khảo sát sự tạo thành hạt giống virus (virus like particle) bằng cách đồng chuyển gen ha, na, m1 vào tế bào cho k1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆCẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT SỰ TẠO THÀNH HẠT GIỐNG VIRUS (VIRUS LIKE PARTICLE) BẰNG CÁCH ĐỒNG CHUYỂN GEN HA, NA, M1 VÀO TẾ BÀO CHO-K1 Chủ nhiệm đề tài: ThS Lao Đức Thuận Tp.HCM, tháng 10 năm 2013 IM U Vi c nghiên c u s bi u hi n ti u ph n h t gi ng virus (VLPs, virus like particle) h th ng t bào ng v t ang c nhà khoa h c th gi i quan tâm chúng mơ ph ng l i c u trúc l p v c a virus nh ng không mang b gen c a virus u ã h a h n cho (vaccine VLPs) có i lo i vaccine ti u ph n h t gi ng virus an toàn cao, ti t ki m th i gian chi phí s n xu t so v i lo i vaccine truy n th ng Hi n nay, vaccine cúm nh vaccine gi m vaccine b t ho t… u c l c, c s n xu t theo công ngh truy n th ng s n xu t tr ng gà có phôi hay nuôi c y virus t bào ng v t Các vaccine ã ang cơng c c c k h u ích cho vi c ng n ng a ch ng cúm mùa cúm d ch nh ng v n t n t i nhi u khuy t i mùa d ch cúm nên d n m Do ch ng virus cúm l u hành u x y hi n t ng chuy n d i kháng nguyên (antigenic drift) n vi c s n xu t vaccine phòng ch ng d ch cúm g p nhi u khó kh n s n xu t lo i vaccine truy n th ng, nhà s n xu t ph i phân l p nuôi ch ng virus s ng tr ng gà có phơi tồn cho ng u có th nh h ng i s n xu t b i chúng có kh n ng lây lan sang ng Ngồi ra, vaccine cúm nh vaccine b t ho t hay vaccine gi m nguy c h i c, gây nh h ng n s c kh e c a ng n an i s n xu t cl c u có i s d ng Chính v y, vi c nghiên c u s bi u hi n VLPs ã tr thành m i quan tâm c a nhà khoa h c th gi i v i mong mu n t o m t d ng vaccine th h m i có hi u qu an toàn cao M c dù th gi i ã có nh ng thành cơng nh t ng h th ng bi u hi n ti u ph n h t gi ng virus, nh ng t cơng trình nghiên c u liên quan nh i v i vi c xây i v i Vi t Nam v n n l nh v c i m c tiêu xây d ng mơ hình bi u hi n ti u ph n h t gi ng virus t bào ng v t thông qua vi c chuy n gen HA, NA, M1 vào t bào xa h n tìm hi u c ch ho t ti n hành ng v t h u nh ng cho m t mơ hình VLP t tài nghiên c u “KH O SÁT S VIRUS (VIRUS LIKE PARTICLE) B NG CÁCH ng lai chúng T O THÀNH H T GI NG NG CHUY N GEN HA, NA, M1 VÀO T BÀO CHO-K1” tài c th c hi n v i n i dung sau: i Xây d ng quy trình ni c y t bào CHO-K1 ii Xây d ng quy trình bào ng chuy n ba vector mang gen HA, NA, M1 vào t ng v t h u nh iii Ch n l c dòng t bào mang gen n nh iv Kh o sát s t o thành VLPs b ng ph n ng ng ng k t h ng c u ph n ng c ch ng ng k t h ng c u, ch p hình kính hi n vi n t quét CL C im u c l c i Danh m c ch ký hi u, ch vi t t t iv Danh m c hình, b ng, s CH vi NG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Tình hình v d ch cúm H5N1 th gi i Vi t Nam 1.2 Vaccine phòng ng a u tr cúm 1.2.1 Vaccine truy n th ng 1.2.2 Vaccine th h m i 1.3 Vaccine ti u ph n h t gi ng virus (vaccine VLP) 1.3.1 u m c a vaccine ti u ph n h t gi ng virus 1.3.2 Kh n ng áp ng mi n d ch c a vaccine VLP 1.4 Tình hình nghiên c u vaccine VLP th gi i n c 1.4.1 Trên th gi i 1.4.2 Trong n c 1.5 T ng quan ti u ph n h t gi ng virus (virus-like particle) 1.5.1 Hemagglutinin 1.5.2 Neuraminidase 11 1.5.3 Matrix protein 14 1.6 H th ng bi u hi n c a VLP m t s ph ng pháp ánh giá s bi u hi n VLP 16 1.6.1 H th ng bi u hi n VLP 16 1.6.2 Ph ng pháp ánh giá s bi u hi n VLP d a ph n ng ng ng k t h ng u (Hemagglutination Assay) 18 1.6.3 Ph ng pháp ánh giá d a ph n ng c ch ng ng k t h ng c u (Hemagglutination inhibition assay) 20 i 1.6.4 ánh giá hi u qu b o v c a vaccine thơng qua mơ hình ng v t thí nghi m (Challenge Tests) 21 CH NG V T LI U PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u – hóa ch t 22 2.1.1 Hóa ch t 22 2.1.2 Dung d ch m, môi tr ng nuôi c y 22 2.1.3 Hóa ch t tách plasmid t E coli ã chuy n gene thành cơng 23 2.1.4 Hóa ch t chuy n gene 23 n di 23 2.1.5 Hóa ch t 2.1.6 Hóa ch t dùng c t n i gene m c tiêu 24 2.1.7 Dòng t bào CHO-K1 24 2.1.9 H th ng vector s d ng tài 25 2.2 D ng c , thi t b 26 2.3 Ph ng pháp nghiên c u 28 2.3.1 T o dòng vector pZIC mang gene m c tiêu HA, NA, M1 28 2.3.2 Bi n n p vector mang gene m c tiêu pZIC HA, pZIC NA, pZIC M1 vào t bào E coli TOP10F 29 2.3.3 Ph ng pháp trì dịng t bào CHO-K1 31 2.3.4 Ph ng pháp xây d ng 2.3.5 Xây d ng 2.3.6 Ph ng cong t ng tr ng CHO-K1 31 ng cong gi t t bào b ng Zeocin 32 ng pháp chuy n gene vào t bào CHO-K1 32 2.3.6.1 Ph ng pháp chuy n gene vào t bào CHO-K1 b ng LipofectamineTMReagent 32 2.3.6.2 Ph ng pháp ch n l c dòng t bào mang gene chuy n thành công 34 2.3.7 ánh giá s bi u hi n gen 34 2.3.7.1 ánh giá s bi u hi n gen thông qua ph ng pháp ng ng k t h ng c u 34 2.3.7.2 ánh giá s t o thành VLP thơng qua ch p kính hi n vi CH NG K T QU BI N LU N ii n t quét 37 3.1 T o dòng vector pZIC HA, pZIC NA, pZIC M1 38 3.2 Kh o sát 3.2.1 c c m dòng t bào CHO-K1 48 m ni c y dịng t bào CHO-K1 48 ng dòng t bào CHO-K1 50 3.2.2 ng cong t ng tr 3.2.3 ng cong gi t t bào b ng Zeocin 52 3.3 K t qu chuy n gen t m th i 54 3.4 Ch n l c dòng t bào n nh mang gene m c tiêu 57 3.5 Ki m tra s hi n di n VLP b ng ph ng pháp ch p kính hi n vi n t quét (SEM) 63 CH NG K T LU N, KI N NGH TÀI LI U THAM KH O PH L C iii DANH M C CÁC CH KÝ HI U, CÁC CH µg microgram µl microlit AmpR Ampicillin Resistance BSA Bovine Serum Albumin CHO Chinese Hamster Ovary DHFR Dihydrofolate reductase DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EPO Erythropoietin EtBr EthidiumBromide PBS Phosphate Buffer Saline FBS Fetal Bovine Serum HA Hemagglutinin M1 Matrix protein MDCK Madin Darby canine kidney NA Neuraminidase NP Nucleoprotein NST Nhi m s c th PCR Polymerase Chain Reaction Pen Penicillin RNPs Ribonucleprotein SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sias Sialic acid Strep Streptomycin VLP Virus-Like Particle ZeoR Zeocin Resistance iv VI T T T DANH M C HÌNH, B NG, S DANH M C HÌNH Hình 1.1 Mơ hình gây áp ng mi n d ch VLPs Hình 1.2 C u trúc hình thái c a virus cúm A hình ch p d Hình 1.3 Hình thái VLPs quan sát d i kính hi n vi i kính hi n vi nt nt Hình 1.4 C u trúc c a phân t HA Hình 1.5 Ho t tính phân c t c a NA t o kh i t bào v t ch u ki n cho vi c phóng thích virus Hình 1.6 (A) C u trúc chu i polypeptide NA, (B) C u trúc trung tâm ho t vùng b o t n NA c a virus cúm N2 ng c a Hình 1.7 C u trúc tinh th hóa c a NA Hình 1.8 Th th phân t HA (A), m i liên k t NeuAc 2,3Gal th th phân t HA (B) màng t bào v t ch , s t ng tác gi a phân t HA c a virus v i th th phân t HA màng t bào v t ch thơng qua m i liên k t NeuAc 2,3Gal Hình 1.9 Quá trình xâm nh p vào t bào v t ch thơng qua s hình thành liên k t gi a HA c a virus th th phân t HA màng t bào v t ch Hình 1.10 S mơ t c u trúc vector mang gene HA, NA M1 c a H9N1 VLP c bi u hi n Baculovirus Hình 1.11 Ph n ng ng ng k t h ng c u Hình 1.12 Dãy ph n ng d point c a ph n ng ng tính, âm tính ng ng k t h ng c u Hình 1.13 Ph n ng c ch ng ng k t h ng c u Hình 2.1 C u trúc vector pZIC Hình 2.2 V trí c t gi i h n c a enzyme NotI (a) NheI (b) Hình 2.3 M t s hóa ch t s d ng nghiên c u Hình 2.4 Quy trình chuy n gene b ng LipofectamineTMReagent Hình 2.5 Ph ng pháp l y h ng c u gà thông qua t nh m ch cánh v m end- Hình 2.6 S th c hi n ph n ng ng ng k t h ng c u Hình 3.1 K t qu sàng l c ban u t bào E coli TOP10F sau bi n n p v i vector tái t h p pUC57-HA (hay pUC57-NA pUC57-M1) môi tr ng ch n c 100 g/ml Ampicillin Hình 3.2 K t qu n di HA, NA, M1 c tách kh i plasmid pUC-HA, pUCNA, pUC-M1 sau x lý v i NotI NheI Hình 3.3 K t qu NA, pZic-M1 n di sàng l c gen HA, NA, M1 tách kh i pZic-HA, pZic- Hình 3.4 C u trúc vector tái t h p pZIC HA Hình 3.5 C u trúc vector tái t h p pZIC NA Hình 3.6 C u trúc vector tái t h p pZIC M1 Hình 3.7 T bào CHO-K1 có hình d ng ngun bào s i, t ng sinh môi tr ng DMEM F12, b sung 10% FBS, 1% Kháng sinh Penicillin-Streptomycin (x100) Hình 3.8 T bào s ng (i) t bào ch t (ii) nhu m Trypan Blue Hình 3.9 Hình thái t bào CHO-K1 mơi tr Hình 3.10 T bào CHO-K1 tr c ánh giá b ng ph ng pháp ng ch n l c kháng sinh Zeocin c chuy n gen (x10) Hình 3.11 Hình nh t bào CHO-K1 sau ti ng chuy n gen (x10) Hình 3.12 Ph n ng ng ng k t h ng c u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 chuy n gen t m th i giai n Hình 3.13 T bào khơng ch a vector sát nh p vào b gen t bào CHO-K1 ch t sau 14 ngày ch n l c Hình 3.14 T bào CHO-K1 có vector sát nh p vào b gen s ng sót sau 14 ngày ch n l c Hình 3.15 T bào mang gen m c tiêu t ng sinh thành t ng c m t bào sau ch n l c Hình 3.16 Các t bào (x100) n sau ngày nuôi c y môi tr vi ng khơng huy t Hình 3.17 T bào CHO-K1 sau ngày nuôi c y môi tr (x10) ng khơng huy t Hình 3.18 Ph n ng ng ng k t h ng c u c a d ch t bào sau ch n l c b ng Zeocin 100 g/ml Hình 3.19 K t qu ph n ng c ch ng ng k t h ng c u Hình 3.20 Hình ch p kính hi n vi mang gen m c tiêu n t quét m u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 Hình 3.21 Hình ch p kính hi n vi khơng mang gen m c tiêu n t quét m u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 DANH M C B NG ng 3.1 K t qu tách plasmid pUC57-HA, pUC57-NA, pUC57-M1 ng 3.2 M t t bào trung bình l n thí nghi m ng 3.3 K t qu kh o sát Zeocin ng cong gi t t bào CHO-K1 b ng kháng sinh DANH M C BI U Bi u 3.1 ng cong t ng tr ng t bào CHO-K1 Bi u 3.2 ng cong gi ng t bào CHO-K1 b ng kháng sinh Zeocin vii ... NG CHUY N GEN HA, NA, M1 VÀO T BÀO CHO- K1? ?? tài c th c hi n v i n i dung sau: i Xây d ng quy trình ni c y t bào CHO- K1 ii Xây d ng quy trình bào ng chuy n ba vector mang gen HA, NA, M1 vào t ng... c y t bào CHO- K1 chuy n gen t m th i giai n Hình 3.13 T bào không ch a vector sát nh p vào b gen t bào CHO- K1 ch t sau 14 ngày ch n l c Hình 3.14 T bào CHO- K1 có vector sát nh p vào b gen s ng... n gen HA, NA, M1 vào t bào xa h n tìm hi u c ch ho t tơi ti n hành ng v t h u nh ng cho m t mơ hình VLP t tài nghiên c u “KH O SÁT S VIRUS (VIRUS LIKE PARTICLE) B NG CÁCH ng lai chúng T O THÀNH