Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh tt

MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển nhanh chóng kinh tế - xã hội, người phải đối mặt với nhiều mầm bệnh nguy hiểm mức độ khác ung thư, bệnh truyền nhiễm, ngộ độc thực phẩm nhiễm trùng bệnh viện Việc khống chế ngăn chặn kịp thời dịch bệnh quan tâm quốc gia giới Nghiên cứu ứng dụng công nghệ mới, phương pháp phát nhằm nhanh chóng kiểm sốt dịch bệnh, khởi phát bệnh cần phải có hỗ trợ nghiên cứu đa ngành kết hợp nghệ nano, vật lý, hóa học, sinh học, điện tử…Trong năm gầy đây, việc nghiên cứu phát triển ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa kiểm sốt chăm sóc sức khỏe nói chung, y tế dự phịng nói riêng quan tâm Phương pháp phân tích điện hóa sử dụng hệ thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, chi phí thấp có q trình vận hành dễ dàng, tiết kiệm chi phí phân tích đơn giản hóa bước phân tích Hơn nữa, hệ thiết bị gọn nhẹ, việc xử lý mẫu đơn giản nên phương pháp phát triển thành thiết bị đo cầm tay để phân tích mẫu trực tiếp trường khảo sát thực địa Cảm biến sinh học nghiên cứu, áp dụng để phát nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau, có tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện gây ngộ độc thực phẩm Nhiễm trùng bệnh viện vấn đề giới quan tâm ngày xuất nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, chí kháng đa thuốc Nhiễm trùng bệnh viện nhiễm trùng mắc phải thời gian nằm viện, xuất 48 sau bệnh nhân vào viện khơng có biểu giai đoạn ủ bệnh nhập viện Nhiễm trùng bệnh viện không ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người dân mà gây thiệt hại nặng nề kinh tế xã hội Nhiễm trùng bệnh viện làm tăng thời gian nằm viện, tăng chi phí cho người bệnh nằm điều trị bị nhiễm trùng bệnh viện Nhược điểm kỹ thuật chẩn đốn truyền thống phải thực nhiều bước thời gian phân tích lâu cho kết sau vài đến hàng ngày, kỹ thuật yêu cầu mẫu bệnh phẩm phải xử lý trước Hơn nữa, kỹ thuật địi hỏi trang thiết bị, hóa chất, sinh phẩm đắt tiền, cán thực đào tạo chuyên nghiệp thực phòng đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học Trong bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn nhiễm từ bệnh viện thường gặp phải chủng kháng kháng sinh kháng đa thuốc, cần điều trị liệu pháp kịp thời Thơng thường, với phương pháp chẩn đốn truyền thống, thời gian nhận kết xác chủng vi khuẩn gây bệnh phải đến 48 giờ, giới hạn phát tới 10 5- 106 CFU/mL không làm giàu sơ Trong đó, số kỹ thuật chẩn đốn sinh học phân tử có độ nhạy cao, cho kết sau vài giờ, nhiên chi phí thường đắt đòi hỏi người làm xét nghiệm cần phải vững vàng chuyên môn Gần đây, với phát triển nhanh chóng khoa học cơng nghệ, đặc biệt công nghệ nano công nghệ cảm biến, thu hút quan tâm lớn từ nhà khoa học giới nhằm tạo thiết bị chẩn đốn mầm bệnh nhanh chóng, tiện dụng, có độ nhạy độ đặc hiệu cao Từ thực trạng tại Việt Nam xuất phát từ thực tiễn, luận án nghiên cứu với tiêu đề: “Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sở vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát số vi khuẩn gây bệnh” đề xuất cho luận án tiến sĩ Đề tài có 02 mục tiêu chính: (1) Tăng cường ổn định điện hóa điện cực in lưới cacbon số hệ vật liệu bạc-oxide graphene khử, hạt nano vàng màng nano vàng để hình thành cảm biến sinh học; (2) Phát triển thành cơng cảm biến điện hóa sở điện cực in lưới cacbon biến tính với hệ vật liệu hệ đo điện hóa cầm tay để phát nhanh số chủng vi khuẩn gây bệnh Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu: Cách tiếp cận luận án trình nghiên cứu dựa thực nghiệm kết hợp với lý thuyết biện chứng tài liệu tham khảo để bổ sung, so sánh, đánh giá từ tìm quy trình, giải pháp tối ưu thực mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu luận án: Nội dung nghiên cứu luận án gồm phần tương ứng với chương thực nghiệm: (1) Chế tạo cảm biến điện hóa sở điện cực in lưới cacbon biến tính với bạc-oxide graphene khử; (2) Chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sở điện cực in lưới cacbon biến tính hạt nano vàng; (3) Chế tạo cảm biến điện hóa sở điện cực in lưới cacbon biến tính màng vàng; (4) Nghiên cứu, chế tạo thiết bị cầm tay cho cảm biến điện hóa Đề tài thực tại Viện Tiên tiến Khoa học Công nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Trung tâm nghiên cứu y sinh, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Kết luận án mở hướng nghiên cứu nhằm phát triển thiết bị chẩn đoán sở cảm biến sinh học điện hóa có độ ổn định, độ nhạy độ đặc hiệu cao, kích thước nhỏ tiện dụng để phát nhanh sàng lọc mầm bệnh tại chỗ chiến dịch phòng, chống nhiễm trùng bệnh viện Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn luận án: Ý nghĩa khoa học:  Đã xây dựng quy trình khoa học thực chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO phương pháp thủy nhiệt chế tạo hạt nano vàng AuNPs phương pháp điện hóa để biến tính cho điện cực SPE Các điều kiện phún xạ màng mỏng vàng lên điện cực làm việc (WE) SPE;  Tìm phương pháp điều kiện ổn định đặc trưng điện hóa điện cực cacbon SPE biến tính làm sở cho trình chế tạo cảm biến sinh học điện hóa;  Xây dựng, xác lập điều kiện tối ưu trình chế tạo cảm biến sinh học việc biến tính AgNPs-rGO để phát vi khuẩn Salmonella; biến tính AuNPs AuNFs để phát vi khuẩn E.coli O157 vi khuẩn MRSA;  Tính tốn đánh giá vai trị vật liệu nano biến tính sở giá trị diện tích hoạt động điện hóa tương ứng Vật liệu màng vàng cho giá trị tối ưu tính chất điện hóa ứng dụng chế tạo cảm biến điện hóa ứng dụng phát vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện;  Nghiên cứu, chế tạo thành cơng thiết bị đo điện hóa cầm tay cho cảm biến sinh học điện hóa để phát vi khuẩn tại thực địa Ý nghĩa thực tiễn: Chủ động chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO hạt AuNPs, màng vàng (AuNFs) để biến tính điện cực SPE nhằm chế tạo thành cơng cảm biến sinh học điện hóa phát nhanh vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn E.coli O157 vi khuẩn MRSA ứng dụng sàng lọc tác nhân gây bệnh Kết luận án cảm biến sinh học điện hóa chế tạo dựa điện cực cacbon in lưới biến tính vật liệu nano lai bạc graphene oxít hạt nano vàng (hạt màng vàng) nhằm tăng cường khả khuếch đại tín hiệu chuyển đổi, bám dính thích ứng sinh học phần tử cảm nhận nhằm tạo cảm biến có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn phát thấp kết hợp với thiết bị cầm tay nhằm phát vi khuẩn gây bệnh tại thực địa Sản phẩm Luận án không dừng lại báo khoa học cịn có sản phẩm đăng ký sở hữu trí tuệ Những đóng góp luận án:  Sự ổn định điện hóa điện cực in lưới cacbon biến tính vật liệu nano lai hạt nano bạc -oxide graphene khử (AgNPs-rGO) ứng dụng chế tạo cảm biến phát vi khuẩn Samonella Cảm biến phát vi khuẩn Salmonella thời gian 25 phút, dải đo 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo hàm ∆Ipeak = 0,02x - 0,01, có R2 = 0,9559 giới hạn phát LOD = 22 CFU/mL  Khảo sát ổn định điện hóa q trình sử dụng SPE cacbon biến tính hạt nano vàng (AuNPs) kích thước hạt khác 10 nm, 15 nm, 25 nm việc phát số tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến vi khuẩn MRSA E.coli O157 Kết giới hạn phát hiện: 13 CFU/mL (MRSA, AuNPs 15 nm) 15 CFU/mL (AuNPs 18 nm), dải đo từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL, thời gian phát 25 phút Kết tốt so với 40 cơng trình cơng bố gần đây;  Chế tạo thành cơng ban đầu cảm biến điện hóa sở màng vàng có độ bền, độ chọn lọc, độ nhạy cao để phát vi khuẩn MRSA gây bệnh Kết cho thấy thời gian phát 25 phút, với dải đo từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo hàm ∆Rct = 1,102 x - 0,677, R2 = 0,9879, giới hạn phát hiện: CFU/mL  Luận án công bố giá trị diện tích hoạt động điện hóa (SPE biến tính Ahđ) so sánh với diện tích hình học (SPE trần - A hh) từ kết đo thực nghiệm sử dụng điện cực in lưới cacbon biến tính với vật liệu nano bạc/graphene oxide khử (AgNPs-rGO, tăng 1,53 lần), hạt nano vàng (AuNPs, tăng 1,76 lần), màng nano vàng (AuNFs, tăng 1,92 lần) Kết thu tạo sở cho việc lựa chọn vật liệu nano phù hợp để ứng dụng chế tạo cảm biến phát số tác nhân gây bệnh;  Chế tạo thiết bị cầm tay cho sử dụng cảm biến chế tạo Thiết bị cho phép chẩn đoán lưu động dựa kỹ thuật đo để phát vi khuẩn tại thực địa dạng định tính, dễ sử dụng, thân thiện với môi trường, hiển thị 02 dạng chế độ Pos +: dương tính, Neg-: âm tính Cấu trúc luận án: Luận án trình bày cấu trúc gồm: phần mở đầu chương, kết luận chung Các kết luận án cơng bố cơng trình khoa học (tác giả chính), có 02 báo đăng tạp chí chuyên ngành quốc tế (ISI), 04 báo cáo tại hội nghị nước quốc tế, 03 báo đăng tạp chí chuyên ngành nước Sản phẩm luận án NCS đăng ký sáng chế, giải pháp hữu ích với mã đơn đăng ký: 2-2020-00200 chấp nhận đơn theo định số 1006w/QĐ-SHTT, ngày 21/7/2020 Chương TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học nhiễm trùng bệnh viện 1.1.1 Cảm biến sinh học cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học khái niệm linh kiện tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả dị tìm thay đổi từ phản ứng sinh học chuyển đổi thành tín hiệu điện đầu Các yếu tố nhận biết sinh học enzyme, thụ thể, peptide, oligonucleotide, tế bào sống, kháng thể kháng nguyên Cảm biến sinh học điện hóa phát triển dựa tương tác thành phần sinh học cố định bề mặt chuyển đổi với thành phần sinh học cần phân tích làm thay đổi tín hiệu sinh hố lân cận bề mặt chuyển đổi Sự thay đổi tín hiệu nhận biết chuyển đổi tín hiệu xác định phương pháp đo điện thế, dòng điện, tổng trở hay độ dẫn 1.1.2 Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học ngồi nước Cảm biến sinh học nói chung cảm biến sinh học điện hóa nói riêng hướng nghiên cứu nhà khoa học nước Trong thời gian gần đây, Việt Nam có nhiều nhà khoa học nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học đáng ghi nhận Đầu tiên kể đến nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học thuộc trường Đại học Bách Khoa Hà Nội với định hướng cảm biến sinh học dựa cấu trúc vi điện cực để phát lượng dự thuốc trừ sâu, phát chuyển đổi gen trồng Trong kỹ thuật y sinh, bước đầu phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương chế tạo thiết bị chẩn đoán nhằm phát nhanh vi rút viêm não Nhật Bản Trong lĩnh vực phát vi khuẩn gây bệnh, TS Nguyễn Thị Thủy cộng chế tạo thành công cảm biến điện hóa sở cấu trúc FET biến tính MWNCTs TS Trần Thị Luyến cộng chế tạo thành cơng cảm biến DNA tích hợp với hệ vi lưu, bình phản ứng mini sở biến tính Ppy để phát vi rút Newcastle kết cho giới hạn phát 10 EID 50/mL 60 phút Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu khác đạt nhiều kết tốt, thu hút quan tâm quốc tế nhóm thuộc Trung tâm nghiên cứu thuộc phịng thí nghiệm nano trường Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh với cảm biến sinh học phát glucozơ axít uric máu Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam với cơng trình chế tạo cảm biến xác định sớm ung thu cổ tử cung, vi rút HIV, cholesterol huyết thanh, chất độc aflatoxin sữa Hay nhóm nghiên cứu y sinh thuộc Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội có cơng bố khoa học uy tín kết nghiên cứu thời gian gần 1.1.3 Nhiễm trùng bệnh viện Nhiễm trùng bệnh viện nhiễm trùng mắc phải thời gian nằm viện, xuất 48 sau bệnh nhân vào viện khơng có biểu giai đoạn ủ bệnh nhập viện Đối với bệnh nhân nhi sơ sinh nhiễm trung bệnh viện xuất ngày sau sinh, nhiễm trùng vết mổ sau tháng, phẫu thuật cấy ghép nhiễm trùng sau năm Theo báo cáo khảo sát năm 2015 TS Đinh Vạn Trung, chủ nhiệm khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 điều tra khảo sát 1.320 bệnh nhân nằm viện 48 tính đến thời điểm điều tra Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện 3,86 % nhiễm khuẩn vết mổ chiếm 37,25%, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa 1,96% nhiễm vi rút đường hô hấp 1,96%, nhiễm khuẩn phổi chiếm 33,33%, nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm 19,61%, nhiễm khuẩn huyết catheter chiếm 5,88% Do vậy, việc đầu tư trang thiết bị, bệnh pháp nhằm cho chẩn đoán, khẳng định sớm tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện vấn đề cần thiết bệnh viện 1.1.4 Vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng bệnh viện Vi khuẩn tụ cầu kháng methicillin (methicillin-resistant Staphylococcus aureus MRSA) loại vi khuẩn chịu số kháng sinh định Tụ cầu vàng kháng methicillin coi vấn đề y tế toàn cầu thách thức điều trị Hiện nay, tần suất nhiễm MRSA gia tăng hữu nhiều sở y tế cộng đồng, nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện vấn đề lớn sức khỏe cộng đồng toàn cầu Vi khuẩn E.coli chủng vi khuẩn thường sống ruột người động vật Có nhiều chủng E.coli khác số loại gây tiêu chảy bệnh khác E coli O157:H7 chủng vi khuẩn phổ biến, gây bệnh cho hầu hết cho bệnh nhân mắc phải Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột, giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, sinh sống đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ µm đến µm có vành lơng rung hình roi 1.2 Cảm biến sinh học cở sở SPE phát vi khuẩn gây bệnh 1.2.1 Điện cực in lưới cacbon- SPE Điện cực in lưới (SPE) cacbon phát triển từ năm 1990, linh kiện sử dụng phổ biến kỹ thuật phân tích điện hóa kỹ thuật y sinh nhằm xác định tác nhân gây bệnh, kim loại nặng gây ô nhiễm mơi trường Điện cực có tính vượt trội giá thành thí nghiệm chi phí thấp nhiều so với vật liệu kim loại quý, vật liệu dễ dàng cho trình biến tính nhằm nâng cao khả khuếch đại tín hiệu phận chuyển đổi Điện cực in lưới (SPE) cacbon nhà khoa học chế tạo kỹ thuật in lưới keo cacbon Ưu điểm điện cực cacbon thể qua việc chế tạo đơn giản, khả đáp ứng nhanh, dị tìm dải tuyến tính rộng, u cầu nguồn ni thấp, điện cực có tính ổn định cao sản xuất hàng loạt cho mục đích ứng dụng khác 1.2.2 Vật liệu nano kim loại quý để biến tính điện cực 1.2.2.1 Vật liệu nano vàng Trong việc sử dụng hạt nano vàng để ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học Hạt nano vàng (AuNPs) nhà khoa học sử dụng để biến tính điện cực làm việc Ưu điểm hạt nano vàng diện tích bề mặt riêng lớn, lượng bề mặt cao, khả giảm khoảng cách hạt nano vàng phần tử sinh học cố định, hạt nano vàng hoạt động sợi dây dẫn phần tử cảm nhận bề mặt điện cực trình oxy hóa - khử Các kết hạt AuNPs truyền điện tử cao nhiều tốc độ truyền so với vàng khối Các vật liệu khối có khả truyền điện tử 700 điện tử/giây, hạt nano vàng - AuNPs đạt tới tốc độ chuyển tích điện tử 5.000 điện tử/giây 1.2.2.2 Vật liệu nano lai bạc - oxide graphene khử Các hạt nano kim loại có tính chất ưu việc vượt trội so với vật liệu khối chúng Hạt nano bạc (AgNPs) quan tâm nghiên cứu, chế tạo ứng dụng chúng có nhiều ưu điểm thể tính chất hóa lý đặc biệt độ dẫn điện dẫn nhiệt cao, ổn định hóa học, hoạt tính xúc tác đặc biệt hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Oxide graphene khử (rGO) vật liệu đơn lớp cacbon sắp xếp thành dạng lưới hai chiều cấu thành từ hình lục giác, chúng có tính chất hồn hảo để ứng dụng phân tích điện hóa độ bền học cao, có tốc độ dịch chuyển electron nhanh, tỷ lệ diện tích bề mặt với thể tích lớn 1.4 Kỹ thuật đo điện hóa cảm biến sinh học 1.4.1 Phương pháp qt vịng tuần hồn (CV) Phương pháp quét tuần hoàn Von-Ampe (Cyclic Voltametry) dùng để xác định hệ số khuếch tán xem xét biến thiên thuận nghịch (khả phóng nạp) vật liệu nghiên cứu, điện biến thiên tuyến tính theo thời gian Nguyên lý phương pháp CV áp đặt điện áp biến đổi tuần hoàn vào điện cực làm việc ghi lại dòng tương ứng 1.4.2 Phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai (DPV) Phương pháp đo Von-Ampe xung vi sai sử dụng rộng rãi phân tích điện hóa, phương pháp sử dụng thiết bị đo đơn giản nhiên có khả phát với giới hạn thấp Dòng điện lấy mẫu sau xung ứng dụng thiết lập, trình đo lặp lặp lại cho loạt xung có biên độ không đổi liên tiếp, kết đường cong biểu diễn phụ thuộc dòng điện vào tốc độ quét xung 1.4.3 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) Nguyên lý phương pháp đo phổ tổng trở (EIS) ta cho dao động biên độ nhỏ xoay chiều hình sin U0, tần số góc ω= 2πf qua hệ điện hóa Trong mạch xuất dịng điện đáp ứng hình sin có biên độ I tần số góc ω lệch pha góc ϕ so với điện đưa vào Kết hệ điện hóa đo dạng phổ Nyquist plot Bode plot, giá trị xác định phổ tổng trở tổng trở Z im (tổng trở ảo) Zre (tổng trở thực) Mỗi phần tử mạch điện tương ứng với tính chất hệ điện hóa 1.5 Thiết bị cầm tay cho cảm biến sinh học Mục tiêu nhằm xác định nhanh, kịp thời loại vi khuẩn, vi rút gây bệnh nói riêng thiết bị liên quan đến bảo vệ sức khỏe người quan tâm nhà khoa học Các thiết bị cầm tay kết hợp với cảm biến sinh học tạo chuẩn đoán, xác định vi khuẩn gây bệnh tại thực địa (PoC - Point of Care), việc ứng dụng thiết bị cảm biến để chẩn đốn PoC làm cho giảm chi phí kỹ thuật chẩn đoán, kết xác định nhanh hiệu trình khoanh vùng dập dịch, ngăn chặn vùng phát nhiễm trùng tác nhân gây lên Chương CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH VỚI BẠC-OXIDE GRAPHENE KHỬ 2.1 Đặt vấn đề Hệ vật liệu nano lai bạc-oxide graphene với tiềm hiệu suất cao, kết hợp độ dẫn hạt nano bạc khả trơ mặt hóa học GO số nhà khoa học sử dụng để trực tiếp gián tiếp (biến tính) ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, theo hiểu biết nghiên cứu sinh, việc sử dụng vật liệu nano lai AgNPs-rGO để biến tính chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sở điện cực in lưới cacbon khiêm tốn So sánh với hạt nano bạc, graphene oxít, vật liệu nano lai AgNPs-GO có nhiều đặc tính ưu việt kết hợp với Trong nội dung này, luận án nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa cở sở điện cực in lưới cacbon (SPE) biến tính với vật liệu nano lai bạc graphene oxít (AgNPsrGO) để khảo sát khả phát nhanh vi khuẩn Salmonella 2.2.3 Quy trình chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO Vật liệu nano lai AgNPs-rGO tổng hợp phương pháp thủy nhiệt Phương pháp thủy nhiệt trình tổng hợp phương pháp khử ion phức bạc bề mặt GO sử dụng PVP nhiệt độ, áp suất cao Bước Hòa tan 0,1 g AgNO3 30 mL nước cất máy khuấy từ Sau cho thêm 2,5 mL dung dịch NH4OH nhỏ từ từ (10 phút/lần) giọt để tạo ion phức bạc Bước Hòa tan 0,1g PVP mL nước cất Nhỏ từ từ dung dịch PVP vào dung dịch khuấy 30 phút Bước Cho mL dung dịch GO vào hỗn hợp bước Khuấy 30 phút Bước Thủy nhiệt: Hỗn hợp đưa vào ống Teflon thủy nhiệt 160 oC vòng 2.2.4 Biến tính điện cực in lưới cacbon vật liệu bạc-oxide graphene khử Bề mặt SPE cacbon biến tính với vật liệu nano lai bạc - graphene oxide khử (AgNPs-rGO) thông qua phương pháp nhỏ phủ (drop-casting) Lấy 15 mL dung dịch keo nồng độ 1000 ppM cho vào ống ly tâm eppendorf 1,5 mL khác rung lắc (MX-S, EMC lab) phút, sau ly tâm (Airfuge, Beckman Coulter) phút tốc độ quay 5,000 vòng/phút loại bỏ cẩn thận phần đáy cặn, phần dung dịch sau loại bỏ cặn tiếp tục ly tâm tốc độ 15,000 vòng/phút để lọc lấy hạt nano lai AgNPs-rGO Dung dịch sau phân tán rung lắc đều, sử dụng pipet (loại 10µl) để nhỏ phủ lên bề mặt điện cực WE SPE sau để khơ tự nhiên nhiệt độ phịng khoảng thời gian 30 phút đem sử dụng đưa vào hộp bảo quản khô tủ lạnh 4oC 2.2.5 Cố định kháng thể lên bề mặt điện cực biến tính Quy trình cố định kháng thể vi khuẩn Salmonella thực sau: Bước Điện cực SPE biến tính rửa nước khử ion (3 lần), sau sấy khơ khí N2; Bước Chức hóa bề mặt điện cực: Ủ với 2% MTS/ethanol (1 mL MTS 49 mL ethanol) 60 phút để tạo nhóm thiols (-SH), rửa điện cực ethanol làm khơ khí N2, tiếp tục ủ 30 phút với dung dịch GMBS/EtOH (hòa 12,5 mg GMBS: N- gamma -maleimidobutyrloxy sulphosuccinimide Ester 250 μL Dimethyl sulfoxide - DMSO, sau cho 43 mL EtOH vào dung dịch trên) Q trình nhằm tạo nhóm -NHS[109]; Bước Ủ kháng thể Salmollena: Pha kháng thể μg/mL PBS pH=7,4 dùng pipet (Eppendorf loại 10µL) nhỏ 40 µL µg/mL kháng thể Salmonella lên bề mặt điện cực WE, tiếp tục ủ kháng thể lên điện cực 60 phút tại nhiệt độ phòng qua đêm 4oC [39][109]; Bước Rửa điện cực PBS 0,05M lần, ủ với 0,5% (0.1 M) BSA 30 phút để khóa vị trí gắn kết khơng đặc hiệu; Rửa PBS 0,05 M lần lưu cảm biến 4oC; 2.2.6 Khảo sát khả phát vi khuẩn Salmonella Cảm biến sinh học điện hóa sau chế tạo nhằm xác định nồng độ vi khuẩn Salmonella điều kiện phịng thí nghiệm Bước Chuẩn bị cảm biến sinh học biến tính cố định kháng thể phương pháp liên kết cộng hóa trị ủ kháng nguyên với nồng độ thực nghiệm Để thực đối chứng âm, 1mg/mL BSA, 10 2CFU/mL vi khuẩn E.coli O157được ủ với cảm biến sinh học Bước Chuẩn bị giếng nhỏ (cốc có đường kính cm, mL), có dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl đặt vững chắc hệ đo, dung dịch điện ly vừa đủ để ngập vùng điện cực Bước Cảm biến sau ủ vi khuẩn Salmonella kết nối trạm điện hóa Palmsen thơng qua sockit Thơng số đo qt vịng tuần hồn với thơng số (dải đo E ver= -0,3 V đến 0,6 V, tốc độ quét 50 mVs-1, Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s), đo phổ tổng trở điện hóa (dải tần số từ 0,01 Hz đến 50 kHz, tequ = 10 s, Eac = 0,01 V) Bước Thực phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa qt vịng tuần hồn tương ứng, xuất liệu sang tệp excel đọc, ghi lại giá trị I p,a, Ip,c phương pháp đo CV FIT mạch điện tương đương với phương pháp đo EIS 2.3 Kết thảo luận 2.3.2 Hình thái kích thước hạt nano bạc graphene oxide khử Kết phân tích TEM cho thấy mẫu AgNPs-rGO sau chế tạo phương pháp thủy nhiệt điều kiện nhiệt độ 1600C khoảng thời gian có tỷ lệ phân bố tập trung nhiều kích thước ∼ 20 nm, hạt nano bạc bám dính chặt chẽ GO bền vững Kiểm tra, khảo sát ổn định vật liệu chế tạo được, mẫu đo hiển vi điện tử truyền qua sau tháng bảo quản điều kiện 0C, bọc kín giấy bạc để tránh ánh sáng Kết cho thấy vật liệu nano lai phân bố sau phân tán nước DI, kích thước hình dạng loại vật liệu thay đổi tập trung vào hạt có kích thước trung bình 20 nm, 25 nm 2.3.3 Khảo sát hình thái bề mặt điện cực biến tính Điện cực SPE trước sau biến tính khảo sát bề mặt WE hiển vi điện tử quét (SEM, S-4800) thành phần nguyên tố phổ EDX Bề mặt SPE cacbon trước sau biến tính đưa vào phân tích kính hiển vi điện tử quét Trước biến tính với AgNPs-rGO, WE SPE kiểm tra kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại µm 500 nm, hình ảnh cho thấy bề mặt điện cực sạch với hạt cacbon gắn kết tạo thành dạng xốp Sau biến tính, kết cho thấy bề mặt có hạt AgNPs bám dính đan xen với khe hở màng cacbon 2.3.4 Đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính 2.3.4.1 Đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính Hình 2.10a Kết cho thấy đặc trưng phép đo CV điện cực trần xuất cặp đỉnh oxy hóa khử tại điểm Ep,a1=0,28 V/Ep,c1=0,01 V tương ứng với q trình oxy hóa [Fe(CN)6]4- q trình khử [Fe(CN)6]3- Các thơng số điện hóa dòng điện xác định điện cực trần Ip,a1 = 76,81 µA, Ip,c1 = -75,20 µA, Hình 2.10b biểu diễn trình đo CV điện cực SPE/AgNPs-rGO, kết cho thấy đặc trưng điện hóa tương ứng với điện cực SPE trần đỉnh anốt đỉnh catốt Ep,a2=0,27 V/Ep,c2=0,01 V nhiên giá trị dịng điện có cho thấy khuếch đại tăng cường lên Ip,a2 = 114,90 µA, Ip,c2 = -112,71 µA Hình 2.1: Đặc tuyến CV điện cực biến tính AgNPs-rGO (b) điện cực SPE trần (a) dung dịch điện ly K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mVs-1 Đo phổ tổng trở EIS: Đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính khảo sát đo phổ tổng trợ điện hóa (EIS) Hình 2.12 kết đo đặc trưng phổ tổng trở dạng phổ Nyquist plots, tần số quét từ 50 kHz đến 0,01 Hz, Eac = 0,01 V, Edc = 0,0 V thời gian tequ = 10 s, thời gian cân 1s, lấy mẫu 71 điểm Kết ngoại suy phân tích mạch tương đương phần mềm Equivalent circuit analysis, xác định điện trở chuyển tiếp điện cực SPE trần Rct1 = 2,48 kΩ, điện trở chuyển tiếp điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO R ct2 = 2,03 kΩ, giá trị điện trở chuyển tiếp giảm ∆Rct = 0,45 kΩ điện trở dung dịch điện ly Rdd = 500 Ω, điện dung lớp kép Cd1 = 1,5×10-4 F Cd2 = 1,1×10-4 F, điện trở Warburg T = 1,0x109 Kδ Hình 2.2: Phổ tổng trở điện hóa điện cực SPE trần (a) điện cực SPE biến tính vật liệu nano lai AgNPs-rGO (b) dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM 2.3.6 Phát vi khuẩn Salmonella Để khảo sát phát vi khuẩn Salmonella độ nhạy cảm biến sinh học, 06 điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO cố định với quy trình giống nồng độ kháng thể μg/mL PBS 7,4; điện cực thực điều kiện, sau đem ủ với nồng độ vi khuẩn Salmonella tương ứng 101 CFU/mL, 102 CFU/mL, 103 CFU/mL, 104 CFU/mL, 105 CFU/mL thời gian 25 phút Hình 2.3: Sự thay đổi tuyến tính tín hiệu (η) đầu cảm biến sinh học theo nồng độ vi khuẩn từ 101 CFU/mL ÷ 105CFU/mL dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 0,1 M KCl tốc độ quét 50 mVs-1 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ thay đổi tín hiệu dịng điện đầu cảm biến nồng độ vi khuẩn Salmonella (10nCFU/mL) thực Hình 2.18 cho thấy, cảm biến điện hóa đạt tuyến tính tốt dải làm việc với nồng độ vi khuẩn từ 101CFU/mL đến 105CFU/mL với phương trình ∆Ipeak = 0,02x - 0,01; x 10nCFU/mL, n đến bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,94559 2.3.7 Độ chọn lọc giới hạn phát vi khuẩn Salmonella Để đánh giá khả chọn lọc cảm biến điện hóa sử dụng điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO, cảm biến sau chế tạo thực nghiệm ủ với vi khuẩn E.coli O157 thời gian 25 phút với nồng độ 10 CFU/mL Kết tính tốn từ đường cong CV Hình 2.17 xác định giá trị cực đại cảm biến sinh học điện hóa cho ủ với vi khuẩn Salmonella nồng độ 105CFU/mL (vi khuẩn đặc hiệu) ∆Ipeak/Ipeak = 0,139 cảm biến sinh học điện hóa ủ với vi khuẩn E.coli O157nồng độ 105CFU/mL (khơng đặc hiệu) có giá trị tính ∆Ipeak/Ipeak = 0,021, q trình thực nghiệm nhạy sinh học thực nghiệm với vi khuẩn không đặc hiệu cho thấy cảm biến sinh học ổn định với tỷ lệ tín hiệu/nhiễu lớn 3:1 (S/N>3) Để xác định giới hạn phát (LOD) cảm biến sử dụng phương pháp thực nghiệm, cảm biến xác định độ nhạy với dải phát tuân theo hàm (η) ∆Ipeak /Ipeak= 0,02x 0,01; x 10nCFU/mL, n đến bình phương hệ số tương quan (R 2) đạt 0,94559 nội dung 2.3.7 tỷ số tín hiệu nhiễu S/N>3 [144] Tính tốn xác định giới hạn phát cảm biến SPE/AgNPs-rGO/NHS/Ab/BSA 22 CFU/mL (LOD = 22 CFU/mL) 2.4 Kết luận chương Kết nội dung nghiên cứu sử dụng điện cực SPE biến tính AgNPs-rGO cố định kháng thể phương pháp liên kết cộng hóa trị để phát vi khuẩn Salmonella cho thấy cảm biến sinh học điện hóa làm việc ổn định, có độ nhạy, độ chọn lọc cao, thời gian phát vi khuẩn sớm khoảng từ 25 phút, dải đo từ 10 đến105 CFU/mL, giới hạn phát (LOD) 22 CFU/mL Tuy nhiên việc sử dụng vật liệu AgNPs-rGO biến tính SPE cacbon cho thấy đường quét vịng tuần hồn (CV) trước sau ủ với vi khuẩn Salmonella cảm biến có giá trị Ipeak = 0,048 (102 CFU/mL) nhỏ, giới hạn phát LOD giá trị 22 CFU/mL Do đó, nội dung nghiên cứu sử dụng vật liệu AuNPs NCS triển khai thực Chương luận án 10 Chương CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH HẠT NANO VÀNG (AuNPs) 3.1 Đặt vấn đề Trong nội dung này, NCS tập trung vào việc nghiên cứu chế tạo cảm biến theo quy trình hồn thiện có định hướng ứng dụng thực tế Vi khuẩn mẫu để dị tìm phát 02 loại vi khuẩn E.coli O157và vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện cung cấp Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Các nội dung nghiên cứu chương bao gồm: 1) Nghiên cứu chế tạo hạt nano vàng phương pháp điện hóa đồng thời khảo sát điều kiện điện áp, thời gian để khống chế lựa chọn kích thước hạt nano vàng ứng dụng biến tính điện cực in lưới cacbon; 2) Biến tính điện cực in lưới cacbon hạt nano vàng đồng thời khảo sát ổn định đặc tuyến điện hóa khả bám dính hạt nano vàng vật liệu cacbon SPE; 3) Khảo sát đặc trưng điện hóa điện cực SPE biến tính với AuNPs kích thước hạt 10 nm, 15 nm, 18 nm, 25 nm để lựa chọn phương án tối ứu chế tạo cảm biến; 4) Chế tạo cảm biến phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm thiol để gắn kết kháng thể vi khuẩn E.coli, MRSA; 5) Khảo sát khả phát vi khuẩn 02 chủng vi khuẩn E.coli O157 MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện 3.2 Vật liệu phương pháp 3.2.3 Quy trình chế tạo hạt nano vàng Bước Hai điện cực vàng làm sạch nước DI, sau rung siêu âm 30 phút nhiệt độ phịng Tiếp theo làm khơ thổi khí nitơ Bước Pha 0,05 g natri citrate (0,1%) 50 mL nước DI rung lắc 15 phút, sau đưa vào bình thủy tinh đặt máy khuấy từ gia nhiệt 400C Bước Lắp hai điện cực giá làm hai cực anốt catốt với khoảng cách cm, đặt song song nhau, hai điện cực nhúng vào cốc thủy tinh chứa dung dịch natri citrate ngập cm Bước Kết nối hai điện cực giá trị biên độ U = 3-15 V, thay đổi bước nhảy biên độ V để điều chỉnh kích thước hạt (nếu cần) Thời gian thực điện hóa 60 phút đến 240 phút 3.3 Kết thảo luận 3.3.2 Khảo sát hình thái bề mặt điện cực biến tính Điện cực SPE trước sau biến tính khảo sát thành phần nguyên tố phổ EDX kiểm tra bề mặt WE hiển vi điện tử quét (SEM, S-4800) Trước điện cực SPE cacbon biến tính, WE kiểm tra bề mặt kính hiển vi điện tử quét hình 3.9 A-B Bề mặt điện cực WE sạch có hạt cacbon gắn kết dạng xốp Sau biến tính, cấu trúc hình thái bề mặt điện cực SPE/AuNPs quan sát SEM, kết cho thấy Hình 3.9 C-D, bề mặt điện cực hạt nano vàng - AuNPs bám dính đan xen với khe hở màng cacbon phân bố khắp bề mặt WE SPE 11 Hình 3.1: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao SEM bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNPs độ phân giải 500 nm 1µm 3.3.3 Đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính Hình 3.11 A cho thấy sau biến tính đặc tính điện hóa điện cực trước sau biến tính có hình thái khơng thay đổi thông số với dải đo E vertex= -0,4 V đến 0,6 V, tốc độ quét 50 mVs-1, Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s peak anốt thực sớm với Ep,a = 180 mV điện cực SPE/AuNPs E p,a = 220 mV điện cực SPE trần, dịng điện oxy hóa - khử tăng cường Iredox = 236,01 µA Hình 3.2: Đặc trưng điện hóa điện cực biến tính SPE/AuNPs,(A) qt vịng tuần hồn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS, (C) ổn định điện cực biến tính với 30 vịng quét CV, (D)Von - Ampe xung vi sai dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Trong phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa với dải tần số từ 0,01 Hz đến 100 kHz, t equ = 10 s, Eac = 0,01 V (Hình 3.11 B), giá trị điện trở chuyển tiếp tương ứng xác định SPE trần Rct1 = 1,8 kΩ, điện cực SPE/AuNPs Rct2 = 0,7 kΩ, ∆Rct = 1,1 kΩ Đặc trưng phương pháp đo Von-Ampe xung vi sai DPV dải điện áp E = -0,3 V tới 0,5 V, Epulse = 10 mV, tốc độ quét 20 mVs -1 tpulse = 0,02 s hình 3.11 D xác định giá trị dịng anốt điện cực SPE/AuNPs tương ứng I p,a1 = 208 µA (b) dòng anốt điện cực trần SPE, Ip,a2 = 146 µA (a) Các đặc trưng điện hóa phép đo khảo sát rằng, bề mặt điện cực SPE sau biến tính hat nano vàng AuNPs làm tăng cường trình oxyhóa - khử dịch chuyển điện tử bề mặt điện cực dung dịch điện ly [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] Sự tăng cường dòng điện giảm điện trở Rct giải thích điện cực WE có bám dính hạt AuNPs, với cấu trúc dạng hạt nano có độ dẫn điện tốt làm trình thuận nghịch phản ứng điện hóa xảy tốt với tốc độ chuyển tích nhanh chóng, tín hiệu dịng điện đầu khuếch đại so với tín hiệu dịng điện trước biến tính 12 Hình 3.3: Đặc trưng điện hóa phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai DPV với bước xung Epulse = 10 mV dải 0,1V đến 0,35 V, tốc độ quét 20 mVs-1, t pulse = 0,02s dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] Phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai DPV thực dải 0,1 V đến 0,35 V với bước nhảy Epulse = 10 mV, tốc độ quét 20 mVs -1, t pulse = 0,02 s Hình 3.12 biểu diễn phương pháp đo Von - Ampe vi sai DPV tuyến tính theo hàm số I p,a = 1672,43 x Epulse 12,09, với hệ số tương quan bình phương R = 0,98683 Kết cho thấy ổn định tuyến tính đặc trưng điện hóa điện cực SPE cacbon biến tính hạt nano vàng 3.3.4 Điện cực biến tính phụ thuộc kích thước hạt nano vàng Điện cực WE SPE biến tính với hạt nano vàng có nồng độ 100 ppm kích thước hạt 10 nm, 15 nm, 25 nm Hình 3.13 biểu diễn đặc trưng điện hóa quét CV điều kiện Ever= -0,3 V đến 0,6 V, tốc độ quét 50 mVs -1, Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa dải tần số từ 0.01Hz đến 50kHz, t equ = 10 s, Eac = 0,01 V; đo Von - Ampe xung vi sai (DPV) dải điện áp E = -0,3 V tới 0,5 V, Epulse = 10 mV, tốc độ quét 20 mVs-1 tpulse = 0,02 s Hình 3.4: Đặc trưng điện hóa điện cực SPE/AuNPs phụ thuộc kích thước hạt nano vàng, (A)thế qt vịng tuần hồn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS,(C) Von - Ampe xung vi sai DPV dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Kết cho thấy, kích thước hạt nano vàng trung bình 10 nm cho cường độ dịng điện cực đại oxy hóa khử đạt lớn giảm dần theo độ lớn kích thước hạt AuNPs, Hình 3.13 A Tương ứng với phép đo phổ tổng trở điện hóa, Hình 3.13 B, giá trị điện trở chuyển tiếp giảm dần theo kích thước hạt AuNPs biến tính điện cực SPE Trong Hình 3.13 C, phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai cho thấy dải đo từ -0,3 V đến +0,5 V, điểm pic E p,a = +0,146 V, kết minh chứng cho ổn định điện cực biến tính SPE/AuNPs điện hóa khơng phụ thuộc vào kích thước hạt nano vàng biến tính 13 Bảng 3.1: Tổng hợp thơng số điện hóa thu từ kết đo CV điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm , SPE/AuNFs-15 nm SPE/AuNPs-25 nm Giá trị Iredox (µA) Ip,a Ip,c Ipeak ∆Ipeak/Ipeak SPE trần 80,01 -74,00 154,01 SPE/ AuNPs-10 nm 130,08 -125,12 255,20 0,396 SPE/ AuNPs-15 nm 110,04 -105,02 215,06 0,283 SPE/ AuNPs-25 nm 105,25 105,41 210,66 0,251 Bảng 3.2: Tổng hợp thơng số điện hóa thu từ kết đo EIS điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm SPE/AuNPs-25 nm Giá trị Rct (kΩ) Rct ∆Rct SPE trần 1,81 SPE/ AuNPs-10 nm 0,71 1,10 SPE/ AuNPs-15 nm 1,13 0,68 SPE/ AuNPs-25 nm 1,48 0,33 Bảng 3.3: Tổng hợp thơng số điện hóa thu từ kết đo DPV điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm SPE/AuNPs-25 nm SPE/ SPE/ SPE/ AuNPs-10 nm AuNPs-15 nm AuNPs-25 nm Ipeak (µA) 146,01 214,08 185,61 174,20 ∆Ipeak/Ipeak 0,32 0,21 0,16 Kết tổng hợp Bảng 3.2, Bảng 3.3, Bảng 3.4 cho thấy hạt AuNPs có kích thước 10 nm biến tính điện cực SPE có cường độ khuếch đại lớn nhất, sau đến điện cực SPE/AuNPs-15 nm SPE/AuNPs-25 nm 3.3.5 Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể SPE trần Kết khảo sát điện cực biến tính quy trình cố định kháng thể phương pháp qt vịng tuần hồn tính tốn xác định bảng 3.5 Bảng 3.4: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak tính tốn từ phép đo CV điện cực SPE/AuNPs cố định kháng thể Điện cực Ip,a (µA) Ip,c (µA) Ipeak (µA) SPE/AuNPs 149,08 - 126,93 266,01 SPE/AuNPs/NHS 75,80 - 75,01 150,81 SPE/AuNPs/NHS/Ab 48,60 - 48,10 96,70 SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA 46,20 - 45,62 91,82 (cảm biến sinh học) 3.3.6 Khảo sát khả phát vi khuẩn E.coli O157 cảm biến 3.3.6.1 Phát vi khuẩn E.Coli O157 Cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPE/AuNPs cố định kháng thể khóa đặc hiệu BSA Cảm biến miễn dịch rửa lần nước DI ủ vi khuẩn E.coli nồng đồ từ 102 CFU/mL đến 106CFU/mL thời gian 25 phút 3.3.6.2 Độ nhạy độ chọn lọc cảm biến Để khảo sát độ nhạy cảm biến dò phát vi khuẩn E.coli, 06 điện cực biến tính SPE/AuNPs hình 3.15 A-B thực quy trình chế tạo Sau khóa đặc hiệu điện cực cố định BSA, điện cực rửa nước DI ủ 25 phút với vi khuẩn E.coli nồng độ 101 CFU/mL, 102 CFU/mL, 103CFU/mL, 104 CFU/mL, 105 CFU/mL, 106 CFU/mL 14 Hình 3.15 C cho thấy, cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo phương trình Rct = 1,37x10n - 0,122 với bình phương hệ số tương quan (R2) = 0,96999, n giá trị từ đến Hình 3.5: (A-B) Cảm biến miễn dịch có điện cực biến tính SPE/AuNPs phát vi khuẩn E.coli biến nồng độ 101CFU/ml (a), 102CFU/ml (b), 103CFU/ml (c), 104CFU/ml (d), 105CFU/ml (e), 106CFU/ml (f) phương pháp CV-EIS dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (C) Sự thay đổi giá trị ∆Rct cảm biến hàm tuyến tính theo nồng độ vi khuẩn E.coli Bằng tính tốn xác định giới hạn làm việc cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPE/AuNPs 15 CFU/mL (LOD = 15 CFU/mL) Hình 3.6: (A) Độ chọn lọc cảm biến khảo sát ủ với vi khuẩn đối chứng Salmonella nồng độ 1x103cfu/ml; (B) Kiểm tra thời gian sống cảm biến phương pháp qt vịng tuần hồn CV sau 21 ngày bảo quản kho điều kiện 40C, PBS pH 7,4 Nồng độ vi khuẩn E.coli ủ kiểm tra 102CFU/mL 3.3.6.3 Thời gian sống cảm biến Kết biểu diễn Hình 3.16 B cho thấy, đặc trưng điện hóa khơng thay đổi nhiều trình bảo quản sau ngày, 14 ngày, 21 ngày (các đường CV chồng khít lên nhau) đồng thời cho ủ với vi khuẩn E.coli 25 phút, cảm biến khảo sát cho đặc trưng tốt (tín hiệu dịng điện suy giảm) ngày đầu thí nghiệm 3.3.7 Khảo sát phát vi khuẩn MRSA cảm biến Trước thực việc khảo sát vi khuẩn MRSA kiểm tra có mặt mẫu kính hiển vi điện tử quét SEM (Hình 3.17 A) so sánh đánh giá đặc trưng điện hóa phương pháp cố định kháng thể liên kết cộng hóa trị (Hình 3.17 B) 15 Hình 3.7: (A) kiểm tra có mặt MRSA mẫu; (B) đặc trưng CV bước trình cố định kháng thể MRSA, (a) SPE trần, (b)SPE/AuNPs - 15 nm, (c) SPE/AuNPs/NHS, (d) SPE/AuNPs/NHS/Ab, (e) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA, (f) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA/MRSA dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Khảo sát độ nhạy cảm biến điện hóa Kết Hình 3.18 A cho thấy giá trị điện trở tăng theo nồng độ vi khuẩn MRSA Giá trị Rct tương ứng xác định sau FIT mạch tương đương phần mềm Z-view, giá trị ∆Rct tính tốn cho thấy tuyến tính theo hàm y = 0,40073 x + 0,00871 với hệ số tương quan bình phương R = 0,98028 (Hình 3.18 B) Đánh giá độ chọn lọc cảm biến xác định thông qua việc ủ với 106 CFU/mL vi khuẩn E.coli O157, tín hiệu cho thấy tỷ lệ S/N ≥ 3, đồng thời giá trị giới hạn tính LOD = 13 CFU/mL Hình 3.8: (A) Phổ Nyquist plots cảm biến phát hiệu vi khuẩn MRSA nồng độ 10 CFU/mL(a), 102 CFU/mL (b), 103 CFU/mL (c), 104 CFU/mL (d), 105 CFU/mL (e), 106 CFU/mL (f); (B) Dải phát cảm biến ∆Rct nồng độ khác nhau; (C) độ chọn lọc cảm biến sử dụng vi khuẩn đối chứng E.coli O157ở nồng độ 106 CFU/mL 3.4 Kết luận chương Cảm biến chế tạo ứng dụng phát chủng vi khuẩn E.coli O157 MRSA cho thấy, dải phát từ 10 CFU/mL đến 10 CFU/mL tuyến tính theo hàm Rct = 1,37x10n 0,122 với bình phương hệ số tương quan (R2) = 0,96999, n giá trị từ đến (sử dụng AuNPs kích thước hạt ∼ 18 nm, vi khuẩn E.coli) hàm y = 0,40073 x + 0,00871 với hệ số tương quan bình phương R2 = 0,98028 (AuNPs kích thước hạt ∼ 15 nm, vi khuẩn MRSA) , thời gian phát 25 phút, giới hạn phát tương ứng với 02 vi khuẩn 15 CFU/mL (E.coli) 13 CFU/mL (MRSA), kết so sánh với phương pháp phát khác công bố giới Chương CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH MÀNG NANO VÀNG 16 4.1 Đặt vấn đề Biến tính màng vàng điện cực in lưới cacbon tạo lớp hạt vàng đồng bề mặt, qua cho phép tăng cường độ dẫn điện cực làm việc, tăng diện tích riêng khả tương thích sinh học đặc biệt ổn định tính điện hóa ứng dụng cảm biến sinh học Ngoài ra, lớp vàng trải nên khả liên kết với phần tử sinh học lớn Với mục đích chế tạo loại cảm biến điện hóa có độ bền, độ chọn lọc cao, tăng khả phát hiện, khoảng tuyến tính rộng đặc biệt ứng dụng dị tìm số tác nhân sinh học môi trường điện ly yếu, thể tích nhỏ Trong nội này, nghiên cứu khả phún xạ lớp màng nano vàng lên điện cực làm việc điện cực SPE để khảo sát đặc trưng điện hóa, cố định kháng thể, khả dị tìm vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện 4.2 Vật liệu phương pháp 4.2.3 Biến tính bề mặt điện cực SPE - Chuẩn bị: điện cực SPE (1 lần biến tính), mặt mạ mask (hình 4.1 B), máy hút chân không (REOJ-EM, SDT10, Nhật Bản); máy rung siêu âm RK 102CH, Bandelin, Đức; hệ phún xạ E1045, ION sputter, HITACHI, Nhật - Phương pháp: Mask vệ sinh ban đầu nước DI, sau đưa vào máy rung siêu âm RK 102CH, Bandelin rung lắc 30 phút (gia nhiệt 40 0C) sau làm khơ khí nitơ Điện cực SPE đưa vào hút chân không ( máy REOJ-EM, SDT10, Nhật Bản) 60 phút, tiếp đến lấy điện cực SPE thực so mask gắn kết mặt sau mask Mask sau gắn kết với điện cực đưa vào buồng máy phún xạ E1045 ION, HITACHI Hình 4.1: (A) hệ phún xạ 1045 ION Sputter,(B) mặt lạ - Mask,(C) điện cực SPE biến tính màng nano vàng 4.3 Kết thảo luận 4.3.1 Hình thái bề mặt điện cực quan sát kính hiển vi điện tử quét Bề mặt điện cực sau phún xạ khảo sát kính hiển vi điện tử SEM Hình 4.2 C-D biểu diễn kết khảo sát bề mặt điện cực SPE/AuNFs kính hiển vi điện tử quét SEM có thang đo phóng đại 500 nm 1µ Kết cho thấy lớp màng vàng bám dính chắc chắn lớp cacbon tạo thành dạng lỗ xốp (np-Au) với mục đích làm tăng diện tích hoạt động riêng điện cực so với điện cực dạng đĩa độ bám dính phần tử sinh học 17 Hình 4.2: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét SEM bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNFs độ phân giải 500 nm 1µm 4.3.2 Khảo sát đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính Các thơng số điện hóa SPE biến tính với màng vàng có độ dày phún xạ đo ∼ 20 nm điều kiện phún xạ dòng điện 20 mA thời gian phún xạ là100 s màng vàng khảo sát phương pháp điện hóa Hình 4.4 B-C-D biểu diễn đặc tuyến điện hóa điện cực SPE biến tính màng nano vàng Hình 4.3: Đặc trưng điện hóa điện cực biến tính SPE/AuNFs hình SEM chiều dày màng 20 nm, (B) qt vịng tuần hồn, (C) phổ tồng trở điện hóa EIS, (D) ổn định điện cực biến tính với 30 vịng qt CV dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Kết cho thấy hình dạng đặc trưng điện hóa khơng thay đổi so với trạng thái điện cực SPE trước biến tính, đỉnh cặp đỉnh oxy hóa khử tại điểm E p,a = 0,22 V/Ep,c = 0,02 V tương ứng với q trình oxy hóa [Fe(CN)6]4- q trình khử [Fe(CN)6]3- dung dịch điện ly (hình 4.4 B) Hình 4.4 D biểu diễn đặc tuyến với 30 vòng quét tuần hồn, kết cho thấy đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính màng vàng có nhiều tính ưu việc để triển khai trình chế tạo cảm biến sinh học 4.3.3 Đặc tuyến điện hóa điện cực biến tính phụ thuộc chiều dày màng nano vàng Hình 4.5 biểu diễn đặc trưng điện hóa CV, EIS điện cực SPE biến tính màng vàng với độ dày khác Kết cho thấy, điện cực biến tính chiều dày 20 nm cho đặc trưng điện hóa ổn định có độ khuếch đại dịng điện tốt với I peak = 287,92 µA So sánh với việc sử dụng điện cực SPE biến tính hạt nano vàng kích thước hạt ∼ 20 nm cho thấy tăng cường dòng điện khoảng 30 µA, với giá trị ∆Ipeak/Ipeak tương ứng tăng 11,2% 18 Hình 4.4: Đặc trưng điện hóa điện cực biến tính SPE/AuNFs phụ thuộc chiều dày lớp màng mỏng nano vàng,(A) qt vịng tuần hồn,(B) phổ tồng trở điện hóa EIS dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl 4.3.4 Diện tích hoạt động điện hóa điện cực biến tính Trong hệ thống thuận nghịch dòng cực đại xác định theo cơng thức phương trình Randles - Sevcik: Ip = (2,69.105) n3/2 A D1/2 C ν1/2 (4.1) Trong đó, Ip: dịng điện pic (A) F: số Faraday A: diện tích điện cực (cm ) D: hệ số khuếch tán (cm2/s) C: nồng độ chất phản ứng (mol/cm ) ν: tốc độ quét (V/s) n: số electron trao đổi q trình oxy hóa khử Kết tính tốn điện tích hoạt động điện hóa điện cực SPE biến tính với hạt nano vàng màng nano vàng thu bảng 4.6 Các giá trị lựa chọn Ipeak tương ứng để đánh giá xác định diện tích hoạt động điện hóa điều kiện có tín hiệu khuếch đại điện hóa ổn định, khơng có thay đổi đặc tuyến điện hóa Đối với hạt nano vàng lựa chọn có kích thước hạt ∼ 18 nm (nồng độ 100 ppM), màng nano vàng lựa chọn chiều dày ∼ 20 nm Trong so sánh với diện tích hình học điện cực trần cho giá trị lớn 1.53 lần (SPE/AgNPs-rGO), 1.76 lần (SPE/AuNPs) 1.92 lần (SPE/AuNFs) 4.3.7 Phát vi khuẩn MRSA Để khảo sát độ nhạy cảm biến chế tạo SPE biến tính màng nano vàng, luận án thực đo phổ tổng trở điện hóa cảm biến ủ với vi khuẩn nồng độ từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL Hình 4.5: (A) Cảm biến sinh học có điện cực biến tính SPE/AuNFs phát vi khuẩn MRSA nồng độ 101CFU/mL (a), 102CFU/mL (b), 103CFU/mL (c), 104CFU/mL (d), 105CFU/mL (e), 106CFU/mL (f) phương pháp EIS dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (B) Sự thay đổi giá trị ∆Rct cảm biến sinh học sử dụng điện cực SPE/AuNFs phụ thuộc nồng độ vi khuẩn MRSA 19 Các đường cong Nyquist plots bán cầu hình 4.9 A cho thấy, đặc trưng phương pháp đo điện hóa điện trở chuyển điện tích R ct, điện trở có giá trị phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn ủ mẫu Điện trở chuyển điện tích tăng tuyến tính nồng độ vi khuẩn tăng từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL, đạt giá trị cực đại nồng độ vi khuẩn 10 CFU/mL Hình 4.9 B cho thấy cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo phương trình y = 1,102 x - 0,677 với bình phương hệ số tương quan (R 2) = 0,9879, y ∆Rct, x giá trị từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL LOD điện cực biến tính màng nano vàng tính tốn từ thực nghiệm với 20 mẫu đo cho kết LOD = CFU/mL 4.4 Kết luận chương Trong nội dung chương 4, kết cho thấy đóng góp luận án Biến tính điện cực SPE cacbon màng nano vàng khảo sát đặc tuyến điện hóa đặc trưng 03 chiều dày màng khác 10 nm, 20 nm, 30 nm Từ kết thực nghiệm, tính toán xác định so sánh giá trị diện tích hoạt động điện hóa so với diện tích hình học điện cực SPE/AgNPs-GO (tăng 1.53 lần), SPE/AuNPs (tăng 1.76 lần), SPE/AuNFs (tăng 1.92 lần) Cảm biến ủ kháng thể 10 µg/mL, thời gian phát 25 phút, tín hiệu cảm biến đạt cực đại Ipeak = 43,23 µA Giới hạn phát cảm biến đạt LOD = CFU/mL nhiệt độ phòng, dải phát theo nồng độ vi khuẩn MRSA nồng độ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo hàm ∆Rct = 1,102 x - 0,677, x giá trị từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL, hệ số tương quan bình phương R2 = 0,9879 20 Chương CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO CẦM TAY CHO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA 5.1 Đặt vấn đề Khống chế ngăn chặn kịp thời tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện yêu cầu cấp thiết khơng ngành y tế mà cịn với tất ngành nghề khác liên quan đến việc chăm sóc sức khỏe nay, nhằm giảm thiểu nguy liên quan tới sức khỏe thiệt hại ảnh hưởng mặt kinh tế xã hội Một điểm luận án hướng giải thực trạng triển khai chiến dịch phân tích, chẩn đoán tại thực địa cần thiết bị cảm biến lưu động để phát nhanh vi khuẩn với mục tiêu để sàng lọc, khoanh vùng, chủ động biện pháp cách ly phòng ngừa phù hợp người mắc bệnh nghi ngờ mắc bệnh từ đưa biện pháp phịng hộ cho nhân viên y tế, học viên, người bệnh, người tiếp xúc với mầm bệnh 5.2 Vật liệu phương pháp 5.2.2 Thiết kế khối thiết bị Các thiết bị đo điện hóa giới chủ yếu tập trung cho phân tích phịng thí nghiệm, thiết kế chế tạo theo trạm phân tích có kích thước ngun lý làm việc tương đối phức tạp đặt biệt chi phí để sử dụng khai thác tương đối lớn đến hàng chục nghìn USD khó khăn q trình sử dụng phân tích lưu động Hình 5.1: Sơ đồ khối hệ đo điện hóa Thiết bị điện hóa xây dựng thiết kế chế tạo với mục đích sử dụng cho cảm biến sinh học điện hóa chế tạo để kết hợp thành thiết bị chẩn đốn nhằm dị tìm phát nhanh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện Hệ đo có nhiệm vụ thực cung cấp, xử lý hiển thị tín hiệu từ cảm biến sinh học cảnh báo phát dấu hiệu mức cho phép Với đặc thù đó, luận án phân tích thiết kế dựa điều kiện sẵn có tại Việt Nam Sơ đồ khối hệ đo biểu diễn hình 5.1 5.3 Kết thảo luận 5.3.1 Bảng mạch chủ tín hiệu thực nghiệm Bảng mạch chế tạo hai lớp có cấu trúc TOP BOTTOM chế tạo thành hai khối độc lập có kích thước tổng 160 mm x 80 mm Hình 5.7 Việc thiết kế chế tạo thành hai khối tách biệt giúp dễ dàng thực nghiệm chế tạo, lắp ráp Hình 5.7 biểu diễn bảng mạch hệ đo Trên hình khối nguồn ni đối xứng, phát tín hiệu vào cảm biến Max 038, 02 tách tín hiệu nhận từ cảm biến, xử lý trung tâm STM32, hệ thống giao tiếp máy tính USB, RS323 hiển thị LCD 21 Hình 5.2: Bảng mạch chỉnh hệ đo (A) khối xử ký trung tâm giao tiếp, hiển thị, (B) khối nguồn nuôi, phát tín hiệu vào cảm biến, (C) hình chụp chiếu đứng bảng mạch Bảng mạch thiết kế có 02 hiệu tín hiệu vào cho cảm biến điện hóa A.adj F.adj hiệu chỉnh cần thiết với mục đích ứng dụng cho loại cảm biến sinh học khác để phân tích đối tượng khác theo đặc trưng thông số riêng loại Hình 5.3: Tín hiệu đo thực nghiệm từ bảng mạch chủ máy Osilloscope(A), thiết kế đóng vỏ (B), thử nghiệm tín hiệu khuếch đại (C) Hình 5.8 biểu diễn hình ảnh tín hiệu phát since gốc chưa qua xử lý cho thấy tín hiệu có độ nét tốt, khơng có tác động nhiễu từ bên ngoài, giá trị thực nghiệm với biên độ cỡ 0,1 mV ÷ 850 mV tần số lên tới 100 kHz với dải làm việc mạch cải thiện tỷ số tín hiệu/nhiễu đồng thời thơng qua q trình hiệu chỉnh từ A.adj F.adj ứng dụng cho đối tượng cảm biến cố định với phần tử sinh học khác 5.3.4 Các bước thực nghiệm với hệ đo - Công tác chuẩn bị: Cảm biến miến dịch điện hóa cố định kháng thể bảo quản điều kiện 0C, dung dịch PBS pH7,4, dung dịch điện ly K3K4, cốc pha dung dịch điện ly 50 mL, giếng đặt cảm biến đường kính 10 mm, trang, găng tay, vi khuẩn E.coli O157 vi khuẩn Salmonella, MRSA - Trình tự thực hiện: (thực theo quy trình đo bước) Hình 5.10 biểu diễn trình đo thực nghiệm vi khuẩn E.coli O157 sử dụng thiết bị cảm biến điện hóa 22 Hình 5.4: Mơ hình sử dụng thiết bị (A) cảm biến điện hóa đo thử nghiệm lưu động CDC tỉnh Bắc Ninh (B) 5.3.5 Kết phát vi khuẩn thiết bị đo Hình 56: So sánh khả khảo sát vi khuẩn trạm đo điện hóa Palsen 3.0 sử dụng cảm biến SPE/AgNPs-GO (A), SPE/AuNPs (B), SPE/AuNFs (C) với thiết bị chế tạo(D)sử dụng điện cực SPE/AuNFs Các giá trị chẩn đốn dương tính hay âm tính sau xác định thử nghiệm 20 lần đánh giá so sánh hoạt động thiết bị chẩn đốn với phương pháp sử dụng máy điện hóa Palsens 3.0, giá trị thử nghiệm ban đầu thực theo quy định kỹ thuật giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trứng sản phẩm thịt bị Các sản phẩm trứng tiêu giới hạn với mẫu mẫu tối đa cho phép có hàm lượng vi khuẩn E.coli O157 từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL Hình 5.11 biểu diễn tổng hợp trình thử nghiệm sử dụng thiết bị cảm biến (SPE/AuNFs) phát vi khuẩn E.coli tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, kết cho thấy tín hiệu điện áp hiển thị hình LCD có độ tuyến tính tốt cảm biến ủ với vi khuẩn nồng độ khác Giá trị hệ số tương quan bình phương (R 2) có giá trị ∼ 5.4 Kết luận chương Thiết bị có kết đo hiển thị LCD kích thước hiển thị x 20 kí tự cho biết giá trị làm việc cảm biến sinh học; nhiệt độ môi trường đo mẫu; Kết thử nghiệm đo phát vi khuẩn E.coli O157cho thấy: Thiết bị kết hợp với cảm biến sinh học phát vi khuẩn E.coli O157 dải đo từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL hiển thị hình LCD trạng thái làm việc cảm biến sở điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO, SPE/AuNPs, SPE/AuNFs KẾT LUẬN CHUNG 23 Luận án ”Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sở vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát số vi khuẩn gây bệnh” nghiên cứu sinh nghiên cứu thực giai đoạn từ năm 2016 tại Việt Nam Các kết luận án tóm tắt sau: Chế tạo cảm biến điện hóa sở SPE cacbon biến tính với hệ vật liệu nano bạc/graphene oxít (AgNPs-rGO) Thử nghiệm cảm biến để phát vi khuẩn Salmonella thời gian 25 phút, giới hạn phát (LOD): 22 CFU/mL Chế tạo cảm biến điện hóa sở SPE cacbon biến tính với hạt nano vàng (AuNPs) Cảm biến thử nghiệm phát chủng vi khuẩn E.coli O157 MRSA dải 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL; thời gian phát 25 phút, LOD tương ứng 15 (E.coli O157) 13 CFU/mL (MRSA) Chế tạo cảm biến điện hóa sở SPE cacbon biến tính với màng nano vàng (AuNFs) Cảm biến điện hóa chế tạo thử nghiệm phát vi khuẩn MRSA thời gian 25 phút, LOD: CFU/mL, dải phát hiện: 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL; Chế tạo thiết bị đo cầm tay cho cảm biến điện hóa nhằm phát vi khuẩn gây bệnh tại thực đị Chẩn đốn định tính với hiển thị Pos +: dương tính (màu đỏ); Neg-: âm tính (màu xanh) KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến ổn định làm việc cảm biến với hệ vật liệu biến tính khác điều kiện nhiệt độ, kích thước hạt nano, cường độ dịng phún xạ; Sử dụng kháng thể thứ (antibody-2) trình chế tạo cảm biến với mục tiêu tiếp tục làm giảm giới hạn phát LOD cảm biến; Kiểm chuẩn thiết bị đo cầm tay thông qua quan đánh giá tồn diện thơng số nhằm tối ưu quy trình chế tạo thiết bị phân tích với tín hiệu nhỏ 24 ... điện hóa ứng dụng chế tạo cảm biến điện hóa ứng dụng phát vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh vi? ??n;  Nghiên cứu, chế tạo thành cơng thiết bị đo điện hóa cầm tay cho cảm biến sinh học điện hóa. .. làm vi? ??c cảm biến sở điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO, SPE/AuNPs, SPE/AuNFs KẾT LUẬN CHUNG 23 Luận án ? ?Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa sở vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử. .. Phát triển thành cơng cảm biến điện hóa sở điện cực in lưới cacbon biến tính với hệ vật liệu hệ đo điện hóa cầm tay để phát nhanh số chủng vi khuẩn gây bệnh Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu: