài angstrom đơn vị góc độ Cu-Nδ Cu-Nε Cu-Nam Cu-Otyr Cu-Ow1 Cu-Ow2 theta3 glu_vac 1.987 1.939 2.05 2.683 2.415 2.019 8.6 glu_sol 1.94 2.05 3.06 2.33 2.023 4.4 glu_wat 1.9799 1.946 2.05 3.308 2.32 2.021 2.9 agl_vac 1.984 1.954 2.045 2.76 2.492 1.944 10.2 agl_sol 1.981 1.953 2.045 2.837 2.413 1.97 6.0 agl_wat 1.977 1.954 2.041 2.833 2.401 1.99 5.2 ala_vac 1.975 1.935 2.055 3.771 2.287 2.018 6.9 ala_sol 1.971 1.94 2.052 3.785 2.289 2.025 6.6 1.945 2.049 3.771 2.298 2.029 6.4 1.98 ala_wat 1.971 Trong mơ hình cấu trúc tối ưu hóa dạng tự nhiên, ngồi hai phối tử nước phối trí với tâm hoạt động đồng, cịn có phối tử nước gây phối trí tạo thành mạng liên kết hidro cho tâm hoạt động Kết tối ưu hóa cấu trúc cho thấy khác biệt lớn cấu trúc gây đột biến phối tử glutamine Khi gây đột biến glutamine thành acid glutamic, mạng lưới liên kết hidro bị thay đổi Ở trường hợp dạng tự nhiên, phối tử nước thứ không tạo liên kết với phối tử glutamine trường hợp dạng đột biến, phối tử nước thứ tạo thành liên kết với acid glutamic Tuy nhiên so sánh cấu trúc hai trường hợp này, cấu trúc vùng phối trí với nguyên tử đồng không thay đổi so sánh với trường hợp đột biến glutamine thành alanine Đột biến glutamine thành alanine gây ảnh hưởng lớn đến cấu trúc tâm hoạt động đồng Trong đó, phối tử tyrosine khơng cịn phối trí với tâm hoạt đồng thường thấy mà bị kéo tạo liên kết hidro với phối tử nước Trong trường hợp này, số phối trí nguyên tử đồng so với hai trường hợp lại BÀN LUẬN So sánh 4obp đại diện AA13 5tki đại diện AA9, hai phối tử tyrosine có độ động khác 4opb có phối tử tyrosine khơng động 5tki Ở 4oy7, phối tử phenylalanine thay cho phối tử tyrosine gây phối trí với tâm đồng, Nhưng gây đột biến từ phenylalanine thành tyrosine, tyrosine bị vặn xoắn vị trí cấu trúc vịng bị lệch so với phối tử phenylalanine Do đó, ta đưa giả thuyết tyrosine khơng đủ khoảng trống để phối trí nên bị bẻ cong Trong viết gần liên hệ cấu trúc phối trí tâm hoạt động PMO với tranh tiến hóa cho thấy cấu trúc tâm hoạt động AA13 trạng thái trung gian AA9 AA10 [8] Nếu giả thuyết AA10 chứng minh, ta đưa giả thuyết thành phần thứ hai đóng vai trị làm thay đổi cấu trúc tâm hoạt động PMO: Dưới áp lực tiến hóa, từ AA9 -> AA13 -> AA10, khoảng trống cho tyrosine ngày bị co lại đến AA10 tyrosine bị thay phenylalanine Tính tốn mật độ spin cho tâm hoạt động CelS2 cho thấy ưu tiên phân bố mặt phẳng vòng histidine cấu trúc CelS2 lại có vặn xoắn trở thành dạng lưỡng chóp tam giác Cấu trúc có hai điều kiện, xuất phối tử acid glutamic, hai phối tử alanine trục dọc Phối tử acid glutamic có điện tích tạo lực hút phối tử nước vùng mặt phẳng phối tử alanine có vai trị thành phần che chắn hạn chế việc tạo thành liên kết với nước mặt mặt phẳng Kết xác định số phối trí lớn CelS2 Bởi mật độ spin tập trung chủ yếu mặt phẳng vòng histidine, truyền dẫn electron phản ứng oxi hóa – khử hoạt động mặt phẳng Điều giống với họ PMO khác AA9 AA10, nhiên cấu trúc phối trí khác biệt nên hệ chuỗi phản ứng có khác biệt lớn Giả thuyết cần làm rõ nghiên cứu tớĐối với trường hợp 5ufv, kết tính tốn bước đầu cho thấy thay đổi cấu trúc hệ liên kết hidro mơ hình tâm hoạt