chương6

Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên [r]

Chương

1 Tách chiết tinh RNA

-

hủy có

chất lượng tốt phải

-ribonucleoside macaloid

- N

tách chiết DNA

(sodium dodecyl sulphate

-hòa tan ,

(

-, -protein

bằng cách (ly tâm) với

chloroform RNA hòa tan pha kết

-70o N )

1.2 Phân lập RNA poly(A)+

-

Hình 6.1 Sơ đồ quy trình tinh mRNA từ RNA tổng số

Mô tế bào

Tách chiết RNA tổng số

Chuyển RNA tổng số vào cột sắc ký lực oligo(dT)-cellulose

Ly tâm

rRNA tRNA

Loại bỏ Rửa cột

đệm muối

Bổ sung đệm rửa giải

Tách rửa thu hồi mRNA

Định lượng mRNA

Sử dụng

Tinh cột thứ hai

2 Phân tích RNA

2.1 Lai Northern (Northern hybridization)

32

P (hoặc digoxigenin-dUTP) phương pháp

(xem

chương sung c

gel

32

P Sau r

-quang (Hình 6.2)

Hình 6.2 Phân tích biểu gen lai Northern Hình phía điện di RNA tổng số agarose gel biến tính formamide Hình phía tín hiệu phóng xạ thu từ phản ứng lai RNA tổng số với mẫu dò đánh dấu 32

2.2 Lai Dot (Dot hybridization)

Lai dot Kafatos cs (1979) thực cách chấm mẫu nhỏ dung dịch RNA lên màng nitrocellulose, sau màng làm khơ, lai với mẫu dị đặc trưng RNA DNA có đánh dấu 32

P, ủ với phim X-quang Mặc dù khó định lượng xác kích thước chấm lớn khác nhau, nhiều trường hợp thu ý tưởng tốt cường độ biểu gen đặc biệt mô đặc trưng tế bào nuôi cấy (Hình 6.3)

Hình 6.3 Phân tích dot để định lượng RNA Hàng phía nồng độ RNA chuẩn biết Hàng nồng độ RNA khác tách chiết từ mô/cơ quan

(complementary DNA)

tổng hợp cDNA

Q

cDNA qua ba enzyme

tuần tự nhiệt enzyme RNase H E coli khuôn mẫu

cDNA thứ nhờ

DNA polymerase I E coli (3) Cắt vịng cặp tóc nhờ nuclease S1 sửa chữa hai đầu đoạn Klenow (Hình 6.4)

(reverse transcriptase)

Tr

:

- hoàn

reverse transcriptase

hoàn /

1.2 Oligo dT primer

1.3 Deoxynucleoside triphosphate (dNTP) N

bốn 10-50

bốn loại 200-250

2

+

+ +

- hóa

2+

Mg2+ hồn

6-10 mM

1.5

cDNA hoàn

.HCl

-H E coli

(hairpin loop)1 (primer)

E coli 6.4)

M

5

1

,

hai cho kết tốt

hoàn

6.4 đoạn cDNA từ khuôn mẫu mRNA

sợi cDNA mang vịng cặp tóc AAAAAA 3’ mRNA

TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ

TTTTTT 5’

AAAAAA 3’ TTTTTT 5’

AAAAAA 3’

TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi

Nuclease S1

DNA polymerase I Tổng hợp sợi cDNA thứ hai Biến tính thể lai mRNA-cDNA

AAAAAA 3’ mRNA 5’

5’ 3’

3’

3’

5’ 3’

Tổng hợp sợi cDNA thứ khuôn mẫu mRNA Reverse transcriptase

Gắn mồi oligo dT

5’ AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT

RNase H

1

, s

1 Sau đó, đoạn cDNA sửa chữa enzyme Klenow, k hai

bacteriophage

: Eco : Eco : Eco

(đầu

plasmid phương pháp sau:

- (homopolymetric tailing) c

của plasmid vector gen

in vitro (DNA E coli

- c đoạn nối (synthetic linkers) c

DNA

enzyme

1.1 Đuôi dA:dT

-E coli

- DNA

vector thức

đuôi dA:dT

1.2 Đuôi dC:dG

đuôi plasmid vector PstI

Enzyme Pst 5’…CTGCAG…3’ t

Pst 6.5)

:dG

E coli

3’

6.5 dG:dC -

AAAAAACCCCC C

Tổng hợp sợi cDNA thứ hai Plasmid PstI AAAAAA AAAAAA TTTTTT Tổng hợp sợi thứ oligo (dT)-primer AAAAAA TTTTTT TTTTTT CCCCCC CTGCA Gp Gp ACGTC GTGCAGGGGGG Gp Gp GGGGGGACGTC

Bổ sung (dC) terminal transferase Bổ sung (dG)

terminal transferase Cắt PstI

Gắn

PstI cDNA

PstI Plasmid Biến nạp vào chủng E coli thích hợp

Chọn lọc khả kháng kháng sinh

Trong trình biến nạp, chỗ sai sót DNA sửa chữa enzyme vật chủ để phục hồi PstI đầu cDNA

GTGCAGGGGGG AAAAAACCCCCC G

Hình 6.6 Minh họa linker (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận biết cho BamHI (b) Linker gắn vào cDNA đầu nhờ DNA ligase (c) Cấu trúc sau cắt BamHI để tạo đầu 5’ lồi

(khơng

-cDNA

hóa (phosphorylation) ng hóa

) hồn

vector DNA óa (Hình 6.7)

CCGGATCCGG GGCCTAGGCC

CCGGATCCGG GGCCTAGGCC

CCGGATCCGG GGCCTAGGCC

5’ - GATCCGG GCC

CCG

GGCCTAG - 5’

DNA ligase

BamHI

(a)

(b)

Hình 6.7 Minh họa adapter (a) Adapter, có đầu tận 5’ tương ứng với enzyme HindIII, gắn vào cDNA đầu nhờ DNA ligase (b) Đầu 5’ adapter dephosphoryl hóa để ngăn cản tự kết nối lại

gel IV.

-cDNA

E coli

- plasmid vector

mRNA

-gen

P có số thuận lợi sau: 5’ - AGCTTCCGGG

AGGCCC

5’ - AGCTTCCGGG AGGCCC

CCCGGA

GGGCCTTCGA – 5’

DNA ligase (a)

- Không cần

-

-E coli

đ

6.8) promoter

vector

được phát triển

-adapter

6.8 Đoạn Klenow tạo đầu cho cDNA sợi đôi enzyme nuclease S1 cắt vịng cặp tóc Các linker thứ thứ hai gắn vào hai đầu cDNA, sau đoạn cDNA cắt enzyme hạn chế với vector tạo dịng có vị trí nhận biết hai linker nhân tạo Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector biến nạp vào E coli

cDNA sợi đôi

Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow

Bổ sung linker thứ

Cắt nuclease S1

Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow DNA polymerase bacteriophage T4

Bổ sung linker thứ hai

Gắn với plasmid vector

Tổng hợp cDNA sợi thứ hai primer-adapter sợi đơn.Tạo nhiều vị trí cắt hạn chế đầu tận cDNA

CCCCCCCCCC

3’ (T)nCAGCTGAGG 5’

CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC

3’ (T)nCAGCTGAGG 5’

3’ (A)nGTCGACTCC 5’

GGAGTCGACGGGGGGGGGG

CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC 3’

(T)nCAGCTGAGG 5’ 3’ (A)nGTCGACTCC 5’

GGAGTCGACGGGGGGGGGG

pTCGAC(G)n G(C)n

(A)nG (T)nCAGCTp Cấu trúc chóp 5’

cDNA sợi thứ mRNA Tổng hợp cDNA sợi thứ

nhất primer-adapter sợi đơn

Thủy phân RNA bổ sung đuôi đồng trùng hợp vào đầu 3’ sợi cDNA thứ cách dùng terminal transferase

SalI

SalI

Cắt sợi cDNA RE thích hợp gắn vào vector

AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT

A A A A (A)n

T T T A

T C A G CT GA G G SalI SalI 6.9 -adapter

tổng hợp theo phương pháp gắn

lacZ

đư

vector

vector

chỉ , vector

1.1 Vector gt10

cI2 c

bacteriophage E

coli Eco

c

DNA c c

1.2 Vector gt11

lac E coli

Eco lac

-ga

yếu tố định (epitopes)

yếu tố định

mẫu dò

B 42oC E coli

2 cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator

37o

-lac

37o

xét (radiochemistry

(histochemistry)

vector c

2.1 Vector gt18 gt19

vùng (polycloning sites Eco

hai

(Sal 100

các Sal

Sal

(methylation) K

gt19 2.2 Vector gt20 gt21

Các vector

gt19 N gt19 sau:

- chi loại bỏ

chi

- Sac Xba

Xba

500 bp DNA bacteriophage

lac

lacZ Các vector

Xba SacI

mang năm chế

là: NotI, XbaI, SacI, Sal Eco

LacZ Các vector

Sal Not

phương pháp primer-linker

Sal Not tor theo

lacZ

2.4 Vector ZAP

Vector lac

E coli

Vector :

- sáu

EcoRI tương t

gt11

-

- in

vivo Bluescript plasmid

thực plasmid DNA

DNA Vector

cho

Vector ZAP

ba :

- Lai nucleic acid

-

-

lai nucleic acid phát kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu

1.1 Lai nucleic acid

hồn

mẫu dị

- mẫu dò mẫu dò

hồn

in vitro

mẫu dị (stringency)

- mẫu dò mẫu dò

dò

d

(5-10 ic

trên lai

n Mục đích hai

mẫu dò cho cDNA quan tâm

- mẫu dò mẫu dò

đoạn nucleotide in vitro

mẫu dò biến (degene

: +

biến

+

-nghiêm ngặt (non-stringency)

+

biến Inosine bốn

, sản

còn ẵ

c

gt11, gt18-23,

Staphylococcus aureus

yếu tố định kháng nguyên thứ

125

(v : alkaline phosphatase) hóa

( -xem

q trình mẫu dị

yếu tố định kháng nguyên , mẫu dò

mẫu dị

mẫu dị thu

acid hồn n cần lưu ý để đảm bảo

dịng cDNA thu được:

- hồn

-

- chuỗi

in vitro

- in vitro in

vivo

yếu tố

-trình tự

vector :

-thân mRNA (pre-mRNA)

hồn hóa

phiên mã ngược hoàn

-

của mRNA

Các bước trình xây dựng thư viện cDNA sau:

bỏ

bacteriophage

5 106

hóa bacte

u ,

gt11, - ZAP

dephosphoryl hóa

E coli

-

chèn cDNA

mười hai

hoàn

hoàn

hóa

0,5

- Vector gt10

E coli

- Vector ZAP, ZAPII.

gt11, gt18,

E coli Y1090hsdR

vector 4, vector

-hoàn

Eco

E coli

- Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed

2 Brown TA 2001 Gene Cloning-An Introduction 4th ed Blackwell

Science, Oxford, UK

3 Calladine CR and Drew HR 1997 Understanding DNA: The Molecule and How It Works 2nd ed Academic Press, London, UK

4 Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 3rd ed ASM Press, USA

5 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA

6 Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA

7 Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK

8 Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook

Humana Press Inc New Jersey, USA

9 Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology