– cô lập đoạn gen cần nghiên cứu ra khỏi tập hợp gen chung để có thể nghiên cứu chức năng và thực hiện các thao tác biến đổi9. – Sản xuất lượng lớn gen đích.[r]
Công nghệ gen TS Trần Cát Đông Mục tiêu Biết cơng nghệ gen Biết công cụ Hiểu bước Biết số ứng dụng Định nghĩa Tổng quát: Các thao tác di truyền dùng để tạo cá thể có tổ hợp đặc điểm di truyền Cụ thể: – – Các thao tác tế bào, liên quan đến việc tạo tế bào lai Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector chuyển vào tế bào chủ Tạo dòng gen Tạo dòng tế bào mang đoạn gen cần nghiên cứu Mục đích: – – lập đoạn gen cần nghiên cứu khỏi tập hợp gen chung để nghiên cứu chức thực thao tác biến đổi Sản xuất lượng lớn gen đích Đoạn gen đích Tạo dịng Vector mang gen đích Nghiên cứu chức Dịng tế bào mang gen đích Nuôi cấy Chiết tách Đưa trở lại tế bào Thực biến đổi Các công cụ Chủng – – vi sinh vật dùng tạo dòng gen Chủng trì: mang đột biến cho phép nhận ổn định ADN ngoại lai DH5α, JM103, … Chủng biểu hiện: mang đột biến giúp biểu gen ngoại lai ổn định protein tái tổ hợp BL21(DE3), BL21(DE3)plysS, … Chọn chủng vi sinh vật phù hợp với mục đích vector sử dụng Vector tạo dòng - Plasmid Plasmid – – – – – – Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dịng tái tổ hợp, Có điểm khởi đầu chép (Ori) Có vùng tạo dịng Các plasmid sau tái tổ hợp đưa vào tế bào chủ cách biến nạp hay thẩm điện pGEM, pBR322 pBluescript II, … pET, pGEX, … Dễ sử dụng, thao tác, đa Khó tạo dịng ADN lớn Plasmid Amp R Các vector từ phage lambda Bộ gen phage sau tái tổ hợp đóng gói in vitro đơn giản cần ADN đích Thư viện phage dễ dàng phát với mẫu dị, khuếch đại bảo quản thời gian dài gt10, gt11, ZAP II, … Vector cosmid Cosmid dạng lai phage plasmid có ưu hai dạng vector Đóng gói in vitro phage, hoạt động plasmid Tạo dịng ADN có kích thước lớn đến 50 kb Vector từ phage dạng sợi - M13 Khả tạo dòng ADN sợi đơn lẫn sợi kép Thu lượng lớn ADN Có sử dụng chế bổ sung alpha để chọn lọc dịng Ứng dụng nhiều thí nghiệm định trình tự làm khn mẫu để gây đột biến đặc hiệu điểm 10 Đưa ADN vào tế bào Biến nạp – Tế bào thu nhận ADN tự môi trường ngoại bào Tế bào xử lý với CaCl2 – Không phải loại tế bào biến nạp – Thẩm – – Dùng điện trường cao làm thủng tạm thời màng tế bào Có thể thực với nhiều loại tế bào Tải – 17 điện nạp Dùng virus để đưa gen vào tế bào Tạo dòng đoạn ADN nhỏ Tạo đoạn ADN đích Cắt ADN đích vector Nối ADN đích vector Biến nạp vào tế bào Kiểm tra dịng tế bào ADN đích Plasmid vector Ampr Vị trí cắt BamHI Tetr Vị trí cắt BamHI Cắt BamHI Cắt BamHI Ampr Các mảnh ADN ADN ligase T4 Ampr + Ampr Tetr Biến nạp vào E coli Trãi E coli lên mơi trường chọn lọc Khơng có kháng sinh Ampicillin Các dịng kháng Ampicillin In khóm Ampicillin 18 Các khóm nhạy Tet kháng Amp mang dòng tái tổ hợp Tetracyclin Tạo dòng phage λ Đầu ADN 45 kb đầu cos đầu cos Nhiễm sắc thể vi khuẩn Đuôi Cắt giới hạn Phage λ 27 kb 40 kb ADN không thiết yếu phage 15 kb 15 kb 19 kb Nối 35 kb 24 kb Đóng vỏ in vitro 40 kb 35 kb Q lớn khơng đóng 27 kb 24 kb 19 kb 17 kb Đóng vỏ thành phage 15 kb 10 kb 19 kb 10 kb kb Q nhỏ khơng đóng xác 17 kb Tóm tắt bước tạo dịng Plasmid / Cosmid ADN Nhiễm sắc thể Vector λ Cắt với enzym Cắt phần với enzym giới hạn PCR giới hạn với đầu cắt tương thích với đầu cắt nhiễm sắc thể Cắt với enzym giới hạn với plasmid Tách ADN theo kích thước Nối 20 Nối Plasmid Cosmid Biến nạp / Thẩm điện vào E coli Đóng vỏ in vitro Đóng vỏ in vitro Tải nạp vào E coli Tải nạp vào E coli Sàng lọc khóm Sàng lọc khóm Sàng lọc plaque ... quát: Các thao tác di truyền dùng để tạo cá thể có tổ hợp đặc điểm di truyền Cụ thể: – – Các thao tác tế bào, liên quan đến việc tạo tế bào lai Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo phân... Vector tạo dòng - Plasmid Plasmid – – – – – – Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dịng tái tổ hợp, Có điểm khởi đầu chép (Ori) Có vùng tạo dịng Các plasmid sau tái tổ hợp đưa vào tế bào chủ cách... trường ngoại bào Tế bào xử lý với CaCl2 – Không phải loại tế bào biến nạp – Thẩm – – Dùng điện trường cao làm thủng tạm thời màng tế bào Có thể thực với nhiều loại tế bào Tải – 17 điện nạp Dùng