động Trong đột biến từ glutamine thành acid glutamic cho thấy thay đổi xảy vùng liên kết hidro đột biến từ glutamine thành alanine cho thấy thay đổi mạnh xảy vùng liên kết 10 hidro phối trí trung tâm đồng Sự thay đổi mạnh gây thay đổi tương tác spin hạt nhân, điều tương ứng với kết [5] Một đặc điểm dễ nhận active-stie hai loại protein nhạy cảm cấu trúc tâm hoạt động thay đổi mơi trường điện mơi mà đặc biệt góc hợp theta Ở CelS2, cấu trúc tâm hoạt động ổn định so với cấu trúc tâm hoạt động MtPMO3* đặc điểm cần xem xét làm rõ nghiên cứu Hình 3.1 : Cấu trúc mơ hình CelS2 tối ưu hóa với A mơ hình dạng tự nhiên với mơi trường chân khơng, B mơ hình dạng tự nhiên với mơi trường diethylether, C mơ hình dạng tự nhiên với mơi trường nước, D mơ hình dạng đột biến F168Y môi trường chân không, E mơ hình dạng đột biến F168Y mơi trường diethylether, F mơ hình dạng đột biến từ F168Y mơi trường nước, G mơ hình dạng đột biến từ F168A môi trường chân không, H mơ hình dạng đột biến F168A mơi trường diethylether, K mơ hình dạng đột biến F168A mơi trường nước 11 Hình3.2: Cấu trúc tối ưu hóa mơ hình MtPMO3* mơi hình chất điện mơi bao gồm, A cấu trúc tâm hoạt động dạng tự nhiên môi trường chân không, B cấu trúc tâm hoạt động dạng tự nhiên môi trường diethylether, C cấu trúc tâm hoạt động dạng tự nhiên môi trường nước, D cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166E môi trường chân không, E cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166E môi trường diethylether, F cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166E môi trường nước, G cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166A môi trường chân không, H cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166A môi trường diethylether, K cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166A môi trường nước 12 Hình 3.3: Cấu trúc align mơ hình tâm hoạt động dạng tự nhiên (Màu đỏ/ tối màu) dạng đột biến F168Y (màu xanh/ sáng màu) protein CelS2 Kết tính tốn cho thấy hạn chế vùng không gian dành cho phối tử tyrosine khiến phối tử vị vặn xoắn mạnh Hình 3.4: Cấu trúc ba mơ hình tâm hoạt động protein MtPMO3*được align, ta thấy dạng tự nhiên dạng Q168E (màu đỏ/tối màu), cấu trúc có tương đồng cao, phối trí xung quanh tâm hoạt động đồng khơng đổi dạng Q168A(màu xanh/ sáng màu), trấu trúc bị biến đổi mạnh Phối tử nước dạng Q168A bị phối tử tyrosine kéo lênkhỏi mặt phẳng chứa phối tử hidtidine Thay đổi biến đổi sâu sắc tính chất tâm hoạt động đồngvà dẫn đến làm thay đổi tín hiệu EPR 13 Hình 3.5: A hình ảnh sinh loài họ PMO từ AA9 đến AA10, B tương quan cấu trúc đại diện họ AA9, AA13 đến AA10.Hình ảnh lấy từ [8] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Tất cấu trúc tâm hoạt động protein PMO xuất cấu trúc vòng histidine bao quanh, khác biệt cấu trúc tâm hoạt động chủ yếu đến từ cấu trúc phối tử trục dọc phối tử phân lớp thứ hai tính từ tâm đồng Trong [8], vai trò phối tử vùng trục dọc mặt phẳng tâm nhấn mạnh: AA13 NCU08746 glycine 89 AA10 CelS2 alanine 107 Ở NCU08746, glycine đóng vai trị chốt chặn để ngăn cản hình thành phối trí tâm đồng với nước với kết với CelS2 cho thấy vai trò A107 giống với