Cam thảo và hoạt chất chính axít glycyrrhizic ( GA ) được sử dụng phổ biến hiện nay , có mặt trong hầu hết các bài thuốc , toa thuốc ... Hiện nay trên thị trường , Cam thảo hầu hết được nhập từ Trung Quốc với nguồn gốc , xuất xứ và chất lượng còn nhiều bất cập . Vì vậy , để tránh việc sử dụng sản phẩm kém chất lượng , đòi hỏi phải có phương pháp kiểm nghiệm được liệu Cam thảo và chế phẩm . Ngày nay , có nhiều phương pháp kiểm nghiệm đáng tin cậy như phương pháp sắc ký , đặc biệt là sắc ký lỏng hiệu năng cao . Những phương pháp này đòi hỏi phải có chất chuẩn để đảm báo kết quả phân tích chính xác và tin cậy .
NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ACID GLYCYRRHIZIC VÀ ACID GLYCYRRHETIC TỪ CAM THẢO ĐẺ LÀM CHÁT CHUẢN DS Phạm Quỳnh Khoa*; DS B ù i Thị Châu P h n g * H ướng dẫn: GS.TS Nguyễn M inh Bức* TĨM TẲT Cam thảo hoạt chất axít glycyrrhizic (GA) đirợc sử dụng phổ biến nay, có mặt hầu hết thuốc, toa thuốc Hiện Irên thị trường, Cam thảo hầu hét nhập lừ Trung Quốc với nguồn gốc, xuất xứ chất lượng nhiều bất cập V vậy, để Iránh việc sử dụng sàn phẩm chất lượng, đòi hỏi phải có phương pháp kiêm nghiệm dược ỉiệu Cam thảo chê phâm Ngày nay, có nhiêu phương pháp kiểm nghiệm đáng tin cậy phương pháp sắc ký, đặc biệt sãc ký lỏng hiệu cao Những phương pháp địi hỏi phải có chât chn đê đảm bào kết quà phân tích xác tin cậy Xuât phát từ lý írên, chúng tơi thực đê tài nhăm phục vụ cho công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa dược liệu Cam ihảo chế phẩm với mục tiêu: Xây dựng quy trìnhchiếtxuẩt,phânlậpvàtinhkhiếth aaxítglycyrrhizic(GA)vàaxítgỉycyrrh tic(GH)từCamthảođểlàmchuẩn, đồngthờitiếnhànhđánhgiáhaichattrênvớiđầyđùcấcchỉtiêuhalývàđịnhhcợng Đối tượng phương pháp nghiên cún: Dược liệu Cam Ihảo chiết với elhanoỉ 30% Irong b nh hồi lưu Phân lập axít glycyrrhizic từ cao cồn Cam thào phương pháp HPLC điều chế Thu axít glycyrrhetic lừ thủy phân axít glycyrrhizic thơ, phân ỉập qua sắc ký cột kết linh nhiều lần MeOH Kết quả: Đã xây đựng hoàn thiện quy tr nh chiết xuất, phân lập tinh khiết hóa axít glycyrrhizic axít glycyrrhelic íừ Cam Ihảo Kiểm tra đánh giá hai chất chuẩn điều chế theo tiêu chí đánh giá chất chuẩn như: SKLM, điểm chảy, phổ UVVis, phổ TR, phổ MS phổ NMR định lượng Kết luận: Các chất chuẩn điều chế có độ l nh khiết cao, đù điều kiện để ỉàm chất chuẩn đối chiểu * Từ khóa: Chất chuẩn; Cam thảo; Axít glycyrrhizic; Axít glycyrrhetic P r p a r a tio n o f r f r n c lic o ric S ta n d a r d o f g ly c y r rh iz ic a c i d a n d g ly c y r r h tic a c id f r o m S u m m ary Licorice as well as its active substance such as GA have been used widely in traditional medicine and in pharmaceutical At the moment, licorice used in Vietnam is mostly imported from China wilh unidentified origin and quality Therefore, to avoid the use of poorly qualified products, it is necessary to build up quality control methods for licorice and its products Nowadays, there are many reliable quality control methods such as chromatographic methods, especially high performance liquid chromatography (HPLC) These methods often require reference standards lo ensure accurate and reliable analytical results The aim of this study is to prepare the reference standards of GA and GH to serve research works, quality control and standardization of licorice and its products with the following objectives: Establishing method for extraction, isolation and purification of glycyrrhizic acid (GA) and glycyrrhetic acid (GH) from licorice to be used as reference standards, along with checking the isolated substances with physicochemical criteria for reference standards and quantitative test Materials and method: This powder of licorice was extracted with ethanol 30% in a percolator GA was isolated with preparative HPLC Crude GA was hydrolized by acid to obtain crude GH then il was separated by column chromatography and crystallized many times in methanol Results: This study established a stable and repeatable method for extraction, isolation and purification of glycyrrhizic acid (GA) and glycyrrhetic acid (GH) from licorice to be used as reference standards The reference standards were evaluated based on criteria including determination of chemical and physical criteria such as thin layer chromatography, melting point, UVVis, IR, MS and NMR spectrum, quantitative test Conclusion: The isolated reference standards including GA and GH are of high quality and meet the requirement for a primary standard * Key words: Reference standard; Licorice; Glycyrrhizic acid; Glycyrrhetic acid * Đại học YDư ợc TP H CM 653 I ĐẶT VẤN Đ Cam thảo dược liệu sử đụng phổ biến nay, có m ặt hầu hết thuốc, toa thuốc Nguồn Cam thảo thị trường hầu hết nhập từ Trung Quốc với nguồn gốc, xuất xứ chất lượng nhiều bất cập V vậy, để tránh việc sử dụng sản phẩm giả, chất lượng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, việc xây dựng phương pháp kiểm nghiệm liệu Cam thảo chế phẩm vô quan trọng Hiện nay, phương pháp phân tích đại quang phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ hồng n ^ o ại, sắ c lớ p m ỏ n g v đ ặ r b iệ t nhưrvnơ n h n Kắc Vv Inrtơ h ig n n g n Cí' 1"' triỷ n h ím g nhỉivvncr pháp kiểm nghiệm đáng tin cậy Tất phương pháp cần có chất chuẩn để đảm bảo kết quà phân tích đạt độ xầc Tuy nhiên, chất chuẩn axít glycyrrhizic axít glycyrrhetic chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao, đặc biệt chuẩn gốc thời gian đặt hàng kéo dài vài tuần, chí vài tháng, gây nhiều khó khăn cho cơng tác kiểm nghiệm Cụ thể, giá chất chuẩn axít acid glycyrrhizic axít acid glycyrrhet c Công ty Chromadex thị trường Ịần ỉượt 47,03 USD (100 mg) 85,50 USD (10 mg) Xuất phát từ iihững lý ưên, nghiên cứu đề tài nhằm thiết lập hai chất chuẩn axít glycyrrhizic axít glycyrrhetic có chất lượng cao dùng công tác kiểm tra chất lượng dược liệu Cam thảo chế phẩm chứa Cam thảo nói chung, hai chất nói riêng n ĐỐI y ị P ỉ i ĩ f Ơ N G PHÁP n g h i ê n c ứ u 2.1 Đốỉ tưọiìg nghiên u Rễ Cam thảo mua từ Bệnh viện Y học c ổ truyền TP H Chí M inh Thời gian thu mua 25 03 2013 Chất đối chiếu, tra n g thiết bị, hóa chất, đung mơi: + Chuẩn GA: Chuẩn thứ cấp (SH) Công ty Chromadex (Mỹ), số lơ 00007374M3D, hàm lượng 75,1% 4 Chuẩn axít 18pglycyrrhetic: Chuẩn sơ cấp (p) Công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00007370910, hàm lượng 97,3% Trang thiết bị: + M áy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC20A (Nhật), detector PDA + M áy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR8201PC (Nhật) + M áy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhãn Broker 500 MHz NM R (Mỹ) f Máy đo khối phổ Bruker |iQ T O F MS (Mỹ) Hóa chất, dung mơi phù hợp với mục đích sử đụng 2.2 P h n g pháp nghiên u Kiểm nghiệm nguyên liệu: Dược l ệũ Cam thảo kiểm nghiệm theò Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV (2009) [3] Điều ché GA: Làm ẩm ỉ kg dược liệu với 300 ml EtOH 30% Đun hồi lưu 60 phút X lần rút địch chiết, lọc qua giấy lọc cách thủy dịch lọc cịn lại 1/3 thể tích, để nguội Axít hóá H C Í10% đến pH ỉ 2, tạo tủaGA, làm lạnh 30 phút, gạn bỏ nước, thu tủa rửa tủa nước đển địch rửa khơng cịn axít Hịa tủa với EtOH 96%, lọc qua phễu Buchner, rửa lọc EtOH 96% đển hết màu vàng eô cách thủy dịch lọc để ỉoại bớt EtOH, sấy chân không nhiệt độ 60°c đến cắn, thu cao khô GA (100 g) Cân 100 g cao khô GA cho vào b nh nón nút mài, chiết aceton X ỉần, lần chiết nhiệt độ 56 57°c 654 thu dịch chiết, lọc qua phễu Buchner Kiềm hóa dịch ỉọc đung dịch KOH 10% MeOH đển pH ~ 9, thu tủa GA 3K, lọc lấy tủa rửa tủa ỉần ỉưọt với aceíon (300 ml), methanol (300 mỉ), sau sẩy chân khơng nhiệt độ 60°c Hịa tan hồn tồn muối GA 3K axít acetic băng nhiệt độ 95 100°c, để nguội, kết tinh Lọc lấy tinh thể muối GA 1K, rửa lần ỉượt axít acetic băng, methanol, ether ethyỉic, để khô tự nhiên (*), thu muối GA 1K Két tinh muối GA 1K ethanol nước (tỷ lệ 5:1) (**) Lặp lại quy tr nh lọc (*) kết tinh (**) thêm lần Axít hóa muối GA 1K dung dịch H 2SO 1% 100°c 20 phút, để nguội nhiệt độ phòng, lọc lấy tủa, rửa tủa với nước đến dịch rửa hết axíÈ, sấy chân khơng 60°c GA thu khuấy trộn với cloroform, lọc lấy tủa, sấy chân không Ố0°c, thu GA [2], GA thu sau tr nh loại tạp tinh chế sắc kỹ ỉòng hiệu cao, điều chế thu 0,820 g Điều chế GH: Muối GA 1K thu sau tr nh loại tạp thủy phân HC1 7%, rửa cắn nước đến hết axít, ỉắc vói cloroform, lọc lẩy dịch đororm , thu hồi dung môi thu cao GH Cao GH phân lập sắc ký cột với hệ điciorometan methanoỉ vói độ phân cực tãng đần, thu lấy phân đoạn chứa GH, cô thu hồi dung môi kết tinh nhiều lần methanol thu 0,230 g Đánh giá GA G H điều chế: Định tính xác định cấu trúc: sắc ký lóp mỏng, HPLC phân tích, điểm chảy, phổ IR, phổ MS phổ NMR Định iượng: Khảo sát đánh giá quy tr nh định lượng cho hai chất chuẩn điều chế, xác định hàm lượng hai chất chuẩn điều chế III K Ế T QUẢ VÀ BÀN LU ẬN 3.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu Định danh: Các tiêu kiểm nghiệm phù họp với mô tả D Đ V N IV Định lượng: Hàm lượng cắn chứa GẠ chiếm 13,1% tính theo dược liệu khơ kiệt, phù hợp với DĐV NIV 3.2 Đ ánh giá GA G H điều ch ế 3.2.2 Đánh giá GA Bột vô định h nh, màu trắng, không mùi (820 mg) Sắc ký lóp mỏng: u v 254 nm ƯV 365 nm Axft H SO4 10%/EtơH sấy 105°c phút H nh Sắc ký lớp mỏng GA (C: Chuẩn, T: Thử) Pha động: 1: Cloroform ethanol axít acetic (40:10:26) 2: Cloroform methanol nước axít acetic (64:20:10 :20 ) 3: nbutanol nước methanol axít acetic (70:20:10:10) GA điều chế chí cho vết có h nh dạng, màu sắc Rf tương ứng với vết GA chúẩn HPLC phân tích: Tiển hành tiêm ỉần lượt dung địch mẫu chuẩn mẫu thử vào hệ thống sắc ký 655 1* IM ta.' ' » 11 i it À ủ »