Lactobacillus là một trong những vi khuẩn sinh ra probiotic tốt nhất, bởi chúng có khả năng tạo ra các chất có hiệu quả kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít béo, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin …có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn gây bệnh. Trong đó, việc sản xuất hydrogen peroxide bởi Lactobacillus một trong những đặc tính đang được nhiều nhà nghiên cứu chú ý trong những năm gần đây. Khả năng kháng khuẩn của hydrogen peroxide là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng hydrogen peroxide được sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus có tiềm năng trong việc ngăn ngừa và điều trị một số bệnh như: chống oxy hóa ( Achuthan và cộng sự, 2012), các bệnh liên liên quan đến đường âm đạo, đường tiết niệu (Tomas và cộng sự, 2011), giảm dị ứng thực phẩm (Ghaish và cộng sự, 2011),...Do đó, chúng có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất probiotics.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTOBACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG SINH H2O2 ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ vi DANH MỤC VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa .2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 2.1 Tổng quan vi khuẩn Lactobacillus 2.1.1 Phân loại, đặc điểm sinh lý- sinh hóa Lactobacillus .3 2.1.2 Đặc tính, chức sinh học Lactobacillus 2.1.3 Ứng dụng Lactobacillus sức khỏe người: .6 2.1.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Lactobacillus có khả sinh hydroxygen peroxide 2.2 Hydro peroxide- H2O2 ii 2.2.1 Cơ chế, vi khuẩn sinh Hydrogen peroxidase .9 2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn H2O2 .10 2.2.3 Cơ chế chống lại H2O2 vi khuẩn 12 2.2.4 Định tính, định lượng H2O2 13 2.2.5 Lactobacillus sản sinh H2O2- vai trò y học 14 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 15 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.2.2 Mẫu vật nghiên cứu .15 3.2.3 Máy móc thiết bị .15 3.2.4 Hóa chất mơi trường .15 3.3 Nội dung nghiên cứu 16 3.3.1 Nội dung 1: 16 3.3.2 Nội dung 2: 16 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Phương pháp phân lập, làm sạch, nuôi cấy, giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus 16 3.4.2 Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý- sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus 18 3.4.3 Định tính H2O2 sinh từ vi khuẩn Lactobacillus .18 3.4.4 Định lượng H2O2 sinh từ vi khuẩn Lactobacillus 18 3.4.5 Định danh danh pháp đến mức độ loài chủng Lactobacillus có khả sinh H2O2 phương pháp giải trình tự rRNA 16S 20 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Lactobacillus .21 iii 4.2 Kết làm vi khuẩn Lactobacillus .22 4.3 Kết xác định đặc điểm sinh lý- sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus .23 4.3.1 Kết nhuộm gram 23 4.3.2 Kết soi kính hiển vi .23 4.3.3 Kết thử hoạt tính catalase .24 4.4 Định tính định lượng H2O2 24 4.4.1 Định tính 25 4.4.2 Định lượng H2O2 25 4.5 Xác định lồi Lactobacillus có khả sinh H2O2 phương pháp giải trình tự rDNA 16S 28 4.5.1 Kết tách DNA tổng số 28 4.5.2 Kết PCR 29 4.5.3 Kết giải trình tự .30 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Kiến nghị .32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .33 PHỤ LỤC 37 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại Lactobacillus Bảng 2.2 Phản ứng, chất xúc tác hình thành H2O2 Bảng 4.1 Giá trị đo OD620nm mẫu thực 26 Bảng 4.2 Hàm lượng H2O2 sinh chủng vi khuẩn Lactobacillus 27 Bảng 4.3 Kết đo nồng độ DNA mẫu .29 Bảng 4.4 Kết so sánh chủng Lactobacillus với loài vi khuẩn ngân hàng liệu gen NCBI 30 v DANH MỤC HÌNH/ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Lactobacillus sp .4 Hình 2.2 Đồng phân quang học acid lactic Hình 2.3 Cấu trúc phân tử H2O2 .8 Hình 4.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ mẫu phân người sau 48 ni cấy kỵ khí 370C 21 Hình 4.2 Khuẩn lạc Lactobacillus khiết sau 24 ni cấy kỵ khí 37oC .22 Hình 4.3 Kết nhuộm Gram chủng vi khuẩn Lactobacillus .23 Hình 4.4 Hình ảnh Lactobacillus quan sát kính hiển vi vật kính x100 24 Hình 4.5 Kết thử hoạt tính Catalase .24 Hình 4.6 Khả làm đổi màu vi khuẩn Lactobacillus sinh H2O2 25 Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ H2O2 giá trị đo OD620nm 26 Hình 4.8 Kết điện di mẫu DNA tách từ vi khuẩn Lactobacillus M: Marker 1kb; L1, L2, L3 mẫu tách DNA tổng số chủng vi khuẩn L1, L2, L3 .28 Hình 4.9 Kết sản phẩm PCR mẫu DNA tách từ vi khuẩn Lactobacillus M: Marker 1kb plus; L1, L2, L3 sản phẩm PCR tách từ vi khuẩn L1, L2, L3 29 Hình 4.10 Cây phát sinh chủng lồi chủng Lactobacillus lồi có liên quan dựa phân tích so sánh trình tự rRNA 16S .31 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải nghĩa µl Microlit DNA Deoxyribonucleic acid EtBr Ethidium Bromide ĐC Đối chứng kb Kilo basepair MRS De man - Rogosa - Sharpe ml Milliliter nm Nanometer OD Optical Density PCI Phenol-Chloroform-Isopropanol PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA DMSO Dimethyl sulfoxit HRP Horseradish peroxidase TMB 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine LAB Vi khuẩn axit lactic TE Tris-EDTA vii TÓM TẮT Với mục đích đề tài phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả sinh H2O2 định hướng ứng dụng y học, tiến hành thu mẫu phân, phân lập làm vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân người trưởng thành, khỏe mạnh Hà Nội Sau đó, tiến hành kiểm tra số đặc điểm sinh lý – sinh hóa tuyển chọn năm chủng vi khuẩn có khả sinh H2O2 Nồng độ H2O2 sinh từ năm chủng khác nhau: Chủng L1, L2, L3 sinh H2O2 2.067, 2.081, 2.183 (mM) hai chủng L4, L5 không xác định nên lựa chọn ba chủng L1, L2, L3 để định danh danh pháp đến mức độ loài phương pháp giải trình tự 16S rRNA Kết cho thấy, ba chủng chúng tơi quan tâm gần với lồi Lactobacillus plantarum viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có lợi việc ngăn ngừa điều trị số bệnh tiêu chảy, bệnh viêm ruột người, giảm dị ứng thực phẩm, nhiễm trùng rối loạn đường tiết niệu, bệnh liên quan đến đường hô hấp đường tim mạch…Một số vi khuẩn có lợi quan tâm nhiều vi khuẩn Lactobacillus Chúng tìm thấy nhiều nơi tự nhiên như: thực phẩm; thực vật; chất thải; đường dày – ruột, đường miệng đường sinh dục người động vật…Phần lớn lồi Lactobacillus có nguồn gốc từ đường dày – ruột người đối tượng nghiên cứu probiotic cho người sử dụng Lactobacillus vi khuẩn sinh probiotic tốt nhất, chúng có khả tạo chất có hiệu kháng khuẩn như: axít hữu cơ, axít béo, hydrogen peroxide, diacetyl, bacteriocin …có khả ức chế sinh trưởng nhiều loài vi khuẩn gây bệnh Trong đó, việc sản xuất hydrogen peroxide Lactobacillus đặc tính nhiều nhà nghiên cứu ý năm gần Khả kháng khuẩn hydrogen peroxide việc tạo chất oxy hóa mạnh oxygen nguyên tử, gốc tự superoxide gốc tự hydroxyl Nhiều báo cáo chứng minh hydrogen peroxide sản xuất vi khuẩn Lactobacillus có tiềm việc ngăn ngừa điều trị số bệnh như: chống oxy hóa ( Achuthan cộng sự, 2012), bệnh liên liên quan đến đường âm đạo, đường tiết niệu (Tomas cộng sự, 2011), giảm dị ứng thực phẩm (Ghaish cộng sự, 2011), Do đó, chúng có tiềm việc ứng dụng sản xuất probiotics Chính lí nêu trên, chúng tơi tiến hành thực khóa luận với tiêu đề: ”Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả sinh H2O2 định hướng ứng dụng y học.” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả sinh H2O2 định hướng ứng dụng y học 1.2.2 Yêu cầu Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả sinh H2O2 Định tính H2O2 sinh từ chủng vi khuẩn Lactobacillus Định lượng H2O2 sinh từ chủng vi khuẩn Lactobacillus Định danh danh pháp chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh H2O2 phân tích so sánh trình tự nucleotide với trình tự nucleotide ngân hàng liệu 1.3 Ý nghĩa 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài nhằm cung cấp bổ sung nguồn liệu vi khuẩn Latobacillus sp có khả sinh H2O2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài định tính, định lượng H2O2 sinh từ vi khuẩn Lactobacillus sp phân lập từ từ hệ vi khuẩn đường ruột người khỏe mạnh, định danh danh pháp chủng vi khuẩn quan tâm đến mức độ loài phương pháp giải trình tự 16S rRNA phân tích so sánh trình tự nucleotide với trình tự nucleotide ngân hàng liệu Qua đó, bổ sung nguồn liệu cho nghiên cứu vi khuẩn Lactobacillus sp có khả sinh H2O2 Việt Nam, tiền đề cho nghiên cứu nhằm tìm chủng Lactobacillus có tiềm trở thành chủng sản xuất probiotic PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn Lactobacillus Chi Lactobacillus nhóm lớn số Lactobacteriaceae với 180 loài công nhận (Nanda cộng sự, 2018) Chúng vi khuẩn gram dương, khơng hình 43 Svetoslav, 2009 Bacteriocins from Lactobacillus plantarum – production, genetic organization and mode of action Braz J Microbiol, 40(2), pp 209-221 44 Thomas, E L., T W Milligan, R E Joyner, and M M Jefferson, 1994 Antibacterial activity of hydrogen peroxide and the lactoperoxidase-hydrogen peroxide-thiocyanate system against oral streptococci Infect Immun, 62(2), p 529–535 45 Tomáš Větrovský, Petr Baldrian, 2013 The Variability of The 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses Plos One, 8(2) 46 Vera D Mijač, Slobodanka V Đukić, Nataša Z Opavski, Milan K Đukić, Lazar T Ranin, 2006 Hydrogen peroxide producing lactobacilli in women with vaginal infections Obstetric and gynecology and Reproduction Biology, 129(1), pp 69-76 47 von Bockelmann, I., and B von Bockelmann, 1972 The sporicial action of hydrogen peroxide A literature review Lebensm-wiss Technol, Volume 5, pp 221-225 48 Waites, W M., S E Harding, D R Fowler, S H Jones, D Shaw, and M Martin, 1988 The destruction of spores of bacillus subbilotis by the combined effect of hydrogen peroxide and ultraviolet light Appl.Microbiol, Volume 7, pp 139-140 49 Watson and Schubert, 1969 Action of hydrogen peroxidase on growth inhibition of Salmonella typhimurium J.Gen.Microbiol, 57(1), pp 25-34 50 X Yang, E Twitchell, G Li, K Wen, M Weiss, J Kocher, 2015 High protective efficacy of rice bran against human rota virus diarrhea via enhancing probiotic growth,gut barrier function, and innate immunity Scientific Reports 51 Xianyu, Y et al, 2013 Enzymatic Assay for Cu (II) with Horseradish Peroxidase and Its Application in Colorimetric Logic Gate Anal Chem, Volume 85, p 7029–7032 36 PHỤ LỤC Thành phần môi trường MRS Khối lượng/1L Thành phần Peptone 10g Bey extract 10g 3.Yeart extract 4g Glucozo 20g 5.Sodium acetate tri-hydrate 5g Tween 80 1ml Dipotasum hydrogen photphate 2g Tri ammonium citrate 2g MgSO4.7H2O 0.2g 10 MnSO4 0.05g Định lượng pH dung dịch NaOH HCl tùy theo dung dịch sau pha có nồng độ pH thấp hay cao hơn 6.2, tương ứng Với môi trường thạch bổ sung thêm agar bacteria với nồng độ từ 1-2%, 10-20g lít mơi trường 37 Thành phần cách pha hóa chất 2.1 Định tính, định lượng H2O2 Môi trường MRS ( pH=6,2), dung dịch H2O2 thương mại (nồng độ 100mM), HRP -Horseradish peroxide (nồng độ mg/ml), TMB- 3,3’,5,5’- Tetramethylbezidine (nồng độ 10mM) + Cách pha dung dịch H2O2 nồng độ 100mM từ dung dịch H2O2 (30%) Ta có : Mol có 34,01 g H2O2 1000ml dung dịch Vậy : Mol có 3,401 g H2O2 100ml dung dịch + Dung dịch H2O2 (30%) có nghĩa 100 ml dung dịch chứa 30g H2O2 Từ ta tính nồng độ H2O2 dung dịch 8,821 M (nồng độ gốc) + Pha loãng H2O2 từ nồng độ 8.821M xuống 100mM môi trường MRS + Áp dụng công thức: C1.V1 = C2.V2 Trong đó: C1, V1 nồng dộ trước pha loãng C2, V2 nồng độ sau pha loãng Sơ đồ: Cách pha loãng H2O2 - HRP – Horseradish peroxide (sigma) pha loãng với nước cất đến nồng độ 1mg/ml - TMB- 3,3’,5,5’- Tetramethylbezidine (sigma) – nồng độ làm việc 10Mm + Ta có Mol TMB có 240.34g/ L => 100mM TMB có 24,034g/ L hay 0.024g/ml + Cân 0.024 g TMB làm tan ml DMSO, ta dung dịch TMB 100mM + Pha lỗng TMB từ 100mM xuống cịn 10mM cách hút 100µl TMB (100mM) + 900µl DMSO 38 2.2 Dung dịch tách DNA tổng số + Thành phần Lysis buffer: Thành phần Nồng độ NaCl 100mM Tris-HCl 10mM (pH=8) EDTA 100mM (pH=8) SDS 0,5% W/V + Thành phần hỗn hợp PCI: Thành phần Tỉ lệ Phenol 25 Chloroform 24 Isopropanol + Thành phần TE: Nồng độ Thành phần Tris-HCl 10mM EDTA 1mM 2.3 Dung dịch cho điện di + Thành phần TAE 50X 500ml nước: Thành phần Lượng Tris base 121 gram Acid acetic 28,6 gram EDTA 0,5M pH 8.0 50 ml H2 O 500 ml 39 + Thành phần Gel agarose 1%: Thành phần Lượng Agarose gram Đệm TAE 1X 100 ml 2.4 Thành phần phản ứng PCR + Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (nồng độ) H2 O 8,5 µl Master Mix 12,5 µl Mồi xi µl (10 pM) Mồi ngược µl (10 pM) DNA khn µl (200 ng) Tổng thể tích 25 µl + Thành phần Master Mix 2X dùng cho phản ứng PCR: Thành phần Nồng độ Taq Polymerase 0,05 U/µl dNTP 0,4 mM loại (A, T, G, C) Reaction Buffer MgCl mM + Thành phần Loading Dye 10X: Thành phần Nồng độ Tris-HCl pH 8.0 10 mM EDTA pH 8.0 0,1 M SDS 1% 40 Orange G 0,25% Glyxerol 20% Cách thực phản ứng sinh lý- sinh hóa 3.1 Phương pháp soi kính hiển vi Chọn khuẩn lạc đồng nhất, kiểm tra hình thái kính hiển vi - Lấy mẫu: Chuẩn bị vật dụng cần thiết: lam kính, lamen Xác định chủng vi khuẩn phân lập đem quan sát Hơ lam kính lửa đèn cồn để khử trùng Dùng pipet nhỏ vài giọt NaCl 0,9% lên bề mặt lam kính Dùng đầu que tăm khử trùng (hoặc vật có đầu nhọn vơ trùng) chạm vào phần khuẩn lạc vi khuẩn môi trường ni cấy Hịa tan vi khuẩn đầu que tăm vào dung dịch NaCl 0,9% lam kính Phủ lamen lên phần dung dịch lam kính quan sát kính hiển vi - Soi kính hiển vi: Đặt lam kính lên giá đặt mẫu Quay vật kính độ phóng đại x100 Nhỏ vài giọt tinh dầu lên lamen Xoay ốc điều chỉnh sơ cấp cho lam kính chạm vào vật kính Quan sát thị kính xoay ốc điều chỉnh cho quan sát rõ vi khuẩn Xác định loại vi khuẩn (trực khuẩn, cầu khuẩn,…) 3.2 Xác định Gram phương pháp “ String test” Nguyên tắc: Phương pháp “ String test” công bố lần Ryu vào năm 1938, phương pháp đơn giản hiệu dùng để nhận diện nhanh vi khuẩn Gram âm Gram dương (Power, 1995) Quy trình thực hiện: Đầu tiên dùng que cấy lấy mẫu vi khuẩn từ đĩa cấy (hoặc vật dụng khác chứa chủng vi khuẩn phân lập) Hòa tan vi khuẩn vào vài giọt NaCl 0,9% lam kính dàn Cố định cách hơ qua lửa đèn cồn – lần, để nguội Nhuộm dung dịch tím gentians, khoảng phút Rửa vịi nước chảy nhẹ Nhuộm dung dịch lugol để bắt màu màu, khoảng phút Rửa vòi nước chảy nhẹ Tẩy màu cồn 90°, để khoảng 30 giây Rửa nước Nhuộm dung dịch đỏ Fucshin phút Rửa vịi nước Để khơ tự nhiên Soi mẫu vật kính dầu để quan sát rõ ràng 3.3 Phương pháp thử Catalase Mục đích: kiểm tra khả phân huỷ H2O2 sinh O2 vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase 41 Phương pháp: Dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặt phiến kính Nhỏ H2O2 3-10% lên sinh khối vi khuẩn phiến kính Kết quả: Catalase dương tính có tượng sủi bọt khí sau nhỏ dung dịch H2O2 ngược lại khơng xuất bọt khí phản ứng catalase âm tính Cách xác định loài 4.1 Tách DNA tổng số vi khuẩn - Bước 1: Thu tế bào: Cho 1,5ml dung dịch MRS nuôi vi khuẩn cần tách vào ống eppendorf Sau ly tâm 8000 vịng/phút phút Loại bỏ hoàn toàn phần dịch trong, thu cặn chứa tế bào vi khuẩn - Bước 2: Phá màng tế bào: Sử dụng dung dịch Lysozyme để phá lớp màng tế bào vi khuẩn gram dương Hòa phần sinh khối tế bào thu 50 µl Lysozyme Ủ 37oC 30 phút Sử dụng đệm Lysis Buffer 400 µl/1 ống eppendorf Bổ sung 20 µl Proteinase K, sử dụng pipet hút lên-xuống để trộn dịch Ủ 550 C Khoảng 15-30 phút, đảo ống eppendorf khoảng 10 giây - Bước 3: Phân tách thành phần DNA Protein: Bổ sung 400 µl hỗn hợp PCI vào ống eppendorf, Ly tâm 12000 vòng/phút 20 phút Sau ly tâm, dung dịch ống eppendorf phân tách làm lớp: lớp dung dịch Phenol dưới, lớp protein kết tủa giữa, phần dung dịch chứa DNA Hút 300 µl phần dịch nổi, đưa sang ống eppendorf - Bước 4: Sử dụng Isopropanol: Tỉ lệ 1:1 so với lượng dung dịch chứa DNA Sử dụng khoảng 300 µl để nhiệt độ phịng khoảng tiếng + Sau kết tủa DNA, ly tâm dung dịch chứa mẫu 12000 vòng/phút 20 phút Loại bỏ dịch, thu kết tủa DNA Rửa kết tủa DNA 700 µl cồn 70o Ly tâm 12000 vịng/phút 10 phút Loại bỏ dịch, thu kết tủa DNA Làm khô ống Eppendorf - Bước 5: Thu nhận tế bào: Hịa tan kết tủa DNA 30 µl đệm TE có bổ sung RNase theo tỉ lệ 10 TE : RNase Ủ nhiệt độ 30oC tiếng để Rnase hoạt động, loại bỏ thành phần RNA hỗn hợp - Bước : Kiểm tra mẫu: Bằng cách điện di µl mẫu 42 4.2 Phương pháp chạy điện di Nguyên tắc: Các đoạn DNA tích điện âm nên điện trường, DNA từ cực âm sang cực dương Trên gel agarose, đoạn DNA có kích thước, khối lượng khác mang điện tích khác tách di chuyển từ cực âm sang cực dương máy điện di Đoạn DNA nhỏ, di chuyển nhanh nằm phía gần cực dương Điều sở cho việc quan sát đoạn DNA chúng nằm band khác Bản gel chứa DNA nhuộm Ethidium Bromide để bắt màu quan sát đèn chiếu tia cực tím bước sóng 254 nm Hóa chất sử dụng cho phần điện di (xem phụ lục 2.3) Quy trình điện di: - Đổ gel agarose, đợi khơ hồn tồn (khoảng 30 phút) - Lắp đặt thiết bị điện di, đổ dung dịch điện di TAE 1X vào máy điện di - Trộn µl mẫu DNA cần kiểm tra với µl Loading Dye Dùng pipet hút lên xuống cho - Nhỏ giọt mẫu vào giếng theo thứ tự, Dung lượng mẫu tối đa giếng khoảng 15 µl Để trống giếng đầu để tra Marker 1kb - Đậy nắp, đặt cho máy chạy với hiệu điện 100 V, cường độ 40 mA - Đợi cho gel chạy 2/3 dừng lại - Nhuộm gel với dung dịch EtBr khoảng 10-15 phút Sau nhuộm EtBr xen vào cặp base acid nucleic cho phép quan sát chúng gel Soi gel tia cực tím để quan sát DNA 4.3 Phương pháp xác định nồng độ DNA máy quang phổ nanodrop Để xác định nồng độ DNA có dung dịch đệm sau hòa tan, sử dụng máy quang phổ nanodrop để đo Nguyên tắc phương pháp dựa vào hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine Mức độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm (A260) mẫu cho phép xác định nồng độ DNA có mẫu Mức độ hấp thụ phụ thuộc vào yếu tố như: pH, nhiệt độ,… Độ hấp thụ tăng lên 43 môi trường acid base Trong kỹ thuật tách DNA nghiên cứu này, mẫu hòa tan dung mơi đệm TE nhiệt độ phịng - Một đơn vị OD bước sóng 260nm kí hiệu A260 A260 = 1,0 = 50 µg/ml DNA sợi đơi A260 = 1,0 = 37 µg/ml DNA sợi đơn A260 = 1,0 = 20 µg/ml RNA - Nồng độ DNA hay RNA tính theo cơng thức sau: + Nồng độ DNA sợi đôi: CDNA = OD260 x 50 x d (µg/ml) Trong đó: cDNA nồng độ sợi đơi d độ pha loãng mẫu + Nồng độ RNA hay DNA sợi đơn : CDNA/RNA = OD260 x 40 x d Trong đó: CDNA/RNA nồng độ DNA sợi đơn hay RNA - Cách tính xác dung dịch chứa acid nucleic Trong mẫu thường có lẫn tạp chất Những chất thường làm tăng độ hấp thụ mẫu bước sóng 280nm Vì cậy để đánh giá độ tinh dung dịch, người ta tính dựa tỉ số A260/A280 + Nếu T