G89 (1) Trong nghiên cứu này, tập trung chủ yếu vào liên kết 14 tâm hoạt động đồng phối tử mặt bên mặt phẳng vùng trục dọc xác định thêm yếu tố ảnh hưởng tới cấu trúc tâm hoạt động (2) Cả hai yếu tố (1 2) cho thấy mối tương quan cấu trúc đến tranh tiến hóa từ họ AA9 đến họ AA10 với họ AA13 cấu trúc trung gian Mặc dù đưa mối tương quan, kết luận nghiên cứu dừng lại mức đưa giả thuyết, số giả thuyết cần phải làm rõ nghiên cứu tới phương pháp khác mô động học phân tử Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Perlack RD, Wright L, Turhollow A, Graham R, Stokes B, Erbach D 2005 Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: the technical feasibility of a billion-ton annual supply Report DOE/GO- 102005-2135 US Dep Energy, Oak Ridge Natl Lab., Oak Ridge, TN [2] Beeson, W T., Vu, V V., Span, E A., Phillips, C M., & Marletta, M A Cellulose degradation by polysaccharide monooxygenases Annu Rev Biochem 2015, 84, 923-946 [3] Harris, P V., Xu, F., Kreel, N E., Kang, C., & Fukuyama, S New enzyme insights drive advances in commercial ethanol production Curr Opin Chem Biol 2014, 19, 162-170 [4] Himmel ME, Ding S-Y, Johnson DK, Adney WS, Nimlos MR, et al Biomass recalcitrance:engineering plants and enzymes for biofuels production Science 2007, 315, 804–807 [5] Span, E A.; Suess, D L M.; Deller, M C.; Britt, R D.; Marletta, M A., The Role of the Secondary Coordination Sphere in a Fungal Polysaccharide Monooxygenase ACS Chem Biol 2017, 12, 1095-1103 [6] Forsberg, Z.; Mackenzie, A K.; Sorlie, M.; Rohr, A K.; Helland, R.; Arvai, A S.; Vaaje-Kolstad, G.; Eijsink, V G., Structural and functional characterization of a conserved pair of bacterial cellulose-oxidizing lytic polysaccharide monooxygenases Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111, 8446-8451 [7] Forsberg, Z.; Røhr, Å K.; Mekasha, S.; Andersson, K K.; Eijsink, V G H.; Vaaje-Kolstad, G.; Sørlie, M., Comparative Study of Two Chitin-Active and Two Cellulose-Active AA10-Type Lytic Polysaccharide Monooxygenases Biochemistry 2014, 53, 1647-1656 [8] Kết chưa công bố 16 PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1- Danh mục báo, báo cáo khoa học tác giả liên quan đến đề tài (đính kèm báo, báo cáo) + Báo cáo hội nghị + Báo cáo khoa học 2- Quyết định liên quan đến hướng dẫn sinh viên làm luận văn (nếu có) 17 PHỤ LỤC 4: (hợp đồng, thuyết minh đề cương) 1- Thuyết minh đề tài (photo ký với Trường) 2- Hợp đồng thực đề tài NCKH (photo ký với Trường) ... Tất cấu trúc tâm hoạt động protein PMO xuất cấu trúc vòng histidine bao quanh, khác biệt cấu trúc tâm hoạt động chủ yếu đến từ cấu trúc phối tử trục dọc phối tử phân lớp thứ hai tính từ tâm đồng... môi cấu trúc tâm hoạt động Các cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến tối ưu hóa để so sánh với dạng tự nhiên chúng: Trong họ PMO, tyrosine thường phối tử nằm trục dọc đa số cấu trúc tâm hoạt động, ... trường diethylether, F cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166E môi trường nước, G cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166A môi trường chân không, H cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến Q166A