- Kháng nguyên sẽ dùng để kích thích miễn dịch được phan lập từ phần lành tính, không gây bệnh của v...

- Kháng nguyên sẽ dùng để kích thích miễn dịch được phan lập từ phần lành tính, không gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh, và được tổng hợp bằng các tế bào vi sinh vật hay động vật đã được[r]

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HĨA - BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO ÁN MÔN HỌC

CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM ( ĐƠN VỊ HỌC TRÌNH)

BIÊN SOẠN: GVC.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005

[2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục1997

[3] Lê văn Hiệp: Văcxin ho gà Miễn dịch công nghệ, Nhà xuất y học Hà Nội 2004

[4] Bài giảng kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội

[5] Erick j Vandamme, Marcel Dekker, Biotechnology of industrial Antibiotic, Inc., New York 1984

[6] McKane, Larry, McGraw-Hill, Microbiology, Inc.1996

[7] Harvey W Blanch, Stephen Drew and Daniel I C Wan, Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press, 1985

NỘI DUNG CHƯƠNG TRÌNH PHẦN MỞ ĐẦU:

ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 1.1 Giới thiệu lịch sử chất kháng sinh 1.2 Định nghĩa kháng sinh

1.3 Đơn vị đo kháng sinh 1.4 Phân loại kháng sinh

1.5 Phương pháp định lượng kháng sinh 1.6 Giá trị sử dụng điều trị kháng sinh

1.7 Chức sinh học kháng sinh (cơ chế sinh kháng sinh) 1.8 Hiện tượng chất kháng thuốc

1.9 Nguyên tắc điều hoà sinh tổng hợp kháng sinh

PHẦN 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MỘT SỐ KHÁNG SINH CHƯƠNG 1: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN 1.1 Điêm lịch sử phát công nghệ sản xuất Penicillin.

1.1.1 Điểm lịch sử ( phát năm1928; tinh chế thành cơng 1939; sản xuất cơng nghiệp 1940; lên men chìm penicillin G 1942; tinh chế a xit 6-aminopenicillanic 1959 )

1.1.2 Định nghĩa công thức hoá học tổng quát penicillin. 1.2 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin.

1.2.1 Tuyển chọn chủng công nghiệp.

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc Penicillium chrysogenum.

1.2.3 Phương pháp kiểm tra định lượng penicillin.

1.2.4 Tác động thơng số cơng nghệ đến q trình lên men. - Sự phát triển hệ đặc điểm hình thái sợi.

- Đặc tính nhiệt động dịch lên men - Thành phần môi trường lên men

- Điều kiện tiến hành lên men (nhiệt độ, pH, oxy, khuấy trộn, CO2)

1.3 Qui trình sản xuất penicillin công nghiệp.

* Đặc điểm chung qui trình ( cơng đoạn: Lên men, tinh chế, sản xuất chế phẩm bán tổng hợp, sản xuất thuốc Penicillin bán tổng hợp

1.4 Lên men

1.4.2 Các kỹ thuật lên men ( gián đoạn, bán liên tục, đặc điểm thiết bị )

1.4.3 Hiệu kinh tế chung trình lên men 1.5 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin.

1.5.1 Lọc 1.5.2 Trích ly 1.5.3 Tẩy màu

1.5.4 Kết tinh sấy thu penicillin tự nhiên

1.6 Sản xuất chế phẩm beta-lac tam bán tổng hợp từ penicillin G. 1.6.1 Nhu cầu sản xuất chế phẩm bán tổng hợp.

- Cơ chế tác dụng

- Sự kháng thuốc hướng giải

- Mở rộng đặc tính hiệu điều trị cho chế phẩm

1.6.2 Sản xuất - APA sản xuất penicillin bán tổng hợp.

- Sản xuất 6- AP A (phương pháp hoá học, phương pháp enzim).

- Sản xuất penicillium bán tổng hợp (Phương pháp hoá học, phương pháp enzim)

1.6.3 Sản xuất cephalosporin bán tổng hợp từ penicillin G.

1.6.4 Sản xuất chế phẩm beta - lactam bán tổng hợp có hoạt tính kìm hãm beta- lactamase

CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẤT KHÁNG SINH KHÁC

PHẦN 3: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN CHO NGƯỜI

3.1 Cơ sở sinh hóa cơng nghệ sản xuất vacxin 3.1.1 Hệ thống miễn dịch thể

- Hệ thống miễn dịch tự nhiên - Hệ thống miễn dịch thu

- Các quan tế bào tham gia phản ứng miễn dịch 3.1.2 Tính đặc hiệu ghi nhớ miễn dịch

3.2 Vacxin

3.2.1 Vài nét lịch sử hướng phát triển công nghệ vacxin 3.2.2 Nguyên lý sử dụng vacxin

4.2.4 Các vac xin: vacxin bất hoạt, vaxin tổ hợp, vacxin tái tổ hợp, giải độc tố

4.3 Công nghệ sản xuất vac xin

4.3.1 Cơ sở cho việc thiết kế loại vaxin: thông tin mầm bệnh, đường lây nhiễm, dịch tễ học

4.3.2 Một số kỹ thuật thông dụng sử dụng sản xuất vac xin: Kỹ thuật nuôi tế bào, kỹ thuật gây nhiễm virus, kỹ thuật lên men, kỹ thuật ADN tái tổ hợp, kỹ thuật tách tinh chế protein

4.3.3.Kiểm tra chất lượng vacxin 4.4 Minh họa vài qui trình sản xuất vacxin

4.4.1 Vacxin sống giảm độc lực (Vacxin bại liệt uống tế bào thận khỉ)

4.4.2 Vacxin đơn vị (Vacxin viêm gan chế từ huyết người) 4.4.3 Vacxin bất hoạt tinh chế (Vacxin viêm não Nhật Bản)

4.4.4.Vacxin tam liên (Vacxin DPT: Bạch hầu, ho gà, uốn ván) 4.4.5 Vacxin tái tổ hợp (Vacxin viêm gan B tái tổ hợp

CHƯƠNG 1

ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH:

Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người

Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hố học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng

Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn

Bacillus subtilis có liên quan đến trình hình thành bào tử loại trực khuẩn này.

Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn

Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng sinh" mới Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin

Thập kỷ 40 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt kiện :

 Khám phá hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ Griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol polymicin (1947), clotetracyclin Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin rifamycin (1957)

 Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mơ sản xuất cơng nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) việc hoàn thiện công nghệ lên men sản phẩm khác

 Việc phát hiện, tinh chế sử dụng axit - aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp cho phép tạo hàng loạt dẫn xuất penicilin số kháng sinh  - lactam bán tổng hợp khác

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh:

Chất kháng sinh hiểu chất hoá học xác định, khơng có chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị

1.1.2 Cơ chế tác dụng:

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác -gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1)

1.1.3 Đơn vị kháng sinh:

Năng lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, g/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit

Đơn vị kháng sinh định nghĩa lượng kháng sinh tối thiểu pha thể tích quy ước dung dịch có khả ức chế hồn toàn phát triển chủng vi sinh vật kiểm định chọn, thí dụ, với penicillin số miligam penicillin pha vào 50 ml môi trường canh thang sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với Streptomicin số miligam pha ml môi trường canh thang kiểm định vi khuẩn Escherichia coli).

1.1.4 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu:

Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu đặc tính cho thấy lực kìm hãm hay tiêu diệt cách chọn lọc chủng vi sinh gây bệnh, không gây hiệu ứng phụ ngưỡng cho phép người bệnh điều trị Đặc tính biểu thị qua hai giá trị là:

Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt là MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration - Viết tắt MBC), xác định đối tượng vi sinh vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho chất kháng sinh

1.1.5 Phổ kháng khuẩn kháng sinh:

Phổ kháng khuẩn chất kháng sinh biểu thị số lượng chủng gây bệnh bị tiêu diệt kháng sinh Theo đó, chất kháng sinh tiêu diệt nhiều loại mầm bệnh khác gọi chất kháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh tiêu diệt mầm bệnh chất kháng sinh phổ hẹp

1.2 Hiện tượng kháng thuốc chất kháng thuốc vi sinh vật:

Hiện tượng kháng thuốc: Hiện tượng mầm bệnh sống sót sau đã điều trị kháng sinh gọi tượng kháng thuốc (trên phương diện kiểm nghiệm, vi sinh vật gây bệnh coi kháng thuốc nồng độ MIC chất kháng sinh kiểm nghiệm in vitro đối tượng cao nồng độ điều trị tối đa cho phép bệnh nhân Có hai dạng kháng thuốc:

thành mầm bệnh chúng chưa tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh Dạng kháng thuốc gọi khả đề kháng sinh học Nguyên nhân tượng đột biến ngẫu nhiên nhiễm sắc thể làm quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất tế bào (hay chí cần vài tế bào) có khả kháng thuốc Do đó, bệnh nhân điều trị kháng sinh thời gian định có tế bào thường bị tiêu diệt, tế bào kháng thuốc sống sót, tiếp tục sinh trưởng phát triển dần bù đắep cho số tế bào bị tiêu diệt Kết làm thay đổi hoàn toàn chất vi sinh bệnh vơ hiệu hóa tác dụng điều trị thuốc kháng sinh

Khả đề kháng điều trị: Khả kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh thường xuất phổ biến nhiều sau chúng tiếp xúc với kháng sinh, trường hợp gọi khả đề kháng điều trị Nguyên nhân tượng tế bào vi sinh vật có chứa yếu tố kháng thuốc R tiềm ẩn (Resistance Factor) Yếu tố kháng thuốc R có chất plasmid Khi vi sinh vật sống mơi trường có kháng sinh, plasmid kháng thuốc chúng hoạt hoá, tự chép tổng hợp vơ số plasmid Chính hoạt tính plasmid làm tăng sức đề kháng cho tế bào chủ, nhờ chúng tồn phát triển mơi trường có kháng sinh Do có chất plasmid nên yếu tố kháng thuốc R dễ dàng vận chuyển qua lại loài gần gũi qua biến nạp, tải nạp hay tiếp hợp

Nguyên nhân tượng kháng thuốc:

- Việc sử dụng loại kháng sinh kéo dài lạm dụng thuốc kháng sinh (tuỳ tiện sử dụng thuốc không liều lượng, không định không đủ thời gian cần thiết) vơ tình tạo ưu phát triển cạnh tranh cho chủng vi sinh vật có khả kháng thuốc, đồng thời trở thành liệu pháp kích thích chủng kháng thuốc tổng hợp vơ số plasmid

Cơ chế kháng thuốc: Cơ chế kháng thuốc đa dạng thường khác chủng vi sinh vật:

* Một số loài vi sinh vật có khả kháng thuốc tự nhiên với số kháng sinh định, thuốc không tác động lên chúng ( thí dụ như: nấm, virus, nguyên sinh động vật, thành tế bào khơng có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động kháng sinh β – lactam)

* Một số chủng vốn nhạy cảm với chất kháng sinh trở nên kháng thuốc chúng thu nhận đặc tính như:

Có khả vơ hoạt hay phá hủy chất kháng sinh (bằng cách tổng hợp enzym ngoại bào làm phá vỡ cấu trúc chất kháng sinh hay liên kết với chất kháng sinh để tạo dạng hiệu lực kháng sinh hơn)

Có thể tự điều chỉnh khả hấp thụ màng tế bào chất làm giảm ngăn ngừa chất kháng sinh xâm nhập vào tế bào chất

Có khả làm biến đổi cấu trúc phân tử nơi vị trí mà chất kháng sinh tác dụng vào

Tự điều chỉnh thay đổi đường hướng trao đổi chất để vơ hiệu hóa tác dụng chất kháng sinh đó…

Hiện tượng kháng chéo: Bên cạnh hai tượng kháng thuốc nêu trên, trong thực tiễn cịn tồn tượng kháng chéo (hay kháng nhóm), nghĩa chủng kháng lại chất kháng sinh định chúng có khả kháng ln số chất kháng sinh khác nhóm cấu trúc hay có đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy, thí dụ số chủng vi sinh vật gây bệnh kháng penicillin có trường hợp kháng ln nhiều kháng sinh  - lactam khác

Khắc phục tượng kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh: giải pháp trực quan đơn giản sử dụng dạng kháng sinh Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát sản xuất kháng sinh khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực tiền bạc

Trước hết cần triệt để tôn trọng ba nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh là:  Chỉ định điều trị kháng sinh (làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp để định điều trị; dùng thuốc liều, phác đồ, đủ thời gian điều trị; ý phát sớm dấu hiệu kháng thuốc);

 Nghiêm cấm sử dụng tràn lan chất kháng sinh chăn nuôi giám sát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh thú y

1.3 ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH:

Cũng với tất trình lên men khác, việc điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh nguyên tắc thực qua hàng loạt chế khác nhau, thí dụ, chế cảm ứng, chế kiềm toả, chế ức chế ngược Trong thực tiễn cần phải phối hợp hàng loạt giải pháp khoa học cơng nghệ, cụ thể phân chia thành hai nhóm lớn là:

 Tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh ;  Tối ưu hố thành phần mơi trường, thiết bị lên men điều kiện vận hành trình lên men

1.3.1 Tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh :

Đây thành phối hợp đồng hàng loạt giải pháp kỹ thuật tuyển chọn giống tạo chủng tiên tiến như: kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp giải pháp kỹ thuật gen khác

Nhìn chung, trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinh thường trải qua sáu giai đoạn là:

- Phân lập từ thiên nhiên

- Nghiên cứu xử lý tạo biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao - Tuyển chọn sơ

- Tuyển chọn lại thu chủng có hoạt tính cao quy mơ phịng thí nghiệm - Thử nghiệm tuyển chọn lại quy mô sản xuất thử nghiệm pilot - Thử nghiệm chọn lọc lại chủng phù hợp với điều kiện lên men sản

xuất lớn công nghiệp

Trong giai đoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mơ phịng thí nghiệm cơng đoạn tuyển chọn toàn diện kỹ lưỡng nhất;

có cấu trúc đặc tính mong muốn theo "thiết kế" người), biến chủng nhạy cảm với chất kháng sinh hay chủng có sức đề kháng cao với chất kháng sinh Việc tuyển chọn tạo chủng cơng nghiệp công việc lâu dài tiêu tốn nhiều nhân lực, đòi hỏi phải tiến hành nghiêm túc, liên tục thường xuyên

1.3.2 Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men điều kiện vận hành trình lên men:

- Việc tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men có vai trị quan trọng, định lực hiệu chung tồn q trình: xác định nguồn ngun liệu chính, thành phần mơi trường lên men, nồng độ tương ứng cấu tử thời điểm cụ thể, xác định qua đường thực nghiệm, sở kiểm tra hàng loạt chất dự kiến chính, tiền chất, chất dinh dưỡng khác, chất phụ gia kỹ thuật…

Nguồn thức ăn cacbon thường lựa chọn là: loại bột hạt ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, loại đường ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, loại rượu, dịch thủy phân gỗ, nước thải hồ sunfit…

Nguồn thức ăn nitơ là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, muối NO3-, NH4+…

Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: photpho, lưu huỳnh, ma nhê, sắt, canxi, kali, natri; nguyên tố vi lượng như: đồng, kẽm, coban, molipden… chất sinh trưởng

Việc thay đổi thành phân môi trường, nồng độ cấu tử biến thiên nồng độ chúng suốt q trình có quan hệ chặt chẽ với hoạt động trao đổi chất vi sinh vật, quan hệ chặt chẽ đến sản phẩm tạo thành trình

- Ngồi ra, q trình lên men, người ta khai thác hiệu tác động yếu tố khác môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, oxy hóa khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men

CHƯƠNG 2

CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH PENICILLIN

2.1 ĐIỂM LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ SẢN XUẤT PENICILLIN

- Phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vịng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm

Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929)

Mỹ triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại khơng bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên

Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học cơng bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột

1942: tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL

1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng này

Hình 2.1 Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 cơng trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến

Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6-aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác

2.2 CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN NHỜ NẤM MỐC: 2.2.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum :

Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao thì chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng

P.chrysogenum công nghiệp

- Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin nguyên tắc trải qua sáu giai đoạn mô tả mục 1.3.1, giải pháp kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hố chất, thí dụ Metylbis - amin (metyl -2--clo-etylamin), N-mustar (tris - -clo- -2--clo-etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4

-diepoxybutan

2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum :

Theo quan điểm phổ biến nay, trình sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum tóm tắt sau: từ ba tiền chất ban đầu -aminoadipic, cystein valin ngưng tụ lại thành tripeptit  -(- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; trình khép mạch tạo vòng -lactam vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; trao đổi nhóm -aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng

Hình 2.3 Sơ đồ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-- aminoadipic, L-cystein L-valin

Trong axit amin tiền chất cystein tổng hợp ba đường tổng hợp từ xerin (hình 2.4), từ homoxerin với việc tuần hồn chuyển hóa -cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 2.5), hay từ homoxerin với chuyển hóa - cetobutyrat qua izolecin Đồng thời - aminoadipic giải phóng sơ

Hình 2.4 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin

Hình 2.5 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với biến đổi -cetobutyrat thành oxaloacetat

thuộc vào điều kiện lên men cụ thể định, xảy theo sáu đường hướng khác Do đó, hiệu suất chuyển hố chất - sản phẩm biến đổi phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết hiệu suất lên men khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, thực tế, với chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao đạt khoảng 200 UI/g glucoza

Hình 2.6 Sơ đồ chế sinh tổng hợp - aminoadipic

2.2.3 Tác động thơng số cơng nghệ đến q trình sinh tổng hợp penicillin.

2.2.3.1 Sự phát triển hệ sợi đặc điểm hình thái hệ sợi nấm: Sự phát triển hệ sợi nấm trình lên men bao gồm:

- Sự tăng trưởng kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, lớn lên kích thước, mức độ phân nhánh hệ sợi )

- Sự biến thiên số lượng khóm sợi nấm mơi trường: Thơng thường, phát triển đánh giá qua hai tiêu là: hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối môi trường Hai tiêu xác định nhiều phương pháp khác như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi sinh khối khô), mật độ quang dịch lên men, trở lực lọc dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic Trong phương pháp trên, áp dụng phổ biến sản xuất công nghiệp phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối

Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt yếu tố khác q trình lên men tích tụ penicillin thường xảy mạnh mẽ hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân Trạng thái xác lập cung cấp vừa đủ liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm tự phân, cung cấp nhu cầu trên, hệ sợi phát triển, khơng tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic axit malic

Đặc điểm hình thái cấu trúc hệ sợi nấm: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm có xu hướng tăng lên, trình lên men tĩnh Trong điều kiện lên men có sục khí khuấy trộn, tác dụng va đập học với cánh khuấy chuyển động dịng xốy môi trường, mặt đứt gãy hệ sợi nấm xảy nhiều hệ sợi nấm có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, gọi pellet

 Pellet xốp (fluffy loose pellets) dạng pellet có phần bên hệ sợi cuộn thành khối mịn, lớp sợi phía bên ngồi cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp

 Pellet mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm phần sợi phía bên pellet cuộn tương đối chặt chẽ đến gần sát lớp sợi phía ngồi, lớp sợi phía ngồi cuộn đủ thành lớp sợi mịn

điều chỉnh thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo dạng pellet đủ nhỏ mịn, hạn chế tạo pellet xốp ngăn ngừa hình thành pellet rỗng Điều kiện cơng nghệ tương ứng với mục tiêu thường áp dụng : tỉ lệ giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).1011 bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh sục khí khuấy trộn để

đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, để tạo pellet mịn nhỏ (kích thước pellet thích hợp khoảng 0,2 - 0,5mm), điều kiện cân nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn lượng khuấy trộn

2.2.3.2 Đặc tính nhiệt động dịch lên men:

Trong thiết bị lên men dung tích lớn có sục khí khuất trộn, thực tế không thể xác lập đồng khắp vùng thể tích làm việc thiết bị Tại vùng chảy rối (vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy mạnh mẽ Còn vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng hiệu hay vùng chết thiết bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt giảm Ngoài ra, khu vực định thiết bị xuất vùng xốy cục hay dòng chảy thứ cấp làm thiếu hụt hàm lượng oxy hòa tan

Các yếu tố nêu tác động trực tiếp đến lực sinh tổng hợp chủng, hiệu chuyển hóa tạo sản phẩm hiệu kinh tế chung tồn q trình lên men Thực tế thường chọn chế độ khuấy trộn dư mức yêu cầu

2.2.3.3 Thành phần môi trường lên men:

Môi trường sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu năm 40 -50, môi trường lactoza - nước chiết ngơ, với thành phần nêu bảng 2.1

Nguồn chất chính: lactoza thay phần toàn bộ chất khác như: loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay dầu thực vật Trong chất nêu trên, hiệu cao glucoza

Ngoài ra, sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính tốn điều chỉnh nồng độ glucoza mơi trường lên men (và cản trở trình chuyển khối ảnh hưởng dầu phá bọt)

Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông, loại dầu cám Nhu cầu thức ăn nitơ đáp ứng cách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, trì nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dư

Hàm lượng chất khống bổ sung: tính tốn, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngô sử dụng;

pH môi trường điều chỉnh trước trùng, sau suốt quá trình lên men giám sát chặt chẽ điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ

Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch nhánh phân tử penicillin khơng mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) cho phép thu nhận chủ yếu loại penicillin G dịch lên men (hoặc penicillin V) Theo lý thuyết, nhu cầu phenylaceta 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat 0,50g/gam penicillin V ) Cần ý hai cấu tử thực chất gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm lực lên men chủng sản xuất

2.2.3.4 Điều kiện tiến hành lên men:

Nhiệt độ thơng số có ảnh hưởng lớn đến phát triển nấm mốc, khả năng sinh tổng hợp lực tích tụ penicillin chúng Nhìn chung nấm mốc phát triển thuận lợi dải nhiệt độ khoảng 300C Tuy nhiên, ở dải nhiệt độ tốc độ phân

huỷ penicillin xảy mạnh mẽ Trong thực tế, giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân dải nhiệt độ 300C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng một

 Lên men dải nhiệt độ: Thường trì nhiệt độ suốt trình lên men dải nhiệt độ 25 - 270C.

 Lên men hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành 300C

cho đến hệ sợi phát triển đạt yêu cầu hàm lượng sinh khối điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin dải nhiệt độ 22 - 250C (có cơng nghệ điều chỉnh

xuống 22 - 230C, giữ nhiệt độ tiếp hai ngày chuyển sang lên men tiếp 250C

cho đến kết thúc q trình lên men)

pH mơi trường thuận lợi cho phát triển hệ sợi cho trình sinh tổng hợp penicillin thường dao động khoảng pH = 6,8 - 7,4 Tuy nhiên điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin tăng lên Vì vậy, sản xuất pH môi trường thường khống chế chặt chẽ giá trị lựa chọn khoảng pH = 6,2 - 6,8

Nồng độ oxy hoà tan cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa

Nồng độ CO2 dịch lên men mức định cần thiết cho trình nảy mầm bào tử nấm mốc; nhiên nồng độ CO2 cao làm cản trở

trình hấp thu chuyển hoá chất chủng, nghĩa làm làm cản trở trình sinh tổng hợp penicillin

2.2.3.5 Sự tích tụ phân huỷ penicillin:

Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, có ảnh hưởng nồng độ penicillin tích tụ môi trường ngày tăng, làm cho lực sinh tổng hợp penicillin chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, phần lượng penicillin tích tụ bị phân huỷ theo thời gian

Nhằm giảm tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men

2.3 QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP:

2.3.1 Đặc điểm chung:

 Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên

 Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại

Hình 2.8 Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)) 2.3.2 Chuẩn bị lên men :

Giống, bảo quản nhân giống cho sản xuất: Giống công nghiệp P.chrysogenum bảo quản lâu dài dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh 700C bảo quản

trong nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản cấy chuyền mơi trường thạch hộp để hoạt hố ni thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri cấy chuyển tiếp sang mơi trường bình tam giác, sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian cuối thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọng của công đoạn nhân giống phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo thời điểm hco công đoạn nhân giống cuối cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tiễn, để đảm bảo cho trình lên men thuận lợi người ta thường tính tốn lượng giống cấp cho mật độ giống dịch lên men ban đầu khoảng - 5.109 bào tử / m3

Thành phần mơi trường nhân giống cần tính tốn để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet

Cân đong, pha chế riêng rẽ thành phần môi trường lên men thùng chứa phù hợp

Thanh trùng gián đoạn 1210C ( hay trùng liên tục khoảng 140-1460C)

hoặc lọc qua vật liệu siêu lọc bơm vào thùng lên men

Nếu đặc tính cơng nghệ thiết bị lên men cho phép, pha chế trùng đồng thời dịch lên men thiết bị Tất cấu tử bổ sung vào môi trường lên men phải xử lý khử khuẩn trước sau bổ sung theo chế độ vận hành vơ khuẩn

- Thiết bị lên men: Phải vô khuẩn trước đưa vào sử dụng Thường trùng nhiệt 2,5 – 3,0 at thời gian Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc tất thiết bị phụ trợ khác….Trong trình lên men lun cố gắng trì áp suất dư thiết bị nhằm hạn chế rũi ro nhiễm tạp

- Khơng khí thường khử khuẩn sơ nén đoạn nhiệt, sau qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc

2.3.3 Kỹ thuật lên men:

2.3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt:

Áp dụng từ lâu, khơng cịn triển khai sản xuất lớn Gồm phương pháp:

* Lên men ngun liệu rắn (cám mì, cám ngơ có bổ sung đường lactoza) * Lên men bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường lactoza- nước chiết ngô)

Do đường lactoza nấm mốc đồng hóa chậm nên khơng xảy tượng dư thừa đường tế bào Còn dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, chất khoáng chất sinh trưởng, phenylalanin bị thủy phân tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin

Khi lên men môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men.Trong điều kiện đó, lượng

nấm mốc sử dụng đường lactoza có dấu hiệu cạn kiệt sợi nấm bắt đầu tự phân Vì người ta thường kết thúc trình lên men vào thời điểm hết đường lactoza

2.3.4 Hiệu kinh tế chung trình lên men :

Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, cơng nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ ngun liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, cịn lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men )

2.4 XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN VÀ TINH CHẾ THU PENICILLIN TỰ NHIÊN:

2.4.1 Lọc dịch lên men :

Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết

thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân

Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay.

Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc

Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng

để chế biến thức ăn gia súc 2.4.2 Trích ly :

Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng

penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dịng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thơng số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất

chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung mơi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO3; sau

Hình 2.10 Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung mơi tinh chế penicillin 2.4.3 Tẩy màu :

Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung mơi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung mơi xử lý hồn ngun, phục vụ cho mẻ sau

2.4.4 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên:

2.5 SẢN XUẤT CÁC - LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G 2.5.1 Nhu cầu sản xuất penicillin bán tổng hợp :

Tác dụng điều trị penicillin kháng sinh khác thuộc họ -lactam xác định là: cấu trúc penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptit D-alanin-D-alanin, hợp phần cấu trúc lớp peptido-glucan thành tế bào Do tương đồng đặc tính cấu trúc làm cho hoạt tính enzym tham gia vào trình tổng hợp tế bào bị biến đổi, enzym nhận "nhầm" chất Kết phần thành tế bào tổng hợp với "nhầm lẫn" khơng hình thành, làm cho thành tế bào mầm bệnh có phần hay chúng hồn tồn khơng có thành tế bào chúng dễ dàng bị tự phân môi trường bị công cụ tự vệ thể bệnh nhân tiêu diệt Đồng thời, kháng sinh -lactam liên kết đặc hiệu với số protein màng tế bào chất (đến xác định chín protein trên) Sự liên kết làm "bất hoạt" "hòa tan" protein đặc hiệu màng, dẫn đến làm hoạt tính polymeraza ATPaza (người ta xác định mơi trường kháng sinh có D-alanin -cacboxylpeptidaza hoạt động số ACPaza lại có hoạt tính B-lactamaza yếu) Ngồi ra, người ta phát thấy ảnh hưởng pencillin đến chuyển hóa photpholipit tế bào

Tuy nhiên nhiều trường hợp điều trị với penicillin xuất dấu kháng thuốc Nguyên nhân tượng kháng penicillin chúng tổng hợp đuợc hai enzym penicillinaza đặc biệt enzym -lactamaza Gen mã hóa sinh tổng hợp enzym -lactamaza lưu giữ plasmid (hoặc trasporon ) Vì vậy, với thời gian điều trị, lực kháng thuốc chúng trở nên thành thục Để vô hiệu khả kháng thuốc nêu trên, nguyên lý, giải pháp đơn giản làm vô hiệu khả tương tác enzym với chất cách làm biến đổi cấu trúc phân tử penicillin

2.5.2 Sản xuất axit 6- aminopenicillanic sản xuất penicillin bán tổng hợp Axit 6- aminopenicillanic khơng có hoạt tính kháng khuẩn, sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp nhiều loại penicillin khác cephalosporin Để sản xuất axit 6- aminopenicillanic, đường hiệu lên men sản xuất penicillin G (hoặc penicillin V); sau áp dụng phương pháp hóa học hay sử dụng enzym acylaza để phân cắt mạch nhánh bên xem sơ đồ hình 2.11

Bảng 2.2 Phân bố chi phí sản xuất axit 6- aminopenicillanic (40tấn/năm theo hãng Snam Progetti)

2.5.3 Sản xuất axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA) sản xuất cepalosporin bán tổng hợp

Cepalosporin họ chất kháng sinh thuộc nhóm  -lactam với đặc tính quý nhờ bị kháng thuốc penicillin đánh giá an toàn cho người bệnh Các sản phẩm Cepalosporin bán tổng hợp khác tổng hợp từ sản phẩm trung gian axit 7- deminodeaxetoxy-cepalosporin (7-ADCA xem mục 3) Sản phẩm 7-ADCA tổng hợp từ penicillin G , từ axit 6- aminopenicillanic hay từ cepalosporin C (một sản phẩm lên men tự nhiên), đến cuối kỷ XX đường hiệu kinh tế tổng hợp từ penicillin G theo sơ đồ 2.12

Từ sản phẩm 7-ADCA người ta dễ dàng acyl hóa mạch nhánh tương ứng để sản xuất cepalosporin bán tổng hợp, bao gồm theo hai hướng thay nhánh tai vị trí C7 (thí dụ cephalecin,cephadrin, cephadroxil ), hay

thay đồng thời mạch nhánh hai vị trí C3, C7 (như: cephazolin,

cephatrizin, cefoperazon,cephamadol,cefotiam )

2.5.4 Sản xuất B-lactam bán tổng hợp hoạt tính kìm hãm  -lactamaza

hay kết hợp sử dụng axit clavunic olivanic làm mạch nhánh để làm tăng hiệu điều trị (hai axit có hoạt tính kháng sinh yếu có hoạt tính kìm hãm B-lactamaza (thí dụ axit bromopenicillanic)

CHƯƠNG 3

CÔNG NGHỆ LÊN MEN CEPHALOSPORIN VÀ CEPHAMYCIN

3.1 ĐẠI CƯƠNG

Cephalosporin cephamycin thuộc họ chất kháng sinh có cấu trúc vịng gồm vịng  -lactam liên kết với vịng dihydrotiazin (hình 3.1) Ngày nay, người ta phát nhiều loại nấm, xạ khuẩn vi khuẩn khác có khả tổng hợp Cephalosporin; khả tổng hợp cephamycin tìm thấy xạ khuẩn vài chủng Norcardia.

không độc (liều tiêm da LD50 4g/kg thể trọng) Để sản xuất

CephalosporinC người ta thường sử dụng chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao lồi

cephalosporium acremonium Cơ chế trình tổng hợp Cephalosporin C qua

sản phẩm trung gian penicillin N chúng chuyển hóa tiếp tục theo sơ đồ 3.2 cepaloporin C qua q trình metoxyl hố vị trí C7 hình thành

cephamycin Điểm đặc biệt trình hình thành cephalosporin C mạch nhánh - aminoadipyl liên kết đặc hiệu với vòng  - lactam (hoặc chủng khơng có enzym acyltransferaza), nên việc sử dụng tiền chất tạo nhánh thay trình lên men nhằm thu nhận cephalosporin khác không thu hiệu đáng kể

\

CHƯƠNG 4

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC KHÁNG SINH KHÁC

1 CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC KHÁNG SINH CĨ NGUỒN GỐC TỪ XẠ KHUẨN

1.1.CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM AMINOSID (MINOGLYCOSID)

1.1.1 Streptomycin 1.1.2 Neomycin

1.2 CƠNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHĨM TETRACYLIN 1.2.1 Tetracyclin ( Acromycine, tetracin)

1.2.2 Oxytetracyclin ( terramycin…)

1.3 CƠNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHĨM MACROLID

Erythomycin:

1.3.1 Đặc điểm chủng Streptomyces erythreus 1.3.2 Điều kiên sinh tổng hợp.

1.3.3 Chiết xuất

1.4 KHÁNG SINH CHỐNG NẤM CANDIDA: NYSTATINE

2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH CÓ NGUỒN GỐC VI KHUẨN

PHẦN

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN CHO NGƯỜi CHƯƠNG 7

CƠ SỞ SINH HĨA CỦA CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN

1 Hệ thống miễn dịch thể: 1.1 Khái niệm:

Miễn dịch (hay miễn nhiễm) tập hợp tất chế sinh học giúp cho cơ thể đa bào giữ liên kết tế bào mô, đảm bảo toàn vẹn thể

bằng cách loại bỏ thành phần bị hư hỏng chất sinh vật xâm hại Chức bảo vệ thể bao gồm hai loại chế miễn dịch, xuất q trình tiến hóa loài liên hệ chặt chẽ với động vật bậc cao

1.2 Cơ chế bảo vệ thể 1.3 Phân loại miễn dịch:

 Miễn dịch tự nhiên (hay miễn dịch không đặc hiệu), đáp ứng tức

 Miễn dịch thu (miễn dịch đặc hiệu), đáp ứng sau vài ngày với đặc

điểm khả "ghi nhớ"

Ở cấp độ phân tử, hai chế có khả phân biệt ("nhận diện") thành phần thể, tức "ta" với tất phân tử khác gọi chung "không ta"

Miễn dịch đặc hiệu xuất vào thời điểm phân kỳ động vật có xương sống động vật không xương sống cách 500 triệu năm Miễn dịch tự nhiên có tính ngun thủy hơn, cần thiết cho sinh tồn sinh vật.

1.3.1 Miễn dịch tự nhiên

1.3.2 Miễn dịch tiếp thu ( Miễn dịch thu được)

- Miễn dịch thu chủ động

- Miễn dịch thu thụ động:

Miễn dịch thu thụ động nhân tạo MD nhờ kháng thể chuyển từ bên truyền kháng huyết thanh

1.4 Chất sinh miễn dịch kháng nguyên:

Bất kỳ chất đưa vào thể động vật điều kiện thích hợp gây đáp ứng MD gọi chất sinh miễn dịch.

Bất chất gắn với thành phần đáp ứng miễn dịch ( kháng thể hoặc tế bào lympho hai) gọi kháng nguyên ( nghĩa là các chất đưa vào thể kích thích thể tạo nên kháng thể.

Tất chất sinh miễn dịch kháng nguyên, song có số chất được coi kháng ngun khơng gây đáp ứng MD.Ví dụ Hapten.

Tất protein tự nhiên động vật , thực vật vi sinh vật trạng thái keo có tính kháng ngun.

Các chất độc thực vật ( abin, robin, crotin, rixin, curxin), chất độc động vật ( nọc rắn, nọc ong, nhện…),

Một số polysacarit vi sinh vật, phức hợp protein với lipit, protein với polysacarit có khả kích thích thể để tạo thành kháng thể.

Dưới tác dụng fcmalin hay nhiệt độ, ngoại độc tó bị độc tính nhưng tính chất kháng nguyên giữ nguyên Lúc được gọi anatoxin Anatoxin dùng phổ biến để gây miễn dịch chủ động cho người chống lại bệnh bệnh Bạch hầu, uốn ván v v.

1.4.1 Điều kiện chất sinh MD:

- Tính lạ: Chất gọi kháng nguyên trước hết phải chất lạ thể, bình thường thể không đáp ứng bảo vệ với chất thân Chất lạ khả kích thích tạo kháng thể mạnh nhiêu

- Khối lượng phân tử lớn: Kháng nguyên có KL phân tử > 10000 dalton Nếu < 1000 dalton ( penicillin, progesteron, aspirin …) khơng có tính sinh MD Từ 1000 dến 6000 dalton ( insulin) có khơng có khả đáp ứng MD

- Cấu trúc phân tử phức tạp: Chất có cấu trúc phân tử phức tạp tính mD cao VDb Poly lizin polyme có KL phân tử 3000 dalton, khơng gây đáp ứng MD có cấu trúc đơn giản, Hapten có khối lượng phân tử nhỏ vf khơng có tính sinh MD, gắn với chất có KL phân tử cao ( protein) lại trở thành chát sinh MD

Như vây chất sinh MD không đủ yếu tố cần phải gắn với chất mang để làm tăng KL phân tử có mức độ phức tạp cấu trúc

Sự liên kết kháng nguyên với kháng thể hay kháng nguyên với tế bào lympho mang tính đặc hiệu cao Tính đặc hiệu tương tự enzim với chất, ghĩa khớp với khoa với chìa

Kháng thể hay tế bào lympho khơng phải liên kết với tồn kháng nguyên mà với phần định kháng nguyên gọi định kháng nguyên epitop Kích thước epitop khoảng 7x12x 35 A0 gồm 5-7 axit amin

Phần tương ứng kháng thể gọi vị trí kết hợp kháng ngun paratop Paratop có kích thước tương tự

Phần tương ứng với định kháng nguyên nằm tế bào lympho gọi thụ thể Chẳng hạn thụ thể tế bào T TCR ( T – cell receptor)

Mỗi epitop gắn đặc hiệu với paratop kháng thể hoặc TCR sinh dòng kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên có nhiều epitop khác tạo thành nhiều dòng kháng thể khác tương ứng với epitop

Tính đặc hiệu liên kết kháng thể với kháng nguyên ứng dụng thành phương tiện tầm soát chất nhiều kỹ thuật chẩn đoán Các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên mong đợi gắn nhãn phóng xạ hay huỳnh quang enzyme tạo màu sử dụng "đầu dị" để tìm kiếm kháng nguyên

Các ứng dụng tiếng bao gồm immunoblot, ELISA nhuộm hóa mơ miễn dịch tiêu hiển vi Tốc độ, độ xác đơn giản xét nghiệm thúc đẩy phát triển kỹ thuật chẩn đoán nhanh in vivo bệnh, vi khuẩn chất ma túy Xét nghiệm tương hợp nhóm máu sở phản ứng kháng nguyên-kháng thể

1.5 Kháng thể:

Kháng thể globulin xuất máu động vật đưa kháng nguyên vào thể , có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh Kháng thể định nghĩa gọi kháng thể MD ( Ig- Imunnoglobulin) hay kháng thể đặc hiệu

Kháng thể chủ yếu tìm thấy huyết động vật, huyết chưa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên gọi kháng huyết

Kháng thể cịn tìm thấy trrong thể dịch khác thể, sữa Những kháng thể có sữa hay huyết tương người động vật từ trước có tiếp xúc với kháng nguyên gọi kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu

Hệ thống miễn dịch gồm nhiều quan nhiều loại tế bào nằm rãi rác khắp thể, tác động qua lại để dẫn đến đáp ứng MD cuối cùng.

Ngay trước khái niệm miễn dịch hình thành, nhiều thầy thuốc cổ đại mô tả quan mà sau người ta chứng minh thuộc hệ miễn dịch Các quan hệ miễn dịch gồm tuyến ức, lách, tủy xương, mạch lympho,

hạch lympho mô lympho thứ cấp (như hạch amiđan, V.A.) da Các quan chính, tuyến ức lách, nghiên cứu đơn mặt mô học qua tử thiết Ngồi ra, dùng phẫu thuật lấy hạch lympho số mô lympho thứ cấp để nghiên cứu bệnh nhân sống (sinh thiết)

Nhiều tế bào thuộc hệ miễn dịch không liên kết với quan đặc biệt nào, mà tập trung lưu chuyển nhiều mô khắp thể

Trong hệ thống MD có loại tế bào là: Các tế bào lympho đại thực bào

Tế bào chủ chốt tham gia vào đáp ứng MD tế bào lympho, tổ chức có chứa tế bào lympho tham gia vào đáp ứng MD gọi tổ chức lympho.

Lympho có nguồn gốc từ tế bào nguồn, cịn gọi tế bào gốc, khơng biệt hóa, tuỷ xương Từ tế bào nguồn, nhiều dịng tế bào có chức khác nhau được biệt hóa sau trải qua q trình thành thục hay chín kết hợp với tổ chức chuyên hóa.

3 Tính chất miễn dịch:

3.1 Tính đặc hiệu: Kháng nguyên kháng thể Mỗi kháng nguyên chỉ kết hợp vừa khớp với loại kháng thể đặc hiệu kích thích tạo thành Nó khớp với khóa với chìa Tính đặc hiệu cấu trúc bề mặt phân tử kháng nguyên kháng thể định.

CHƯƠNG 8

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN

1 Khái niệm vắc-xin 1.1 Định nghĩa vacxin:

Vắc-xin chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịchđặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng thể (số) tác nhân gây bệnh cụ thể Các nghiên cứu mở hướng dùng vắc-xin để điều trị số bệnh (vắc-xin liệu pháp, hướng miễn dịch liệu pháp) Thuật ngữ vắc-xin xuất phát từ

vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò đem chủng cho người lại giúp ngừa bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa "con bò cái") Việc dùng vắc-xin để phòng bệnh gọi chung chủng ngừa hay tiêm phòng tiêm chủng, vắc-xin khơng cấy (chủng), tiêm mà cịn đưa vào thể qua đường miệng

Chuẩn bị vắc-xin cúm để chủng ngừa 1.2 Lịch sử hướng phát triển văc-xin

Edward Jenner công nhận người dùng vắc-xin để ngừa bệnh cho người từ người ta chưa biết chất tác nhân gây bệnh (năm 1796) Louis Pasteur với cơng trình nghiên cứu vi sinh học miễn dịch học mở đường cho kiến thức đại vắc-xin

Vào kỷ thứ trước Công nguyên, vua Mithridate VI ngày uống lượng nhỏ độc chất cho thể quen dần nhằm đương đầu với nguy bị ám sát Chuyện kể cách tỏ hiệu sau, Mithridate thất trận tự sát, liều thuốc độc ông ta uống vào chẳng có ép phê

độ định thời gian để giảm độc tính, sau nghiền nhỏ thổi vào mũi người khỏe chưa mắc bệnh đậu mùa để ngừa bệnh

Một phương pháp tương tự dùng Thổ Nhĩ Kỳ vào kỷ 18

Bỏ qua huyền thoại lẻ loi không chắn trên, vắc-xin đầu tiên gắn với tên tuổi Edward Jenner, bác sĩ người Anh Năm 1796, châu Âu đang có dịch đậu mùa, Jenner thực thành cơng thử nghiệm vắc-xin ngừa căn bệnh Kinh nghiệm dân gian cho thấy nơng dân vắt sữa bị có thể bị lây bệnh đậu bò, sau khỏi bệnh, họ trở nên miễn nhiễm bệnh đậu mùa Dựa vào đó, Jenner chiết lấy dịch từ vết đậu bị cánh tay cơ bệnh nhân Sarah Nelmes cấy dịch vào cánh tay cậu bé tuổi khỏe mạnh làng tên James Phipps Sau Phipps có triệu chứng của bệnh đậu bò 48 ngày sau, Phipps khỏi hẳn bệnh đậu bị, Jenner liền tiêm chất có chứa mầm bệnh đậu mùa cho Phipps, Phipps không mắc bệnh này. Cách làm Jenner xét theo tiêu chuẩn y đức ngày thật không ổn, nhưng rõ ràng hành động có tính khai phá: đứa trẻ chủng ngừa đã đề kháng bệnh.

Thời Jenner, virus chưa khám phá, cịn vi khuẩn tìm vai trò gây bệnh chúng chưa biết Thời điểm 1798, Jener cơng bố kết thí nghiệm mình, người ta hình dung có "mầm bệnh" gây nên truyền nhiễm

Sau thí nghiệm thành cơng Jenner, phương pháp chủng đậu được triển khai rộng rãi Tính đến năm 1801, Anh có 100.000 người được chủng

Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả dịch tả tàn sát đàn

gà Ơng cấy vi khuẩn tả phịng thí nghiệm đem tiêm cho gà: bị tiêm chết Mùa hè năm 1878, ơng chuẩn bị bình dung dịch nuôi cấy vi khuẩn dạng huyền phù, để đó, nghỉ mát Khi trở về, ơng lại trích lấy huyền phù đem tiêm cho gà Lần bầy gà bị bệnh nhẹ đàn khỏe lại Pasteur hiểu ông vắng, đám vi khuẩn huyền phù bị biến tính, suy yếu Ơng lấy vi khuẩn tả (bình thường) đem tiêm cho gà vừa trải qua thí nghiệm chưa bị chích vi khuẩn Kết chích vi khuẩn (biến tính) có khả đề kháng lại mầm bệnh, bọn lại chết hết Qua đó, Pasteur xác nhận giả thuyết Jenner mở đường cho khoa

miễn dịch học đại

một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo hiệu đề kháng cho thể sau tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính

Người ta hướng tới triển vọng dùng vắc-xin để điều trị số bệnh nan y ung thư, AIDS v.v

Tuy nhiên, nhiều bệnh thách thức người, chưa có vắc-xin đủ hiệu để ngăn ngừa Trong phải kể nhiều bệnh ký sinh trùng (thí dụ sốt rét, giun, sán), vi khuẩn (lao), virus (cúm, sốt xuất huyết, AIDS v.v.) Một số lý tác nhân gây bệnh biến đổi thường xuyên khiến cho miễn dịch khơng cịn hữu hiệu chí cơng vào hệ miễn dịch trường hợp HIV v.v (Đã có lúc bệnh lao đẩy lùi nhiều biện pháp phối hợp (thuốc, vắc-xin biện pháp phòng ngừa khác), xuất AIDS làm cho dịch lao có dịp bùng phát, nước phát triển.)

Lần lịch sử, người toán bệnh hiểm nghèo Ảnh chụp năm 1977, Ali Maow Maalin, người Somalia, xem là bệnh nhân cuối mắc bệnh đậu mùa

* Một số loại vacxin sử dụng Việt Nam:

Trong chương trình tiêm chủng mở rộng nước ta có loai văc-xin trình bày bảng đây:

Lịch tiêm chủng vacxin chương trình tiêm chủng mở rộng:

Vacxi n

Li ều lượng

Đường tiêm chủng

BCG (phòng lao) 0,1ml Trong da (thường ở cánh tay trái)

Sơ sinh bất kỳ thời gian sau đó

SABI N (phịng bại liệt)

2 giọt

Uống Sơ sinh lúc 2, 3, 4 tháng tuổi Trẻ < tuổi hàng năm uống liều tăng cường cách tháng

DPT (phòng bạch hầu, ho gà, uốn ván).

0,5ml

Tiêm bắp (thường ở đùi)

Lúc 2, 3, tháng tuổi Tiêm mũi tăng cường sau tiêm mũi thứ ba năm.

Sởi

0,5ml

Dưới da (thường ở cánh tay trái)

Lúc tháng tuổi hoặc sớm sau đó.

Ngồi loại vacxin chương trình tiêm chủng mở rộng kể trên, nước ta cịn có số loại vacxin khác sử dụng : vacxin phòng bệnh uốn ván, vacxin phòng bệnh tả, vacxin phòng bệnh thương hàn, vacxin phòng bệnh nhiễm khuẩn H influenzae typ b, vacxin phòng bệnh viêm màng não cầu khuẩn màng não nhóm A C, vacxin phòng bệnh dại, vacxin phòng bệnh viêm gan virus B, vacxin phòng bệnh viêm não Nhật Bản

1 Vacxin phòng bệnh uốn ván:

Là loại vacxin giải độc tố Có loại: vacxin chứa giải độc tố uốn ván vacxin phối hợp với vacxin phòng bạch hầu ho gà (DPT) Giải độc tố vi khuẩn uốn ván hấp phụ với phosphat nhôm

Vacxin tiêm bắp mũi 0,5ml Tạo miễn dịch tiêm mũi cách tháng Sau đến 12 tháng tiêm nhắc lại

Đối với phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, mũi tạo miễn dịch bản, tiêm mũi thứ cách mũi thứ tháng có thai, tiêm mũi thứ cách mũi thứ 12 tháng có thai lần sau

2 Vacxin phòng bệnh tả:

Vacxin phòng bệnh tả dùng nước ta vacxin bất hoạt gồm sinh typ cổ điển, sinh typ Eltor biến chủng O139 Vacxin dạng huyền dịch đưa vào thể theo đường uống

Đối tượng sử dụng: lứa tuổi vùng có dịch tả lưu hành 3 Vacxin phịng bệnh thương hàn:

Có loại vacxin phòng bệnh thương hàn sử dụng:

Vacxin polysaccharid Pháp có tên Typhim Vi Vacxin Typhim Vi dùng cho trẻ tuổi người lớn, tiêm da tiêm bắp Vacxin sống giảm độc lực Hàn Quốc có tên Zerotyph Vacxin Zerotyph dùng cho trẻ tháng tuổi người lớn, theo đường uống

4 Vacxin phòng nhiễm khuẩn H influenzae:

Đây loại vacxin chế từ kháng nguyên vỏ H.influenzae typ b Vacxin Pháp có tên Act-HiB loại vacxin liên kết, thành phần gồm polysaccharid vỏ H influenzae typ b gắn với giải độc tố vi khuẩn uốn ván

Vacxin dùng cho trẻ từ tuổi trở xuống theo đường da tiêm bắp mũi 0,5ml Trẻ tháng tuổi tiêm mũi cách tháng Trẻ đến 12 tháng tuổi tiêm mũi cách tháng Trẻ từ đến tuổi tiêm mũi

5 Vacxin phòng bệnh viêm màng não cầu khuẩn màng não nhóm A nhóm C

Vacxin sản xuất từ polysaccharid cầu khuẩn màng não nhóm A nhóm C Vacxin sử dụng cho trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên Tiêm da tiêm bắp mũi 0,5ml

6 Vacxin phịng bệnh dại:

Có loại vacxin phòng dại: vacxin chết vacxin sống giảm độc lực Vacxin sử dụng nước ta thuộc loại vacxin sống giảm độc lực, vacxin Fuenzalida vacxin Verorab

Vacxin dại tiêm cho người bị động vật nghi dại cắn (xem mục “Cách xử lý trường hợp bị chó nghi dại cắn” “Virus dại”) Với vacxin Fuenzalida, tiêm da mũi cách nhật, mũi 0,1ml cho trẻ tới 15 tuổi, mũi 0,2ml cho người 15 tuổi Với vacxin Verorab, tiêm da tiêm bắp mũi, mũi 0,5ml vào ngày (ngày bắt đầu tiêm), 3, 7, 14, 30; tuỳ ý tiêm nhắc lại mũi 0,5ml vào ngày thứ 90

7 Vacxin phòng bệnh viêm gan virus B

Vacxin phòng bệnh viêm gan virus B có loại: vacxin hệ sản xuất từ kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có huyết tương người lành; vacxin hệ sản xuất từ HBsAg tạo nhờ công nghệ gen (ADN tái tổ hợp) nấm men

dưới da tiêm bắp mũi cách tháng, mũi 0,5ml, tiêm nhắc lại 0,5ml sau năm Đối với người lớn, tiêm mũi mũi 1ml: mũi thứ hai cách mũi thứ tháng, mũi thứ cách mũi thứ hai tháng; sau năm tiêm nhắc lại mũi 1ml 8 Vacxin phòng viêm não Nhật Bản:

Vacxin phòng viêm não Nhật Bản thuộc loại vacxin virus bất hoạt Vacxin tiêm da, mũi 0,5ml cho trẻ tuổi, mũi 1ml cho trẻ từ tuổi trở lên

Để tạo miễn dịch bản: tiêm mũi Tiêm nhắc lại năm mũi vùng có dịch Tiêm nhắc lại năm mũi vùng khơng có dịch

* Hướng phát triển vacxin mới:

Một số vacxin để phòng chống nhiễm trùng vi khuẩn, virus ký sinh trùng thử nghiệm vacxin phòng bệnh hủi, bệnh lỵ trực khuẩn, nhiễm trùng S pneumoniae, virus Rota, ký sinh trùng sốt rét Người ta hy vọng thời gian không xa có vacxin phịng giang mai, lậu HIV/AIDS

Các vacxin phịng nhiễm khuẩn đường tiêu hố phát triển theo hướng nghiên cứu sản xuất vacxin đưa vào thể theo đường uống để kích thích đáp ứng miễn dịch chỗ Cũng theo hướng kích thích đáp ứng miễn dịch chỗ, nhà khoa học nghiên cứu vacxin phòng nhiễm trùng đường hơ hấp đưa vào thể cách khí dung

Sự tiến nhanh chóng khoa học kỹ thuật nói chung cơng nghệ sinh học nói riêng tạo khả sản xuất vacxin làm cho vacxin có hồn thiện

Kỹ thuật giúp cho hiểu biết đầy đủ vai trò thành phần kháng ngun q trình kích thích thể đáp ứng miễn dịch tạo khả chiết tách tinh chế thành phần hữu hiệu để đưa vào vacxin, vừa làm tăng hiệu lực vừa làm giảm phản ứng không mong muốn Công nghệ gen cho đời loại vacxin nhiều ưu điểm vượt xa vacxin cũ: tinh khiết, phản ứng phụ, hiệu lực tạo miễn dịch cao, sản xuất nhanh giá thành thấp

1.3 Nguyên lý sử dụng vacxin

Sử dụng vacxin đưa vào thể kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên giống vi sinh vật gây bệnh, bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết, làm cho thể tự tạo tình trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh

Nói cách khác: sử dụng vacxin tạo miễn dịch chủ động nhân tạo

như làm tăng trình thực bào nhờ kháng thể đóng vai trị yếu tố opsonin đặc hiệu, nhờ lymphokin hoạt hoá đại thực bào

1.4 Cơ chế hoạt động vắc-xin

Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin vật lạ nên hủy diệt chúng "ghi nhớ" chúng Về sau, tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập thể, hệ miễn dịch tư sẵn sàng để cơng tác nhân gây bệnh nhanh chóng hữu hiệu (bằng cách huy động nhiều thành phần hệ miễn dịch, đặc biệt đánh thức tế bào lympho nhớ) Đây ưu điểm đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

1.5 Đặc tính vacxin 1.5.1 An tồn

Một vacxin lý tưởng sử dụng không gây bệnh, không gây độc không gây phản ứng Sau sản xuất vacxin phải quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ mặt vô trùng, khiết không độc

- Vô trùng: Vacxin không nhiễm vi sinh vật khác, vi sinh vật gây bệnh

- Thuần khiết: Ngồi kháng ngun đưa vào để kích thích thể đáp ứng miễn dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không lẫn thành phần kháng nguyên khác gây phản ứng phụ bất lợi

- Không độc: Liều sử dụng phải thấp nhiều so với liều gây độc Tuy nhiên, vacxin đạt độ an tồn tuyệt đối Về nguyên tắc, vacxin phải đảm bảo đủ độ an tồn Song thực tế khơng thể đạt mức độ an toàn tuyệt đối Tất vacxin gây phản ứng phụ số người

Phản ứng chỗ:

Những phản ứng nhẹ thường gặp sau tiêm chủng nơi tiêm đau, mẩn đỏ, sưng cục nhỏ Những phản ứng nhanh chóng sau vài ngày, khơng cần phải can thiệp Nếu tiêm chủng khơng đảm bảo vơ trùng, nơi tiêm chủng bị viêm nhiễm, làm mủ

Phản ứng toàn thân:

Trong phản ứng toàn thân, sốt hay gặp cả, khoảng từ 10 đến 20 % Sốt thường hết nhanh sau vài ngày Co giật gặp với tỷ lệ thấp, khoảng phần vạn, hầu hết khỏi khơng để lại di chứng Một số vacxin gây phản ứng nguy hiểm hơn, có sốc phản vệ, nhiên gặp

Khi bàn phản ứng vacxin, cần phải nhấn mạnh mức độ nguy hiểm vacxin nhỏ nhiều so với mức độ nguy hiểm bệnh nhiễm trùng tương ứng gây Thí dụ, tỷ lệ biến chứng nguy hiểm bệnh ho gà gấp hàng trăm đến hàng nghìn lần phản ứng nguy hiểm vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván gây

Khi cân nhắc để định xem vacxin có đưa vào sử dụng hay không, cần phải so sánh mức độ phản ứng vacxin tính nguy hiểm bệnh nhiễm trùng tương ứng

Vacxin có hiệu lực lớn vacxin gây miễn dịch mức độ cao tồn thời gian dài Hiệu lực gây miễn dịch vacxin trước hết đánh giá động vật thí nghiệm, sau thực địa

Trên động vật thí nghiệm:

Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể xác định mức độ dương tính phản ứng da Cách đánh giá chưa cho biết hiệu lực bảo vệ, cho biết mức độ đáp ứng miễn dịch thể động vật loại vacxin thử nghiệm Cách thứ hai, xác định tỷ lệ động vật tiêm chủng sống sót sau thử thách vi sinh vật gây bệnh

Trên thực địa:

Dù quan kiểm định nhà nước kiểm tra đánh giá động vật, trước đưa tiêm chủng rộng rãi, vacxin phải thử nghiệm thực địa (field test): Vacxin tiêm chủng cho cộng đồng, theo dõi thống kê tất phản ứng phụ đánh giá khả bảo vệ mùa dịch tới

Ngoài tiêu chuẩn trên, để chọn vacxin tiêm chủng, người ta quan tâm đến giá thành tính thuận lợi việc tiến hành tiêm chủng

1.5.3 Tính kháng nguyên: Người ta gọi khả kích thích thể tạo thành kháng thể tính kháng ngun Tính kháng ngun mạnh hay yếu Kháng nguyên mạnh kháng nguyên đưa vào thể lần sinh nhiều kháng thể, kháng nguyên yếu chất phải đưa vào nhiều phải kèm theo tá dược sinh kháng thể

1.5.4 Tính miễn dịch:

Vacxin gây miễn dịch vi khuẩn virus giảm độc lực, với protein đặc hiệu có tính kháng ngun để gây đáp ứng miễn dịch, tạo trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo hiệu đề kháng cho thể sau tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính.

1.6 Phân loại vắc-xin

Vắc-xin virus vi khuẩn sống, giảm độc lực, đưa vào thể không gây bệnh gây bệnh nhẹ Vắc-xin vi sinh vật bị bất hoạt, chết sản phẩm tinh chế từ vi sinh vật

1.6.1 Vắc xin hệ thứ 1:

 Vắc-xin bất hoạt ( vắc-xin vi khuẩn chết) vi sinh vật gây bệnh bị giết bằng hóa chất nhiệt Thí dụ: vắc-xin chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A

Ưu điểm: An toàn vi sinh vật khơng cịn khả phục hồi dạng độc

- Đắt hơn

 Vắc-xin vi khuẩn, virus sống, giảm độc lực vắc-xin chứa toàn tế bào

vi khuẩn vi rus nuôi cấy điều kiện đặc biệt nhằm làm giảm hoạt lực, giảm đặc tính độc hại chúng.

Ưu điểm: Có khả tạo đáp ứng miễn dịch cao chúng nhân lên theo chu kỳ thời gian thể Vắc-xin điển hình loại thường gây được đáp ứng miễn dịch dài hạn loại vắc-xin ưa chuộng dành cho người lớn khỏe mạnh Các vắc-xin ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào và quai bị thuộc loại

Vắc-xin sống ngừa bệnh lao dòng vi khuẩn lao gây bệnh, mà dòng lân cận gọi BCG

Nhược điểm: Các vắc-xin loại gây nguy hiểm chúng khơng ổn

định trở lại dạng độc gây bệnh Ví dụ , Vắc-xin bại liệt gây chứng bại liệt cho trẻ tiêm chủng với tỉ lệ 3/106 (tại Mỹ, theo Girard,1985) Tiêm

chủng vắc-xin đậu mùa gây viêm não tỉ lệ 5/106 (tại Mỹ, theo Girard,1985).  Vắc-xin có nguồn gốc từ độc tố anatoxin: Ngồi vắc xin chứa toàn tế bào

vi sinh vật, số thành phần tiết chúng có khả kích thích miễn dịch biết độc tố (toxoid) Vắc-xin loại chứa độc tố làm bất hoạt ( gọi giải độc tố hay anatoxin) Các độc tố chế tạo thành sau ủ với formalin độc tính Ví dụ như vắc-xin giải độc tố uốn ván hay bạch hầu

Phối hợp vacxin:

Mục đích việc phối hợp vacxin làm giảm bớt số mũi tiêm chủng làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng

Có hai loại phối hợp vacxin:

- Tiêm chủng vacxin phối hợp (trộn vacxin với nhau, tiêm chủng lần, đường)

- Tiêm chủng nhiều vacxin riêng biệt thời gian, vị trí khác theo đường khác

Phối hợp vacxin phải đảm bảo giữ hiệu lực tạo miễn dịch khơng gây tác hại Hiệu lực tạo miễn dịch thành phần vacxin phải chúng tiêm chủng riêng rẽ Một số trường hợp phối hợp vacxin tạo đáp ứng miễn dịch mạnh Ngược lại có trường hợp phối hợp không hợp lý làm giảm hiệu lực tạo miễn dịch Sự phối hợp vacxin hợp lý không làm tăng tỷ lệ phản ứng phụ Nghĩa độ an toàn đảm bảo chúng tiêm chủng riêng rẽ thời gian khác

1.6.2 Vắc xin hệ thứ 2:

đáp ứng miễn dịch mạnh Với công nghệ gen đại, antigen tổng hợp cách cắt đoạn gen tổng hợp nên protein đặc trưng cho vi sinh vật gây bệnh, ghép gen vào gen vi khuẩn, nấm men khác hay tế bào nuôi cấy để tạo protein đặc hiệu cho mầm bệnh, dùng protein đề tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu Ưu điểm vắc-xin loại là:

- Kháng nguyên dùng để kích thích miễn dịch phan lập từ phần lành tính, khơng gây bệnh vi sinh vật gây bệnh, tổng hợp tế bào vi sinh vật hay động vật lắp ráp gen, đảm bảo tính an tồn sản xuất

- Dạng văc-xin an tồn chất lạ khơng chưa tồn gen vi sinh vật nguyên thủy khhong tái sản xuất thể nhận, tác dụng phụ, khả miễn dịch cao

- Giảm giá thành sản xuất, thay công đoạn đắt tiền bao gồm môi trường nuôi cấy mô động vật phôi môi trường nuôi cấy vi sinh vật thông thường, tương đối đơn giản Ngồi khơng phải trang bị tốn cho vấn đề đảm bảo tính an tồn cao (ví dụ vắc-xin thơng dụng chống bệnh lở mồm long móng thường có giá thành cao sản xuất địi hỏi nhà xưởng phải an toàn) Giá thành bảo quản vận chuyển thấp nhờ giảm yêu cầu làm lạnh đông khô

- Tránh việc phải thử nghiệm tính an tồn qui mơ lớn, vắc-xin khơng chứa tác nhân gây bệnh

Một điển hình vắc-xin dạng vắc-xin phịng viêm gan virus B thế hệ II Đó vắc-xin tạo cách lây nhiễm vius viêm gan B vào tế bào chủ cho virus sản xuất kháng nguyên Sau tách chiết gây bất hoạt virus để tạo vắc-xin Hạn chế kỹ thuật chiết tách kháng nguyên phức tạp tốn

( ADN tái tổ hợp ADN lai tìm in-vitro (trong ống nghiệm) cách tổ hợp hai nguồn ADN thuộc hai loài khác nhau.)

1.6.3 Vắc xin hệ thứ 3:

Là văc-xin tái tổ hợp antigen đặc hiệu tổng hợp từ ADN vi sinh vật phối hợp với tá dược làm gia tăng tính miễn dịch

MiễnLà văc-xin tái tổ hợp antigen đặc hiệu tổng hợp từ ADN vi sinh vật phối hợp với tá dược làm gia tăng tính miễn dịch

Miễn dich gia tăng: cách để làm tăng mức kháng thể làm kích thích tế bào nhớ ( stimulating the memory celles) Một số hợp chất có khả làm gia tăng hiệu vắc-xin vius vắc-xin toxoid làm gia tăng kìm chế kháng nguyên hệ thống bạch huyết Các chất gọi chất hỗ trợ (Adjuvant)

Cơ chế tác dụng: phần chất adjuvant liên kết với kháng nguyên làm kháng nguyên dễ bị đánh bắt macrophage, đồng thời làm cho lymphocytes nhận diện kháng nguyên liên kết cách hiệu kháng ngun dạng hồ tan

Có vấn đề kỹ thuật quan trọng cần giải quyết:

- Cần phải nhận biết antigen đặc hiệu cao có tác dụng kích thích miễn dịch

- Việc nuôi tế bào sống phải tái tạo lại cấu trúc antigen cần sản xuất - Kích thước antigen sau phải tăng lên để thúc đẩy thực bào

đáp ứng miễn dịch

Phương pháp dùng để tổng hợp vắc-xin ngừa vius viêm gan subunit chế từ kháng nguyên bề mặt (HbsAg), tổng hợp tế bào nấm men hay động vật nuôi cấy lắp ráp gen (Tiollais,1984, Giard, 1985); Chế phẩm tinh chế, loại bỏ protein đoạn ADN tế bào chủ Vắc-xin có ưu điểm khơng chế tạo từ máu người nhiẽm vius trước nên tránh tiếp xúc với máu nhiễm HIV.( Vius viêm gan B có vỏ ngồi lypoprotein Kháng ngun bề mặt protein vỏ ngồi, phát máu người bị nhiễm: Vào năm 1963, người ta phát huyết bệnh nhân ưa chảy máu kháng thể tác dụng với kháng nguyên (virus), đến năm 1968, xác định kháng nguyên bề mặt huyết bệnh nhânviêm gan B (gọi HbsAg)

Một vắc-xin khác vắc-xin sởi điều chế trung tâm nghiên cứu vi sinh học ứng dụng (Porton Down nước Anh) với hợp tác trường Đại học Nữ Hoàng (Belfast) có chứa hai thành phần kháng nguyên, ngưng kết tố hồng cầu protein liên kết, hai tổng hợp kỹ thuật tái tổ hợp ADN Đó cịn gọi vắc- xin đa trị Một vắc-xin khác văc-xin dịch tả sản xuất từ genes tạo toxin vi khuẩn dịch tả triển khai sản xuất từ năm 1993

1.6.4 Dạng kháng – kháng thể vắc-xin (Anti-idiotypic vaccines):

Một hướng điều chế dùng kháng –kháng thể làm vắc-xin Kháng – kháng thể đóng vai trị nhái lại cấu trúc kháng thể antigen từ vi sinh vật tạo thành chúng an toàn Nguyên tắc sản xuất vắc-xin sau: - Đầu tiên sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên Ab1 Kháng thể loại

gọi diotypic

- Sau diotipic tiêm vào thú để tạo kháng kháng thể Ab2 ( gọi anti diotypic Ab2) Trong cấu trúc kháng- kháng thể có phần trùng với kháng ngun Ab2 có vai trị antigen xác định đơn giản so với antigen nguyên thủy ban đầu dùng làm vacxin

- Cơ thể nhận vắc-xin chứa Ab2 đáp ứng tạo kháng thể Ab3

- Nếu sau hệ miễn dịch tiếp xúc với antigen nguyên thuỷ, Ab3 phản ứng với antigen, phá huỷ làm hoạt tính chúng

- Không phải tiêm vi sinh vật sống chết vào thể

- Vắc-xin chuyên biệt cao chống lại trực tiếp phàn antigen đặc trưng cách chuyên biệt

- Có vài kháng nguyên khơng thể kích thích hệ thống miễn dịch trẻ sơ sinh nưng văc-xin loại chứa protein cho đáp ứng miễn dịch trẻ em cách nhanh chóng

- Văc-xin nhận biết vị trí nhận tế bào Vì dùng để khố cơng virus tế bào Đay hướng để sản xuất vắc-xin kháng HIV

Một vấn đề quan trọng sản xuất kháng – kháng thể văc-xin nguồn idiotipic antibody Trong nguồn kháng thể đơn dịng từ tế bào người tốt từ tế bào chuột

1.6.5 HUYẾT THANH MIỄN DICH Nguyên lý sử dụng huyết thanh:

Sử dụng huyết đưa vào thể kháng thể có nguồn gốc từ người động vật, giúp cho thể có kháng thể đặc hiệu chống lại tác nhân gây bệnh Nói cách khác: sử dụng huyết tạo miễn dịch thụ động nhân tạo Nguồn kháng thể:

* Bào chế từ huyết động vật:

Trước hết phải gây miễn dịch cho động vật Đầu tiên động vật thường tiêm vacxin, sau chúng tiêm vi sinh vật gây bệnh để kích thích sản xuất kháng thể mạnh mẽ Khi hiệu giá kháng thể huyết đạt mức cao nhất, lấy máu để lấy huyết đem bào chế Động vật thường dùng sản xuất huyết ngựa Ngày nay, việc sử dụng huyết động vật giảm nhiều tỷ lệ gây phản ứng cao hẳn so với kháng thể sản xuất từ huyết người

* Bào chế từ huyết người:

Globulin miễn dịch bình thường : Globulin miễn dịch bình thường bào chế từ huyết người khoẻ mạnh từ máu rau thai Trước globulin miễn dịch loại gọi gamaglobulin Ngày số nước cịn có tên globulin huyết miễn dịch (Immune Serum Globulin)

Loại globulin miễn dịch lần (mẻ) bào chế từ hàng nghìn mẫu huyết thanh, khơng có khác đáng kể hiệu giá kháng thể lần sản xuất Kháng thể globulin miễn dịch bình thường chủ yếu thuộc lớp IgG

Nguyên tắc sử dụng:

Các nguyên tắc phải thực sử dụng huyết là: • Đúng đối tượng

• Đúng liều lượng • Đúng đường

• Đề phịng phản ứng • Phối hợp sử dụng vacxin Đối tượng:

Huyết sử dụng nhiều để chữa dự phòng bệnh nhiễm trùng Ngồi cịn sử dụng cho số mục đích khác điều trị cho bệnh nhân bị thiếu hụt miễn dịch, dị ứng dự phòng bệnh tan máu sơ sinh

Trong chữa dự phịng bệnh nhiễm trùng, huyết có hiệu lực với bệnh mà chế bảo vệ chủ yếu nhờ miễn dịch dịch thể Kinh điển huyết chống uốn ván (SAT) huyết chống bạch hầu (SAD) Huyết chống ho gà, chống sởi tiêm cho trẻ chưa tiêm chủng có tiếp xúc với bệnh nhân Huyết chống dại tiêm cho người bị chó dại chó nghi dại cắn với vết thương nặng gần đầu Ngồi cịn có huyết chống virus viêm gan, virus quai bị, rubeon Globulin miễn dịch tiêm cho bệnh nhân viêm đường hô hấp tái phát nhiều lần

Huyết người bình thường tiêm cho trẻ bị thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh Một số cơng trình nghiên cứu cho thấy globulin miễn dịch có tác dụng điều trị dị ứng

Việc sử dụng globulin miễn dịch kháng D (Anti-D immune globulin) cho người mẹ có nhóm máu Rh(-) sinh Rh(+) có tác dụng ngăn cản hình thành kháng thể kháng Rh tránh nguy tan máu sơ sinh cho đứa trẻ sinh lần sau Cơ chế tượng globulin miễn dịch kháng D phá huỷ hồng cầu Rh(+) đứa trẻ xâm nhập vào dịng tuần hồn người mẹ sinh Do chế này, việc tiêm globulin kháng D có hiệu khoảng thời gian 72 đầu sau sinh Liều lượng:

Liều lượng huyết sử dụng tuỳ thuộc vào tuổi cân nặng bệnh nhân, trung bình từ 0,1 đến ml cho 1kg cân nặng, tuỳ theo loại huyết mục đích sử dụng Huyết chống uốn ván tính theo đơn vị, trung bình 250 đơn vị cho trường hợp Nếu vết thương bẩn tiêm chậm sau 24 liều lượng phải tăng gấp đôi

3.3 Đường đưa huyết vào thể:

Huyết thường đưa vào thể đường tiêm bắp Đối với loại huyết tinh chế đạt tiêu chuẩn cao, tiêm tĩnh mạch nên hạn chế Tuyệt đối không tiêm tĩnh mạch huyết có nguồn gốc từ động vật (dù tinh chế!) huyết người chưa đạt độ tinh chế cao

Cần phải thực tốt việc sau để ngăn ngừa phản ứng huyết gây ra: - Hỏi xem bệnh nhân tiêm huyết lần chưa Rất thận trọng phải định tiêm huyết lần thứ hai tỷ lệ phản ứng cao nhiều so với lần thứ Việc định có tiêm huyết lần thứ hai hay không tuỳ thuộc vào cân nhắc nguy mắc bệnh, tính nguy hiểm bệnh tỷ lệ phản ứng loại huyết sử dụng

- Làm phản ứng thoát mẫn (phản ứng Besredka ) trước tiêm: Pha loãng huyết 10 lần dung dịch NaCl 0,85% Tiêm 0,1 ml vào da Sau 30 phút nơi tiêm khơng mẩn đỏ tiêm huyết Nếu nơi tiêm mẩn đỏ, nói chung khơng nên tiêm, trừ tình trạng nhiễm trùng nhiễm độc bệnh nhân đòi hỏi bắt buộc phải tiêm Trong trường hợp cần chia nhỏ tổng liều để tiêm dần, cách 20 đến

30 phút

- Trong trình tiêm truyền huyết phải theo dõi liên tục để xử trí kịp thời có phản ứng xảy ra, đặc biệt phải đầy đủ điều kiện để xử trí sốc phản vệ

Tiêm vacxin phối hợp:

Kháng thể tiêm huyết phát huy hiệu lực sau tiêm, tồn thời gian ngắn Hiệu giá kháng thể giảm nhanh ngày đầu, sau giảm chậm bị loại trừ hết sau khoảng 10 đến 15 ngày Hai lý giảm nhanh chóng là: kháng thể đưa vào thể phản ứng với kháng nguyên vi sinh vật bị thể chuyển hoá giống số phận protein ngoại lai khác Việc tiêm vacxin phối hợp nhằm kích thích thể tạo miễn dịch chủ động thay cho miễn dịch thụ động tiêm huyết hết hiệu lực

1.7 Kháng thể đơn dòng:

Mỗi định kháng ngun kích thích tạo thành mơt kháng thể đặc hiệu Khi kháng nguyên có nhiều định kháng nguyên (đa giá) cho phức hợp kháng thể Muốn nhận kháng thể phức hợp phải tiến hành tách tinh khiết Tuy nhiên ngày người ta nhận kháng thể tinh khiết kỹ thuật kháng thể đơn dòng Kháng thể đơn dòng kháng thể dòng lympho bào sinh để chống lại kháng nguyên định

Sản xuất kháng thể đơn dòng: Năm 1975, Kohler Milstein tiến hành lai tế bào u tuỷ ) myeloma) với tế bào T hoạt hóa ( phương pháp dung hợp) ưu điểm tế bào u tủy có khả phân chia nhanh mơi trường nhân tạo Sau tách riêng tế bào lai nuôi môi trương nhân tạo để chúng phân chia tạo dòng tế bào sinh kháng thể Kháng thể gọi kháng thể đơn dòng, có khả chống lại định kháng nguyên định

Kháng thể đơn dòng áp dụng rông rãi thay số phương pháp miễn dịch huyết học thông thường nhiều lãnh vực như:

- Xác định vi sinh vật

- Ức chế phản ứng thải loại ghép quan Xác định loại thuốc cấm sử dụng có máu ví dụ doping.v v

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VĂC-XIN:

2.1 Sản xuất vắc-xin theo phương pháp truyền thống (vắc-xin hệ thứ nhất): 2.1.1 Nguyên tắc chung:

- Tạo sinh khối: Đây giai đoạn để sản xuất vắc-xin Vi sing vật nuôi cấy môi trường thích hợp để đạt số lượng lớn sinh khối sản phẩm chúng (toxoid, antigen) Các chủng vi sinh vật trước nuôi cấy cần phải kiểm tra độ tinh khiết, không lẫn vi sinh vật lạ Q trình ni cấy thực nồi ni cấy đặc biệt, có thiết bị kiẻm sốt đến q trình tăng trưởng vi sinh vật

- Làm bất hoạt: Yêu cầu sản xuất văc-xin phải an toàn cho người sử dụng Do vi khuẩn sử dụng để chế tạo văc-xin phải khơng cịn khả gây bệnh giữ tính kháng ngun, nghĩa có khả kích thích hệ thống miễn dịch thể

Đối với văc-xin vi khuẩn chết: dùng tác nhân diệt khuẩn các hóa chất (formalin, alcool, aceton), tia cực tím, siêu âm…

Đối với vacxin từ vi khuẩn sống giảm độc: dùng phương pháp cấy chuyền vi khuẩn nhiều lần mơi trường ni cấy Ví dụ vacxin BCG (Bacille Calmette Guerin) vacxin chế tạo từ vi khuẩn lao bò cấy chuyền thời gian dài môi trường nuôi cấy

- Sản xuất chế phẩm:

Sau làm bất hoạt, tiếp tục tinh khết hóa đơng khơ để tạo sản phẩm, cuối đóng gói Tuỳ theo loại chế phẩm đóng gói dạng thuốc lỏng để uống, dạng thuốc viên, dạng thuốc tiêm

- Kiểm tra sản phẩm

Cần phải kiểm tra: Độ vô trùng: chế phẩm vacxin không lẫn vi sinh vật lạ Đảm bảo đủ nồng độ

Kiểm tra khả gây miễn dịch 2.1.2 Các vacxin cổ điển sản xuất:

2.1.2.1 Vacxin vi khuẩn thương hàn:

Nhân giống: Nuôi vi khuẩn thương hàn môi trường thạch 18 h sau dùng NaCl đẳng trương để lấy vi khuẩn điều chỉnh để đạt độ đậm đặc 5.108

vi khuẩn/1ml Cấy vi khuẩn vào môi trường cho thể tích ban đầu vi khuẩn chiếm 5% thể tích mơi trường

trùng với lưu lượng 1lit/1phút Nuôi 10-12 để đạt nồng độ khoảng 6.1010 vi khuẩn

Để tăng khả sinh sản vi khuẩn thêm dung dịch glucoza 40%, giữ pH= 7,6-7,8 suốt thời gian nuôi cấy

Làm bất hoạt: Vacxin làm bất hoạt cồn: Lấy sinh khối trộn thận trọng bình đặc biệt với cồn ethyl theo tỉ lệ lân1:1:4, lần 1:10

Kiểm tra độ tinh khiết đáp ứng miễn dịch đưa dung dịch điểm đẳng điện NaCl có chứa 0,25% phenol tạo tủa 1ml vacxin cồn chưa 5.109 vi

khuẩn Đổ vacxin vào ống đông khô –400C- - 500C đông gói thành phẩm.

Vacxin nhập chung với VI antigen để tăng hiệu

4Vắc-xin tái tổ hợp: với công nghệ gen đại, người ta cắt đoạn gen tổng hợp nên protein đặc trưng cho vi sinh vật gây bệnh, ghép gen vào vi khuẩn hay tế bào nuôi cấy để tạo protein đặc hiệu cho mầm bệnh, dùng protein đề tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu Dạng văc-xin an tồn, tác dụng phụ, khả miễn dịch cao Một điển hình vắc-xin dạng vắc-xin phịng viêm gan virus B hệ II III

 Các "toxoid" hợp chất độc bị bất hoạt trích từ vi sinh vật (trong

trường hợp độc chất phương tiện gây bệnh vi sinh vật) Chúng tiêm cho vật chủ khác (như ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể để chữa bệnh Thí dụ: huyết ngừa uốn ván bạch hầu

Một số loại vắc-xin nghiên cứu

Các vắc-xin xem vắc-xin tương lai, có hướng phát triển nay:

 Sử dụng phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây loại đáp ứng miễn dịch

mong muốn Thí dụ, chất nhơm phosphate oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vắc-xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay tế bào

 Vắc-xin khảm : sử dụng sinh thể quen biết để hạn chế tượng

"phản tác dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang số yếu tố virus viêm gan B hay virus dại

 Vắc-xin polypeptidique : tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt

 Anti-idiotype : idiotype cấu trúc không gian kháng thể vị trí gắn

kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype các kháng thể đặc hiệu idiotype, anti-idiotype xét mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên Vậy, thay dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X

 Vắc-xin DNA: DNA tác nhân gây bệnh biểu tế bào

người chủng ngừa Lợi DNA rẻ, bền, dễ sản xuất số lượng lớn nên thích hợp cho chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngồi ra, vắc-xin DNA cịn giúp định hướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào trình diện qua MHC loại II, dẫn đến đáp ứng CD4 (đáp ứng miễn dịch dịch thể) Khi kháng ngun tác nhân đó được thể người biểu hiện, trình diện qua MHC loại I, lúc đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 kích thích Tuy nhiên phương pháp dao hai lưỡi lẽ tế bào mang DNA lạ có nguy cơ bị nhận diện "không ta", sinh bệnh tự miễn

 Sử dụng véc-tơ tái tổ hợp – dùng vi khuẩn tính tế bào

trình diện kháng nguyên tế bào tua chuyển gen để biểu hiện kháng nguyên mong muốn

Vắc-xin dùng để điều trị

Một hướng nghiên cứu miễn dịch liệu pháp, bao gồm miễn dịch liệu pháp thụ động chủ động (tức vắc-xin liệu pháp) Người ta hy vọng phương pháp chữa bệnh ung thư, AIDS bệnh Alzheimer

Hạn chế vắc-xin

Những hạn chế vắc-xin tập trung thành hai nhóm chính: hiệu tai biến kèm

Hạn chế hiệu quả

Một số vắc-xin có hiệu quả, khơng kể vắc-xin đậu mùa tiếng, thí dụ vắc-xin ngừa bệnh uốn ván, sởi v.v Một số vắc-xin khác có hiệu vừa phải (hiệu

BCG vào khoảng 50%) Ngược lại, có bệnh đến đầu kỷ 21 chưa có vắc-xin thích hợp (AIDS, sốt rét v.v.) Do vậy, vắc-xin chưa phải vũ khí vạn để đối phó với bệnh tật

xem kết Dĩ nhiên phương pháp khơng thể sử dụng trái đạo đức Do đó, người ta biến hóa chút, chia nhóm chủng khơng chủng không truyền bệnh mà quan sát nhiễm bệnh qua ngã thông thường Hạn chế phương pháp vắc-xin tỏ có hiệu quả, người ta khơng thể triển khai nghiên cứu quy mơ rộng để tính xác hiệu số lớn quần chúng bị thiệt thịi khơng bảo vệ

Bởi vậy, vắc-xin xem có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng cho người quan sát giảm số người mắc bệnh Tuy nhiên, bệnh có chiều hướng giảm xuống, người ta khơng biết vai trị thật vắc-xin, thí dụ tần suất bệnh lao giảm nhiều, vai trò biện pháp vệ sinh, cách ly nguồn lây đáng kểTính hiệu vắc-xin biểu mặt chất (đáp ứng miễn dịch khơng thích hợp) mặt lượngj (khơng có đáp ứng miễn dịch)

Ngun nhân gây hiệu lượng:

 Các "lỗ hổng" kho tàng miễn dịch: lý thuyết, tế bào lympho B

có thể tạo 1012 loại kháng thể đặc hiệu [1], lympho T có thể nhận diện 1015 kháng nguyên khác [], số rất lớn vô hạn, hệ miễn dịch chống lại thứ

 Hiệu vắc-xin cịn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch

có thể tồn suốt đời sản xuất kháng thể khơng khơng được tái kích thích

 Đột biến tác nhân gây bệnh: chế sinh tồn tác nhân gây

bệnh Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào rượt đuổi trường kỳ Tiêu biểu cho chế HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy đại dịch cúm gia cầm

Nguyên nhân gây hiệu chất:

 Vai trò phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn vắc-xin,

 Loại phản ứng miễn dịch tượng chuyển hướng miễn dịch: đối với

các tác nhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể thích hợp (loại đáp ứng hỗ trợ tế bào lympho Th1) Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần hỗ trợ lympho Th2) lại hữu hiệu cho các tác nhân gây bệnh nội bào Do đó, vắc-xin gây đáp ứng miễn dịch không loại đáp ứng nên có, hiệu khơng được bảo đảm Th1 Th2 có xu hướng khắc chế lẫn Vắc-xin kinh điển có xu hướng tạo đáp ứng Th1 Do bệnh tác nhân nội bào như nhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt vắc-xin, vắc-xin lại gây hiệu ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ

Tai biến dùng vắc-xin

Có hai loại tai biến: nhiễm bệnh bệnh miễn dịch.Nhiễm bệnh

 Vắc-xin sống, giảm độc lực gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch

 Nguy hồi phục tác nhân vi sinh: tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lại độc tính Nguy vắc-xin ngừa bại liệt 10-7, nghĩa 10 triệu trẻ em uống vắc-xin Sabin có em bị tai nạn loại này Điều không may không ngăn cản việc sử dụng vắc-xin này bởi lẽ tỷ lệ xem chấp nhận

 Nguy nhiễm tác nhân gây bệnh khác vào chế phẩm vắc-xin. Điều hạn chế quy trình sản xuất, bảo quản sử dụng chặt chẽ

Bệnh miễn dịch

 Thử nghiệm vắc-xin phòng bệnh dại cừu cho thấy có xác suất gây

EAE, bệnh tự miễn hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý có thể vắc-xin chiết xuất từ não chó mang theo mẩu protein của tế bào thần kinh, tạo miễn dịch, thể (được tiêm)đã tạo cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh

 Vắc-xin ngừa ho gà gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10

-4-10-6 Việc tinh lọc vắc-xin làm tăng mức an toàn lần nữa, giảm hiệu quả.

Chủng ngừa

 Chủng cách tạo vết rạch da (cho rớm máu) cho tiếp xúc với

vắc-xin Phương pháp trước dùng cho vắc-xin đậu mùa và lao

 Tiêm da, da v.v phương pháp phổ thông nay, kể cả

vắc-xin BCG phịng lao Khơng tiêm vào mạch máu

 Uống vắc-xin phương pháp dùng cho vắc-xin Sabin ngừa bệnh bại liệt

Đánh giá hiệu theo dõi

Trong số trường hợp, thí dụ sau tiêm vắc-xin ngừa viêm gan siêu vi B, người ta làm xét nghiệm huyết tìm hiệu giá kháng thể qua đánh giá hiệu vắc-xin thể người tiêm (có tạo đáp ứng miễn dịch hữu hiệu khơng)

Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) hỗ trợ nhiều chương trình tiêm chủng mở rộng

trên phạm vi tồn cầu kế hoạch chăm sóc sức khỏe ban đầu

Đẩy mạnh nghiên cứu nhằm tìm vắc-xin mới, hiệu với giá thành phù hợp cho mục tiêu phổ cập cho người, bệnh gây chết người nhiều sốt rét hay bệnh nan y ung thư, AIDS mục tiêu y sinh học

Phản đối

thể tế bào mô thể ình tiến hóa phân tử kháng thể kháng nguyên enzyme immunoblot, ELISA hóa mơ miễn nhóm máu miễn dịch tuyến ức lách tủy xương mạch lympho hạch lympho amiđan V.A. da mô học tử phẫu thuật (sinh thiết đặc hiệu vắc-xinliệu pháp miễn dịch liệu pháp vaccinia, virus bệnh đậu bò bệnh đậu mùa (tiếng Latinh Edward Jenner Louis Pasteur Công nguyên Mithridate VI Trung Quốc kỷ thứ 10 Đạo giáo sẹo mặt mũi Thổ Nhĩ Kỳ o kỷ 18 vi khuẩn u bệnh tả gà. 1878 huyền phù bệnh, miễn dịch học chủng ngừa bệnh bại liệt sởi bạch hầu ho bệnh ban đào thủy đậu quai bị thương hàn uốn ván protein đáp ứng miễn dịch trí nhớ miễn dịch ung thư AIDS ký sinh trùng sốt giun sán (lao sốt xuất huyết hệ miễn dịch HIV bệnh lao miễn dịch đặc hiệu vi khuẩn lao BCG tái tổ hợp công nghệ gen " g vì 1 bệnh Alzheimer BCG thế kỷ 21 viêm gan siêu vi B, hiệu giá kháng thể Tổ chức Sức khỏe Thế giới chương trình tiêm chủng mở rộng h chăm sóc sức khỏe ban đầu Liên kết