luận án tiến sĩ nghiên cứu đa hình đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 cytochrome p450 ở người kinh việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hải Hà GS TS Nông Văn Hải Hà Nội – Năm 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng với hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hải Hà GS.TS Nông Văn Hải Những kết thu luận án mới, trung thực chưa công bố cơng trình khác Các kết cơng bố chung cán hướng dẫn đồng tác giả cho phép sử dụng Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Nông Văn Hải-nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Chủ tịch hội đồng Khoa học Viện Nghiên cứu hệ gen TS Nguyễn Hải Hà-Phó trưởng phịng Phân tích hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong suốt trình học tập nghiên cứu, tinh thần say mê nghiêm khắc khoa học với hướng dẫn tận tình khích lệ thầy động lực lớn lao giúp không ngừng cố gắng phấn đấu, vượt qua nhiều khó khăn để hồn thành Luận án Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Đăng Tơn-Trưởng phịng Phân tích hệ gen đồng nghiệp cơng tác phịng Phân tích hệ gen ln tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành giúp đỡ suốt trình học tập làm việc chun mơn Phịng Bằng tình cảm chân thành nhất, tơi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu Trong q trình nghiên cứu học tập, tơi nhận ý kiến đóng góp quý báu nhà khoa học, cán nghiên cứu Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Những nhận xét góp ý chuyên môn sâu sắc buổi báo cáo, hội thảo giúp tơi hồn thiện tốt Luận án Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể cán Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè tin tưởng nguồn động viên tinh thần lớn lao suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Vũ Phương Nhung iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CYP450 chuyển hóa thuốc gan 1.2 Đa dạng di truyền gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc 1.2.1 Gen CYP2C9 1.2.2 Gen CYP2C19 11 1.2.3 Gen CYP2D6 14 1.2.4 Gen CYP3A5 17 1.3 Ảnh hưởng đa dạng di truyền gen dược học ADR khác biệt đáp ứng thuốc 20 1.3.1 Khái quát ADR 20 1.3.2 Một số trường hợp đa dạng di truyền gen dược học gây nên khác biệt đáp ứng thuốc 22 1.4 Ứng dụng triển vọng di truyền dược học lâm sàng 29 1.5 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền gen CYP450 32 1.5.1 Các phương pháp nghiên cứu SNP indel 32 1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu CNV 34 1.6 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền số gen CYP450 người Việt Nam phạm vi nghiên cứu luận án 37 1.6.1 Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền gen CYP450 Việt Nam giới 37 iv 1.6.2 Phạm vi nghiên cứu luận án 39 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 41 2.3.2 Xác định nồng độ DNA tổng số 42 2.3.3 Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu gen 43 2.3.3.1 Thiết kế mồi 43 2.3.3.2 PCR đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 .45 2.3.4 Giải trình tự Sanger 46 2.3.4.1 PCR giải trình tự 46 2.3.4.2 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự 47 2.3.4.3 Biến tính sản phẩm PCR điện di mao quản máy giải trình tự 47 2.3.5 Phương pháp MLPA 47 2.3.5.1 Thực phản ứng MLPA 48 2.3.5.2 Điện di mao quản phân tách đoạn 49 2.3.5.3 Phân tích kết phần mềm Coffalyzer 49 2.3.6 Long range (LR) PCR 50 2.3.7 Real-time PCR 51 2.3.8 Phân tích số liệu nghiên cứu 52 2.3.8.1 Phân tích kết giải trình tự Sanger đánh giá trạng thái cân di truyền Hardy-Weinberg quần thể 52 2.3.8.2 Phân tích thống kê 52 2.3.9 Dự đoán chức in silico biến thể 53 2.3.9.1 Dự đoán chức biến thể vùng mã hóa 53 v 2.3.9.2 Dự đoán chức biến thể vùng không mã hóa 53 2.3.9.3 Dự đốn chức biến thể vùng promoter .54 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Tách chiết DNA tổng số 55 3.2 Khuếch đại đặc hiệu gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 giải trình tự 55 3.3 Phân tích đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam 59 3.3.1 Đa hình/đột biến gen CYP2C9 59 3.3.2 Đa hình/đột biến gen CYP2C19 65 3.3.3 Đa hình/đột biến gen CYP2D6 70 3.3.4 Đa hình/đột biến gen CYP3A5 83 3.4 Phân tích liên kết biến thể CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 .85 3.5 Dự đoán chức in silico biến thể tìm thấy CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 87 3.6 So sánh tần số allele gen nghiên cứu quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 90 3.6.1 So sánh tần số allele gen CYP2C9 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 90 3.6.2 So sánh tần số allele gen CYP2C19 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 92 3.6.3 So sánh tần số allele gen CYP2D6 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 93 3.6.4 So sánh tần số allele gen CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam với quần thể người khác giới 96 3.7 Thảo luận 98 3.7.1 Sự phân bố SNP gây ảnh hưởng chức protein CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người giới 98 vi 3.7.2 Phân tích liên kết biến thểvàýnghiã nghiên cứu đa dangg̣ di truyền gen CYP450 102 3.7.3 Vai trò CNV SV gen nghiên cứu đa dạng đáp ứng thuốc cá nhân 103 3.7.4 Vai trò biến thể CYP2C9, CYP2C19 CYP2D6 chức protein tương ứng 105 3.7.5 Ý nghĩa việc sử dụng thông tin di truyền gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc tối ưu hiệu dùng thuốc người Kinh Việt Nam 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN Tên viết tắt ADR CNV CPIC CYP2C19 CYP2C9 CYP2D6 CYP3A5 CYP450 DMSO DNA dNTPs EDTA EM FDA FPR GWAS HSF IM Indel INR LD LR-PCR MLPA PCR PGRN PharmVar PM SNP SRS SSRI SV TPMT UM 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 FVN111 FVN112 FVN113 FVN114 MVN01 MVN03 MVN 04 MVN 05 MVN 06 MVN MVN MVN MVN 10 MVN 11 MVN 12 MVN 13 MVN 14 MVN 15 MVN 16 MVN 17 MVN 18 MVN 19 MVN 20 MVN 21 MVN 22 MVN 23 MVN 24 MVN 25 MVN 26 MVN 27 MVN 28 MVN 29 MVN 30 MVN 31 MVN 32 MVN 33 MVN 34 MVN 35 MVN 36 MVN 37 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 MVN 38 MVN 39 MVN 40 MVN 41 MVN 42 MVN 43 MVN 44 MVN 45 MVN 46 MVN 47 MVN 48 MVN 49 MVN 50 MVN 51 MVN 52 MVN 53 MVN 54 MVN 55 MVN 56 Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2C9 STT Name 251T>C 3235G>C 3411T>C 3415C>T 9032G>C 10311A>G 10376T>C 33622T>C 38658A>G 10 42614A>C 11 42627C>A 12 42726C>T 13 42801A>G 14 47543delT Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2C19 STT Name (-)806C>T (-)98T>C 12637C>G 12662A>G 17948G>A 19154G>A 57637delG 57678T>G 57740C>G 10 80160C>T 11 80161A>G 12 87106T>C 13 87313A>C 14 90008C>T Phụ lục Đánh giá trạng thái cân quần thể biến thể CYP2D6 STT Name (-740) C>T (-678) G>A (-498) C>A (-184) A>T (-175) A>T 100C>T 137insT 214G>C 221C>A 10 223C>G 11 227T>C 12 232G>C 13 233A>C 14 245A>G 15 310G>T 16 1039C>T 17 1661G>C 18 1759G>A 19 1846G>A 20 2097A>G 21 2137G>C 22 2607G>A 23 2611T>A 24 2851C>T 25 2988G>A 26 3157G>T 27 3384A>C 28 3790C>T 29 3851G>A 30 4181G>C Phụ lục Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng LR-PCR (Tham khảo từ Hersberger cộng sự, 2000) Tên mồi Vị trí Dup Dlow DPKup DPKlow Vị trí mồi đánh số dựa trình tự tham chiếu gen CYP2D6 (GenBank Accession No M33388) Riêng mồi Dup nằm vùng nối gen CYP2D7 CYP2D6 (GenBank Accession No X90926) Phụ lục Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự Sanger Gen Vùng gen Promoter Exon Trình tự mồi 5'-AGGGGGTTTAATGGTAAAGGTGT-3' 5'-TGCTGACCAGATCCCACAATA-3' Exon Exon CYP2C9 CYP2C19 5'GCAAGTATAATCATCATCATGGTTTCTATT-3' Exon 5'-CTCTCAGCTTCAAACCCCC-3' 5'-ATGCATGCCGAACTCTTTTT-3' Exon 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3' Exon 5'-TTTGGGCAAGTTGGTCTACA-3' Exon 5'-CACATTTGTGCATCTGTAACCA-3' Exon 5'-TGGAAATGGTACTGCCCTTC-3' Exon 5'-CCCATCCACCCATCTATCTC-3' Promoter Exon 5'-TCCTGCCTTCACGTGTTTTT-3' 5'-TAGTGGGCCTAGGTGATTGG-3' Exon 5'-AGTCAGGCTTAGTAAATGGA-3' Exon 5'-ATCTCCCTCCTAGTTTCGT-3' Exon 5'-ATGCATGCCAAACTCTTTTT-3' Exon 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3' Exon 5'-AGCCAAAGACAAAAACCACATC-3' Exo Exo Exo Pro Exo Exo Exo CYP2D6 Exo Exo Exo Exo Exo Exo CYP3A5 *3 *6 *8 *9 Phụ lục Dữ liệu MLPA CNV gen CYP2D6 số mẫu nghiên cứu V Tên mẫu FVN19 FVN22 FVN23 FVN30 FVN50 FVN69 FVN74 FVN76 FVN86 FVN87 FVN92 FVN94 MVN 03 MVN 09 MVN 26 MVN 37 MVN 41 MVN 42 Các vị trí đầu dị đánh dấu màu vàng: tăng số CYP2D6 Các vị trí đầu dị dánh dấu màu xanh: số CYP2D6 Phụ lục Tổng hợp số liệu kiểu gen kiểu hình chuyển hóa thuốc gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 mẫu nghiên cứu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Mã mẫu FVN01 FVN02 FVN03 FVN04 FVN05 FVN06 FVN07 FVN08 FVN09 FVN10 FVN11 FVN12 FVN13 FVN14 FVN15 FVN16 FVN17 FVN18 FVN19 FVN20 FVN21 CYP2C9 Kiểu gen *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 FVN22 FVN23 FVN24 FVN25 FVN26 FVN27 FVN28 FVN29 FVN30 FVN31 FVN32 FVN33 FVN34 FVN35 FVN36 FVN37 FVN38 FVN39 FVN40 FVN41 FVN42 FVN43 FVN44 FVN45 FVN46 FVN47 FVN48 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 FVN49 FVN50 FVN51 FVN52 FVN53 FVN54 FVN55 FVN56 FVN111 FVN112 FVN113 FVN114 MVN 01 MVN 03 MVN 04 MVN 05 MVN 06 MVN MVN MVN MVN 10 MVN 11 MVN 12 MVN 13 MVN 14 MVN 15 MVN 16 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 MVN 17 MVN 18 MVN 19 MVN 20 MVN 21 MVN 22 MVN 23 MVN 24 MVN 25 MVN 26 MVN 27 MVN 28 MVN 29 MVN 30 MVN 31 MVN 32 MVN 33 MVN 34 MVN 35 MVN 36 MVN 37 MVN 39 MVN 41 MVN 42 MVN 43 FVN75 FVN77 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/Del *1/*3 *1/Del *1/Del *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 - 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 FVN78 FVN79 FVN80 FVN82 FVN83 FVN84 FVN85 FVN86 FVN87 FVN89 FVN90 FVN91 FVN92 FVN93 FVN95 FVN96 FVN97 FVN98 FVN99 MVN 38 MVN 40 MVN 44 MVN 45 MVN 46 MVN 47 MVN 48 MVN 49 - 130 131 132 133 134 135 136 MVN 50 MVN 51 MVN 52 MVN 53 MVN 54 MVN 55 MVN 56 Chú thích: EM: Chuyển hóa thuốc bình thường IM: Chuyển hóa thuốc trung bình PM: Chuyển hóa thuốc yếu ND: Chưa biết - ... nghiên cứu: - Xây dưngg̣ sởdữliêụ v? ?đa hình/ đơt? ?biến 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 ? ?người Kinh Viêt? ?Nam - Xác định kiểu gen tần số allele 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 người Kinh. .. hình/ đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 CYP3A5 quần thể người Kinh Việt Nam 59 3.3.1 Đa hình/ đột biến gen CYP2C9 59 3.3.2 Đa hình/ đột biến gen CYP2C19 65 3.3.3 Đa hình/ đột. .. VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở