NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA PEPTIDE DEFORMYLASE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Thanh Trung NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA PEPTIDE DEFORMYLASE TỪ VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 (DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình đƣợc hồn thành Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Bảo Yên TS Lê Hồng Điệp Phản biện …………………………………………… Phản biện …………………………………………… Phản biện …………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp Vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ngày nay, bệnh dày, đặc biệt ung thư dày ngày phổ biến giới Việt Nam Một nguyên nhân gây nên bệnh dày xác định vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori) Trước đây, phương pháp điều trị bệnh dày H pylori sử dụng số loại kháng sinh mang lại hiệu cao Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy có nhiều chủng vi khuẩn H pylori thể t nh đề kháng với nh ng loại kháng sinh thường d ng, cho n n, việc nghi n cứu thuốc nhu c u cấp thiết Nhiều nghiên cứu trước cho thấy sinh trưởng phát triển vi khuẩn H pylori liên quan chặt chẽ đến hoạt động nhiều protein, đ c enzyme peptide deformylase c vai tr x c tác cho phản ứng loại bỏ nhóm formyl đ u N-formylmethionyl chuỗi peptide h nh thành sinh vật nhân sơ Do vậy, enzyme peptide deformylase protein đ ch cho tr nh điều trị bệnh li n quan đến vi khuẩn H pylori Từ dược liệu đ , số hợp chất tự nhi n t m c tác động ức chế vi khuẩn H pylori, nhi n, chế phân tử tác động chưa rõ ràng Việc xác định hợp chất đ ng vai tr tác động ức chế điều c n thiết nhằm phát triển thuốc điều trị có hiệu Vì vậy, tơi lựa chọn lĩnh vực nghiên cứu li n quan đến bệnh dày vi khuẩn H pylori nhằm giải số vấn đề trên, cụ thể nghiên cứu cấp độ phân tử gen, enzyme chế tác động ức chế dược liệu lên vi khuẩn H pylori Mục tiêu đề tài điều tra trình tự gen mã hóa peptide deformylase nhằm lựa chọn trình tự để nhân dịng tạo enzyme peptide deformylase tái tổ hợp, sau đ biểu tinh enzyme tái tổ hợp đ , từ đ sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng mẫu thảo dược đến tính chất enzyme Mục tiêu Tạo enzyme peptide deformylase tái tổ hợp có khả ứng dụng việc sàng lọc chất ức chế tự nhiên có khả kháng Helicobater pylori Nội dung nghiên cứu Nhân d ng gen mã h a cho peptide deformylase vào vector ph hợp Biểu peptide deformylase tái tổ hợp với lượng lớn pha tan -1- Tinh peptide deformylase tái tổ hợp có hoạt t nh độ tinh cao Nghi n cứu t nh chất peptide deformylase tái tổ hợp Những đóng góp luận án Đã tạo d ng xác định trình tự gen mã hoá cho peptide deformylase với k ch thước 525 bp có trình tự amino acid tương đồng 100 với tr nh tự nucleotide v ng peptide trưởng thành peptide deformylase từ Helicobacter pylori Đã thiết kế vector biểu hiển chứa đoạn gen def mã hóa PDF, biểu PDF tái tổ hợp chứa His-tag E Coli tối ưu điều kiện biểu PDF tái tổ hợp 28oC, IPTG mM, tinh PDF tái tổ hợp với hiệu suất 60 mg/L, hiệu suất thu hồi từ dịch chiết tế bào đạt 12 độ 96,6% Đã xác định hoạt tính PDF x c tác tr n chất formyl-methionin-alanin-serin (fMAS) với giá trị kcat kcat/Km HpPDF đạt 0,02 173,42 đánh giá ảnh hưởng số hợp chất từ thảo dược có khả ức chế hoạt động PDF Cấu trúc luận án Luận án gồm 98 trang chia thành ph n: Mở đ u trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 35 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp trang; Chương 3: Kết thảo luận 37 trang; Kết luận kiến nghị: trang; Các cơng trình cơng bố tác giả trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Tóm tắt luận án tiếng anh trang; Phụ lục trang Luận án có bảng số liệu, 29 hình 46 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh -2- CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Các bệnh dày - tá tràng Trên giới, năm c khoảng triệu trường hợp chẩn đoán ung thư dày, ước t nh bệnh ung thư phổ biến thứ tư tr n giới (Wroblewski, et al 2010) Ở Việt Nam, viêm dày mãn tính bệnh phổ biến, chiếm khoảng 31 – 72% trường hợp nội soi đường tiêu hóa Bệnh thường gặp nam n , lứa tuổi mắc bệnh đa ph n từ 40-49 tuổi (Phan, et al 2015) 1.2 Vi khuẩn Helicobacter pylori 1.2.1 Cấu tạo hình thái H pylori H pylori phân lập thấy l n đ u ti n năm 1982 Robin Warren Barry Marshall, vi khuẩn Gram âm, sống lớp nhày niêm mạc dày (Warren and Marshall 1983) H pylori thuộc giới vi khuẩn, ngành Proteobacteria, lớp Epsilonproteobacteria, họ Campylobacterales, Helicobacteraceae, chi Helicobacter 1.2.2 Tình hình nhiễm Helicobacter pylori mối liên hệ với bệnh dày - tá tràng H pylori ngày tìm thấy 50% dân số giới (Azevedo, et al 2007), trực tiếp gây hàng loạt bệnh đường ti u h a ung thư dày Thống kê cho thấy nửa dân số giới bị nhiễm vi khuẩn H pylori, tùy vào vùng tỷ lệ dao động khoảng 50-90%, Việt Nam tỷ lệ thay đổi từ 63-94,8% ca mắc bệnh dày (Axon 2007), (Nhà xuất y học 2013) Nguyên nhân gây nên bệnh dày xác định vi khuẩn H pylori 1.2.3 Tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn H pylori Khi điều trị theo phác đồ kháng sinh dẫn đến số tác dụng phụ không mong muốn loạn khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn quan, đặc biệt tượng kháng kháng sinh chủng H pylori ngày tăng (Phan, et al 2015) Theo nh ng nghiên cứu g n Việt Nam, tỷ lệ kháng hai loại kháng sinh phổ biến cao, đ , clarithromycin tăng từ năm 2001 l n 33 năm 2013 metronidazole khoảng 70% (Binh, et al 2013) 1.2.4 Các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng H pylori -3- Ngày có nhiều ch ý lĩnh vực khám phá thuốc trọng hợp chất tự nhiên từ dược liệu truyền thống Sản phẩm tự nhiên dẫn xuất ch ng đại diện cho 50 tất loại thuốc điều trị Các hợp chất thuộc chất chuyển hóa thứ cấp có khả kháng khuẩn chống lại H pylori flavonoid, saponin, alkaloid Saponin glucosides với đặc tính tạo bọt bao gồm pollyyclic aglycones gắn liền với nhiều chuỗi b n đường 1.3 Peptide deformylase 1.3.1 Cấu trúc chế peptide deformylase (PDF) Peptide deformylase (PDF, EC 3.5.1.88) enzyme xúc tác cho phản ứng loại bỏ nhóm N-formyl chuỗi polypeptide hình thành cho phản ứng cắt methionine tiếp sau trình hoàn thiện chức cho protein thể nhân sơ (Miesel, et al 2003) Mặc d n tìm thấy bào quan tế bào nhân thực, lục lạp ti thể hoạt động mức thấp Như vậy, PDF c n thiết cho vi khuẩn sinh trưởng tồn mà khơng có nhiều tác dụng người, cho n n, đ ch tác dụng tiềm cho việc phát triển thuốc kháng sinh Việc nhân dòng gen mã hóa peptide deformylase, def, vào năm 1993 Meinnel et al tạo điều kiện thuận lợi cho nh ng nghiên cứu chế PDF (Meinnel and Blanquet 1993) PDF l n đ u ti n biểu vi khuẩn E coli tinh hoạt tính thu hồi thấp (kcat/Km 80 M-1s-1 với chất formyl-Met-Ala-Ser) chứa ion kẽm polypeptide {Meinnel, 1995} Tuy nhi n năm 1997, Rajagopalan báo cáo việc tinh phân đoạn PDF hoạt t nh cao điều kiện khơng có oxy, với kcat/Km 2,9 x 104 M-1s-1 với chất formyl-Met-Ala-Ser, chứa ion sắt polypeptide (Rajagopalan, 2000) 1.3.2 Peptide deformylase đích phân tử tiềm Vì PDF c n thiết cho sống cịn vi khuẩn dường khơng c n thiết động vật tế bào, cung cấp mục tiêu hấp dẫn cho chiến lược kháng khuẩn Hơn n a, deformylation t nh bảo tồn loài vi khuẩn Với nhiều cấu trúc ba chiều PDF vi khuẩn tìm ra, hai có khơng có phức hợp ức chế enzyme, cho thấy vị trí hoạt động PDF bảo tồn, gồm vị trí bảo thủ, motif [GφGφAAXQ], motif [EGCLS], motif [HEφDH] (trong đ φ -4- amino acid kỵ nước X axit amin bất kỳ) Do đ , PDF dường đ ch tiềm cho kháng sinh phổ rộng 1.4 Ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp Nh ng năm g n đây, công nghệ ADN tái tổ hợp ngày phổ biến tính ứng dụng rộng rãi nh ng kết quan trọng Một số lĩnh vực ứng dụng quan trọng công nghệ ADN tái tổ hợp chẩn đoán bệnh di truyền, lấy dấu ADN, trị liệu gen 1.5 PDF bị ức chế số hợp chất tự nhiên Các sản phẩm tự nhi n đ ng vai tr then chốt phát triển kháng sinh kể từ nh ng năm đ u kỷ XX Tuy nhiên, kháng thuốc kháng sinh vi sinh vật tăng nhanh đ i hỏi cung cấp liên tục tác nhân để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm Nhiều hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ sản phẩm tự nhiên điều tra NVP LBM 415 kháng peptide deformylase, Rifalazil thuộc nh m ansamycin, MEI036 nh m β-lactam-cephalosporin v.v [Butler and Buss 2006] Mặc dù có nhiều nỗ lực để xác định hợp chất từ mục tiêu phân tử, chất ức chế peptide deformylase (PDIs) thử nghiệm lâm sàng -5- CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất 2.1.1 Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh: Chủng E coli DH5 DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori 2.1.2 Các h a chất kit Các hóa chất kit đặt mua từ hãng hóa chất uy tín dành cho nghiên cứu sinh học phân tử Các hóa chất thiết bị máy móc: Invitrogen, Novagen, Merck, New England Biolab Qiagen, Sigma Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Hóa chất dùng cho điện di gel agarose Hóa chất dùng cảm ứng biểu gen Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn 2.1.3 Máy m c thiết bị Máy móc thiết bị phục vụ cho thí nghiệm thuộc phịng Enzyme học phân tích hoạt tính sinh học; phịng Protein tái tổ hợp, thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm, trường Đại học Khoa học Tự nhi n, Đại học Quốc gia Hà Nội 2.2 Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng ba nh m phương pháp nghi n cứu 2.2.1 Nhóm phương pháp tạo d ng, biểu hiện, tinh xác định vector tái tổ hợp 2.2.1.1 Khuếch đại đoạn gen chứa trình tự mã hóa peptide deformylase (def) 777 bp từ chủng vi khuẩn H pylori 94 2.2.1.2 Nhân d ng đoạn gen def 525 bp vào vector biểu pET22b 2.2.1.3 Biểu PDF phân tích điện di SDS-PAGE 2.2.1.4 Western blot -6- 2.2.1.5 Điện di polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) 2.2.1.6 Tinh protein tái tổ hợp phương pháp sắc kí lực 2.2.1.7 Phương pháp thẩm tách loại muối 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt t nh PDF sử dụng chất f -MAS 2.2.3 Phân t ch kết biểu ph n mềm tin sinh học ImageJ Design expert -7- CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TẠO DÒNG GEN MÃ HĨA PDF 3.1.1 Khuếch đoạn gen def mã hóa PDF kỹ thuật PCR So sánh trình tự nucleotide gen def chủng thu nhập Việt Nam với chủng tham chiếu SS1 cho thấy có khác biệt đơn nucleotide, thuộc thay amino acid (Bảng 3.1, Hình 3.3) Protein có biến đổi amino acid nhóm (kị nước ưa nước) có đặc t nh tương tự protein tham chiếu, thay đổi khác ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Đáng ch ý ba tr nh tự bảo thủ (GLAAIQ, EGCLS, and HEIDH) không thay đổi tất chủng Như vậy, chủng H pylori 94 sai khác so với chủng tham chiếu H Pylori 1,1% nucleotide 5,7% amino acid Với mức tương đồng cao với chủng giới, gen def chủng H pylori 94 sử dụng để nghiên cứu tái tổ hợp đề tài 3.1.2 Tách dịng gen mã hóa PDF Sau khuếch đại đoạn gen 777 bp chứa gen def PCR kiểm tra gel agarose , ch ng tiến hành gắn đoạn gen vào vector pGEMT biến nạp vào tế bào khả biến DH5α Kiểm tra khuẩn lạc trắng cho thấy, khuẩn lạc giếng số 3,4 không chứa đoạn chèn v c k ch thước nhỏ 400 bp, có khuẩn lạc giếng số c k ch thước lớn 500 bp c khả chứa đoạn chèn (Hình 3.4) Khuẩn lạc trắng giếng nuôi tăng sinh tách plasmid, sau đ , kết PCR lại plasmid khẳng định l n n a thu vector tái tổ hợp có chứa đoạn chèn def kích thước 777bp 3.1.3 Kết xác định trình tự gen mã hóa PDF vector tái tổ hợp Kết đọc trình tự gen def tái tổ hợp cho thấy trình tự gen trùng khớp 100% so với trình tự gen def xác định từ trước Như vậy, đoạn gen def tách dịng thành cơng vào vector tái tổ hợp pGEMT -8- 3.2 BIỂU HIỆN PDF TÁI TỔ HỢP 3.2.1 Thiết kế vector biểu PDFpET22b(+) Vector pGEMT sau xác định chứa đoạn gen def sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm nhân l n đ ng đoạn 525 bp cặp mồi có chứa trình tự cắt enzyme giới hạn NdeI XhoI Kết điện di gel agarose 2% (Hình 3.6A) cho thấy có băng đặc hiệu với k ch thước nằm khoảng dự kiến (500-600 bp) Sản phẩm PCR từ vector tách d ng pGEMT vector pET22b(+) c ng đồng thời xử lý với hai enzyme giới hạn NdeI XhoI để tạo đ u d nh tương hợp gi a đoạn gen c n chèn vector Trên hình 3.6B, vector sau cắt enzyme NdeI XhoI c thay đổi kích thước rõ rệt (Giếng 1,3), mẫu PCR khơng nhận rõ (Giếng 2,4) Tuy nhiên, dựa vào kết điện di, xác định nồng độ đoạn chèn vector để t nh toán lượng cho vào phản ứng nối vòng cho phù hợp Cấu trúc gen tái tổ hợp thiết kế để tạo protein 24,5 kDa kiểm soát promoter T7 vector pET22b (+) với đoạn 6xHis đ u cuối C để sử dụng cho mục đ ch tinh (Hình 3.7A) Trình tự gen def kết trình tự axit amin suy luận (Hình 3.7B) cấu trúc HpPDF94 chèn thành công vào pET22b (+) gi a hai vị trí enzyme giới hạn NdeI XhoI 3.2.2 Biểu PDF tái tổ hợp Qua kết điện di SDS-PAGE (Hình 3.8A) cho thấy phân đoạn protein thu (giếng pET22b-HpPDF94/T) có chứa băng protein k ch thước khoảng xấp xỉ tính tốn lý thuyết, băng không xuất mẫu đối chứng chứa vector không c đoạn chèn mẫu đối chứng không cảm ứng IPTG (giếng pET22b/NI/T, pET22b-HpPDF94/NI) Theo tính tốn ph n mềm ImageJ, lượng protein đ ch biểu chiếm khoảng 55,7 % protein tổng số (H nh 3.8B) Như vậy, peptide deformylase biểu thành công với hệ thống biểu gồm vector pET22b tế bào E coli BL21-RIL Kết Western blot cho thấy, pha tổng số, pha tan pha cặn từ dịch ni tế bào có cảm ứng IPTG th thu băng đậm, gắn với kháng thể anti-His, màu với thuốc nhuộm AP rõ nét (H nh 3.9) Điều chứng tỏ việc biểu thành công PDF tái tổ hợp tế bào E coli -9- 3.2.3 Khảo sát điều kiện biểu PDF tái tổ hợp E coli Kết biểu ban đ u thu PDF tái tổ hợp tan 55,7%, cịn lại 44,3% nằm pha khơng tan Theo nhiều nghiên cứu tính tan protein tái tổ hợp, có số yếu tố có khả làm tăng t nh tan thay đổi nhiệt độ, pH, co-factor bổ sung số chất đặc biệt Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng điều kiện biểu đến độ tan hàm lượng PDF tái tổ hợp thu (A) (B) Hình 3.14: (A) Biểu đồ sinh trưởng tế bào BL21 chứa vector tái tổ hợp có mặt kim loại hóa trị II (B) Ảnh hưởng ion khác đến suất hòa tan PDF tái tổ hợp NI: không cảm ứng; NS: không bổ sung; Co, Mg, Ca, Ni, Fe, Cu, Zn: bổ sung ion khác Sau khảo sát, điều kiện biểu tế bào E coli thu nhiều PDF tái tổ hợp pha tan nhiệt độ 28oC, pH môi trường xấp xỉ 7, cảm ứng IPTG 1mM, bổ sung ion kim loại hóa trị II Co2+ với nồng độ 100µM 3.2.4 Tinh PDF tái tổ hợp 3.2.4.1 Ly giải tế bào thu phân đoạn Nhằm thu lượng PDF tái tổ hợp lớn, ch ng tiến hành nghiên cứu lên men thu protein quy mơ 0,25lít/mẻ sử dụng bình tam giác lít điều kiện tối ưu xác định Sau thu tế bào, trình ly giải tế bào ảnh hưởng nhiều đến sử dụng máy siêu âm với chu kỳ tốc độ khác Chế độ siêu âm với chu kỳ 0,6 công suất 60 lựa chọn cho l n ly giải tế bào - 10 - đựng ống thủy tinh 3.2.4.2 Tinh protein tái tổ hợp PDF sắc ký lực Ni-NTA Kết điện di tr n gel tr ng khớp với kết đo nano-drop, PDF thu h u hết phân đoạn đẩy số 7,8,9, phân đoạn đẩy số phân đoạn thu PDF với lượng lớn (H nh 3.16) Băng PDF thu c k ch thước xấp xỉ 25 kDa, giống với t nh toán lý thuyết 24,5 kDa Bằng ph n mềm ImageJ, độ tinh PDF t nh tốn 96,6 Q trình tinh đạt hiệu cao protein bị dịch qua cột (FT) dịch rửa khoảng 5% (Hình 3.16B) Bên cạnh đ , tr nh thẩm tách có hiệu việc đặc protein làm cho nồng độ PDF tăng l n khoảng 2,5 l n (Hình 3.17) SDS-PAGE western blot (H nh 3.18) cho thấy băng HpPDF94 tái tổ hợp nhất, sắc nét vị tr t nh toán lý thuyết Điều cho thấy protein đ ch tinh hiệu với độ tinh xấp xỉ 96,6% Hiệu suất PDF tái tổ hợp từ l t môi trường nuôi cấy khoảng 31,25 mg, tương đương với nghiên cứu trước (Che et al., 2011) (A) (B) Hình 3.18 (A) Ảnh nhuộm western blot HpPDF94 tái tổ hợp tinh sắc ký cột niken M: marker protein; NI: không gây ra; T: tổng protein (dịch ly giải tế bào thô); S: phân đoạn h a tan; I: phân đoạn không tan; FT: phân đoạn qua cột; W1: phân đoạn rửa; E4-E6: phân đoạn đẩy (B) Ảnh điện di HpPDF sau tinh SDS-PAGE Trong nghiên cứu này, hiệu suất tinh PDF đánh giá qua bước tinh trình bày Bảng 3.2 Kết cho thấy PDF tái tổ hợp tinh có hoạt độ ri ng tăng từ 11,4 U/mg protein đến 145,3 U/mg protein, tăng 13 l n so với enzym - 11 - thô Trong nghiên cứu Meinnel cộng sự, PDF tái tổ hợp tinh với hiệu suất đạt 26,6 % mức độ tinh đạt xấp xỉ l n [11] Hơn n a, hoạt độ riêng PDF thu cao nhiều so với PDF từ E coli nghiên cứu đ (31,13 U/mg) [12] 3.3 Nghiên cứu hoạt tính PDF tái tổ hợp 3.3.1 Điều kiện hoạt động tối thích PDF tái tổ hợp 3.3.1.1 Ảnh hƣởng yếu tố đến phản ứng Tốc độ phản ứng enzyme-cơ chất phụ thuộc vào nồng độ enzyme nồng độ chất Ch nh v thế, việc tối ưu dãy nồng độ enzyme bước đ u cho quy tr nh thử hoạt t nh Sau sử dụng PDF nồng độ 0,5µM, 0,05µM, 0,005µM với phản ứng khơng c chất, kết thu đồ th đây: Sau lựa chọn 0,05µM nồng độ PDF sử dụng cho phản ứng, th nghiệm thử hoạt t nh tiến hành với nồng độ chất f-MAS 1mM Nh n tr n đồ thị (H nh 3.20) c thể nhận thấy không c PDF, số đọc ổn định khoảng 0,2, tr ng khớp với giá trị th nghiệm tr n C n c mặt PDF, số đọc tăng l n gấp l n, từ đ c thể khẳng định PDF tái tổ hợp thu c hoạt t nh Điều c ý nghĩa quan trọng enzyme tái tổ hợp Việc PDF c hoạt t nh bước đ u mang lại kết định cho q trình thí nghiệm, tạo tiền đề cho nghi n cứu động lực enzyme, ảnh hưởng yếu tố pH, nhiệt độ, tương tác enzyme với ion kim loại 3.3.1.2 Nhiệt độ pH tối thích cho phản ứng PDF Các thí nghiệm enzym cho thấy, với diện HpPDF94 tinh khiết, lượng sản phẩm NADH tạo phản ứng ghép nối tăng theo thời gian, cho thấy hoạt tính loại bỏ N-formyl protein tái tổ hợp Khi khảo sát ảnh hưởng pH đệm khác nhau, kết cho thấy HpPDF chứa Co2+ (Co-HpPDF) hoạt động thấp pH axit, cao đáng kể khoảng 7,0-8,5 với pH tối ưu 7,5 (H nh 3.21A), sau đ giảm xuống Một thí nghiệm tương tự kiểm tra điều kiện pH đệm báo cáo phạm vi pH tối ưu gi a 8,0 9,0 (Han cộng sự, 2004) Về nhiệt độ xét nghiệm, Co-HpPDF hoạt động mức rộng (37-60°C) (Hình 3.21B), nhiên, theo nghiên cứu Han cộng sự, 2004, nhiệt độ cao không phù hợp cho xét nghiệm formyl- MAS không ổn định - 12 - 3.3.2 Xác định số động học độ bền PDF tái tổ hợp 3.3.2.1 Hằng số động học Các đặc tính xúc tác Co-HpPDF đặc trưng pH nhiệt độ tối ưu thông qua việc xác định tham số động học Km Vmax phương tr nh Lineweaver – Burk (Hình 3.22) Hình 3.22 Lineweaver–Burk plot of Co-HpPDF at 37oC and pH 7.5 Hoạt tính cắt nhóm formyl chất đặc hiệu fMAS PDF tái tổ hợp so sánh với enzyme bị bất hoạt xử lý 95oC ph t đối chứng với phản ứng mặt PDF (Hình 3.23) Tiếp theo, kết khảo sát thơng số động học hoạt tính Co-HpPDF tái tổ hợp biểu E coli biểu thị t nh toán qua đồ thị Lineweaver-Burk (Hình 4) Giá trị Km PDF nghiên cứu nhỏ, đạt 137,16 µM, nhỏ giá trị Km PDF chủng biểu nghiên cứu khác Theo nghiên cứu Han cs [13] giá trị Km Co-HpPDF đạt 1700 µM, khi, nghiên cứu Lee Km Co-HsPDF cao nhiều, đạt 11.000 µM [14] Vì Km thể lực enzym với chất, nghiên cứu HpPDF đạt tốc độ phản ứng tối đa nồng độ chất thấp Giá trị kcat kcat/Km HpPDF đạt 0,02 173,42, cao nhiều so với giá trị đ nghiên cứu Lee cộng (0,0081 0,74) [9] So với PDF tinh từ loài khác, hiệu xúc tác Co-HpPDF tái tổ hợp nghiên cứu thấp so với NiEcPDF cao đáng kể so với Co-HpPDF từ nghiên cứu Han, có thời gian đạt tốc độ mong muốn nhanh đường lại thấp (Han et al 2004) Kết cho thấy enzym nghiên cứu có khả x c tác chuyển h a lượng chất lớn, đạt hiệu xúc tác cao - 13 - 3.3.2.2 Độ bền nhiệt PDF Để đánh giá độ bền PDF theo nhiệt độ, ủ PDF nhiệt độ khác v ng 30 ph t, sau đ tiến hành đo hoạt tính PDF, so sánh với hoạt tính PDF bảo quản -60oC Mỗi thí nghiệm lấy đo hoạt tính sau thời gian ủ mẫu Đáng ý, hoạt tính enzyme bị giảm g n 80% sau ủ 30oC vòng 30 phút (Hình 3.24) Ở nhiệt độ cao hơn, hoạt tính bị giảm t bị giảm 50% sau ủ 30 ph t Điều cho thấy, hoạt tính PDF tương đối bền nhiệt độ cao Để xác định điều kiện bảo quản PDF, hoạt tính PDF theo dõi khoảng thời gian khác nhiệt độ khác Đ u tiên, enzyme ủ 25o C lấy đo hoạt tính thời gian khác Kết cho thấy, hoạt tính enzyme giảm nhanh sau 1h giảm 60%, sau 3h giảm cịn 40% sau 24h hoạt tính enzyme bị giảm g n 20 (H nh 3.25B) Như vậy, nhiệt độ 25 o C khơng thích hợp để bảo quản enzyme dù thời gian ngắn Khi bảo quản 4oC, hoạt tính enzyme giảm chậm nhiều so với nhiệt độ phịng, h u khơng giảm vịng giờ, 98% sau tu n Sau tu n 4oC, hoạt tính enzyme cịn lại 88 (H nh 3.25B) Như vậy, nhiệt độ 4oC bảo quản enzyme thời gian ngắn ( t tu n) Tiếp tục khảo sát từ tu n đến 12 tu n, hoạt tính enzyme giảm nhanh lại 20% bảo quản 4oC Trong đ , bảo quản -80oC hoạt tính enzyme gi 99% sau 12 tu n Tiếp tục khảo sát đến thời điểm 48 tu n (12 tháng) điều kiện bảo quản -80oC, hoạt tính PDF cịn lại 92 Như vậy, nhiệt độ 80oC hồn tồn thích hợp để bảo quản enzyme PDF tinh lâu dài 3.3.3 Ảnh hƣởng số dịch chất thực vật số hợp chất đến hoạt tính PDF Để đánh giá ảnh hưởng dịch chiết thực vật lên hoạt tính PDF, đánh giá ảnh hưởng dung mơi dimethyl sulfoxide (DMSO) lên hoạt tính PDF DMSO dung mơi hịa tan dịch chiết thực vật sử dụng Nồng độ DMSO đánh giá 10%, 1% 0,1% Kết cho thấy, nồng độ DMSO 10% ức chế 70% hoạt tính PDF, nồng độ 0,1% DMSO ảnh hưởng t đến hoạt tính PDF (gi lại 90% hoạt t nh PDF) (H nh 3.26) Như vậy, với nồng độ DMSO 0,1% dịch chiết thực vật đánh giá hoạt tính PDF ảnh hưởng dịch chiết thực vật đến hoạt tính PDF - 14 - Một số dịch chiết tổng số từ loài thực vật Việt Nam đánh giá mức độ ảnh hưởng đến hoạt tính PDF tái tổ hợp Trong đ , c 9/22 dịch chiết có khả ức chế từ 50% hoạt tính PDF nồng độ nghiên cứu (2µg/100µl phản ứng) Dịch chiết ethy acetate nghệ đen c tác dụng ức chết PDF mạnh nồng độ 2µg/100µl, ức chế 73,49% hoạt động PDF, có số dịch chiết g n khơng ức chế dịch chiết từ đỗ rừng (1,07 1,55%), dịch chiết ethyl acetate tr u không (1,72%) Khi so sánh với kết xác định khả kháng H Pylori, dịch chiết ethyl acetate từ chè dây kim ngân hoa có tác dụng kháng H pylori mạnh khả ức chế PDF mạnh Bên cạnh đ , số loại dịch chiết có vịng kháng khuẩn lớn lại khơng thể khả ức chế PDF mẫu tr u không chiết ethyl acetate, đỗ rừng – ethyl acetate, sa nhân – methanol Dịch chiết nghệ đen c tác dụng ức chế hoạt động PDF mạnh nên tiến hành xác định nồng độ ức chế 50% hoạt tính (IC50) Từ kết nghiên cứu IC50 cho thấy, hoạt tính PDF bị ức chế 50% 0,74 μg (Hình 3.27) Nồng độ thấp so với nhiều chất ức chế PDF nghi n cứu trước Bên cạnh đ , so sánh với kết thử khả kháng khuẩn H pylori, dịch chiết từ tr u khơng lại có khả ức chế mạnh Điều khả xâm nhập chất dịch chiết tr u không lớn, c thể nhiều chế tác dụng khác lên vi khuẩn Để tìm hiểu vấn đề này, tơi tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả ức chế hoạt động PDF phân đoạn từ tr u không, làm giàu lên số thành ph n, đủ chất có tác dụng Kết thể bảng 3.4 Kết cho thấy, phân đoạn tr u khơng có khả ức chế PDF với số mức độ khác nhau, đạt từ 4,9 đến 51,32 Điều cho thấy, làm giàu số nhóm chất dịch chiết tr u khơng lên số nhóm chất lại có tác dụng ức chế mạnh, cụ thể phân đoạn PB23-2, PB23-9 với tỷ lệ ức chế 51,32% 49,25% Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme PDF 28 chất tinh 28 hợp chất từ thực vật sàng lọc cách sử dụng phép thử hoạt t nh để xác định hợp chất hoạt động ức chế HpPDF (Hình 3.28) Actinonin, PDI tự nhiên, có giá trị IC50 thấp 0,17 μM Ch ng sử dụng Actinonin đối chứng dương - 15 - để đánh giá chất ức chế hệ thống sàng lọc Theo hình 3.28, có 11/28 mẫu ức chế hoạt tính PDF với giá trị IC50 nhỏ 20 nM Các chất ức chế PDF chọn lọc cho enzyme vi khuẩn, ví dụ như, BB-81384 ức chế PDF (chứa Ni) Streptococcus pneumoniae, Haemophilus Influenzae, E coli Staphylococcus aureus với giá trị IC50 9, 11, 60, 300 nM (Gross et al 2004) 18/20 (90%) thể giá trị IC50 từ 75 nM trở xuống PDF S pneumoniae (Hackbarth, 2002) Như cho thấy, chất t m có tiềm cao việc sử dụng để ức chế hoạt động PDF vi khuẩn Kết cho thấy có 8/25 mẫu có khả ức chế mạnh chủng H pylori PDF tái tổ hợp 6/25 mẫu có khả ức chế PDF mạnh không ức chế chủng H pylori nồng độ nghiên cứu Một số chất ức chế PDF có tác dụng việc ức chế vi khuẩn sống, có khả tác động hàng rào thành tế bào màng ngồi, dịng chảy hoạt động theo chế bơm (Apfel, 2000) Trong số chất có khả ức chế mạnh PDF, ch ng xác định kiểu ức chế enzyme chất chất số số 21 (Hình 3.29) Kết cho thấy chất số ức chế hoạt động PDF không theo kiểu ức chế nào, chất số 21 ức chế PDF theo kiểu không cạnh tranh (uncompetitive) (A) - 16 - (B) Hình 3.29 Hoạt tính PDF có mặt chất số (A) chất số 21 (B) Kết docking Các hợp chất có liên kết tiềm với PDF sàng lọc sử dụng phương pháp docking Kết cho thấy số chất có khả li n kết tương đương với chất đối chứng actinonin chất số 4, 20, usnic acid, đ , c chất có khả li n kết với PDF vượt trội chất số 26 28 (Bảng 3.5) Kết mơ hình liên kết cho thấy, chất số 26 28 liên kết với PDF vị tr amino acid sau: Gly46, Gln51, Leu97 với độ dài liên kết thể tương đối lớn (Phụ lục) Kết khẳng định lại kết thực nghiệm docking sử dụng để sàng lọc trước thử nghiệm thực tế PDF KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Tr n sở kết nhận được, rút kết luận sau: Đã tạo d ng xác định trình tự gen mã hố cho peptide deformylase với k ch thước 575 bp tương đồng 100 với tr nh tự amino acid v ng peptide trưởng thành gen def mã hóa peptide deformylase từ chủng Helicobacter pylori Việt Nam Đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa đoạn gen def biểu PDF dạng dung hợp với Histag vector pET22b(+) tế bào BL21 E Coli Đã tối ưu điều kiện biểu PDF tái tổ hợp 28oC, pH 7,0, IPTG mM; tinh PDF tái tổ - 17 - hợp dạng PDF-Histag với hiệu suất 60 mg/L, hiệu suất thu hồi từ dịch chiết tế bào đạt 12% độ 96,6 ; xác định peptide PDF có khối lượng phân tử 24,5 kDa Đã nghi n cứu hoạt tính PDF với giá trị kcat kcat/Km HpPDF đạt 0,02 173,42 đánh giá ảnh hưởng số hợp chất từ thảo dược có khả ức chế hoạt động PDF KIẾN NGHỊ Với nh ng kết đạt được, ch ng mong muốn tiếp tục nghi n cứu m nh để sàng lọc hợp chất tiềm c tác dụng ức chế PDF c khả kháng H pylori - 18 - DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Đỗ Thị Thanh Trung, L Hồng Điệp, Phạm Bảo Y n (2015), “Nhân dòng bước đ u biểu peptide deformylase chủng vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31(4S), 453-460 Nguyen Thi Huyen, Trinh Le Phuong, Do Thi Thanh Trung, Le Hong Diep, Pham Bao Yen (2016), “Evaluation of recent methods to improve recombinant Helicobacter pylori protein yield and solubility in Escherichia coli expression system”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32(1S), 286-292 Đỗ Thị Thanh Trung, L Hồng Điệp, Phạm Bảo Y n (2017), “Tinh xác định hoạt t nh peptide deformylase từ Helicobacter pylori biểu Escherichia coli”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 33(1S), 262-266 Đỗ Thị Thanh Trung, Phạm Thị Vui, Nguyễn Huyền Trang, Phạm Vinh Hoa, Nguyễn Thị Thanh Thi, Phạm Thị Lương Hằng, Phạm Bảo Y n (2018), “Đánh giá khả ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori số dịch chiết thảo dược Việt Nam”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam 60(7), 23-27 Trung Do, Trang Nguyen Huyen, Thai Ngan Ha, Nguyen Thi Huynh Nhu, Nguyen Van Lam, Nguyen Thi Thu Tram and Pham Bao Yen (2019), “Identification of Potential Anti-Helicobacter pylori Compounds from Usnea undulata Extracts”, Natural Product Communications 14 (7) Nguyen Huyen Trang*, Do Thi Thanh Trung*, Nguyen Thi Thanh Thi, Pham Thi Luong Hang, Pham Thi Vinh Hoa, Pham Bao Yen (2019), “Inhibitory effects of Piper betle extracts and potential compounds on Helicobacter pylori”, Academia journal of biology 41(4), 69–74 (*Co-first authors) Đỗ Thị Thanh Trung, Phạm Bảo Y n (2016), “Screening of Helicobacter pylori peptide deformylase inhibiting compounds from Vietnamese medicinal plants to develop effective drugs for gastrointestinal diseases (poster)”, Keystone Symposia Conference, D4: Gut Microbiota, Metabolic Disorders and Beyond - 19 - ... peptide deformylase vào vector ph hợp Biểu peptide deformylase tái tổ hợp với lượng lớn pha tan -1- Tinh peptide deformylase tái tổ hợp có hoạt t nh độ tinh cao Nghi n cứu t nh chất peptide deformylase. .. nhiều nỗ lực để xác định hợp chất từ mục tiêu phân tử, chất ức chế peptide deformylase (PDIs) thử nghiệm lâm sàng -5- CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất 2.1.1 Chủng... def xác định từ trước Như vậy, đoạn gen def tách dịng thành cơng vào vector tái tổ hợp pGEMT -8- 3.2 BIỂU HIỆN PDF TÁI TỔ HỢP 3.2.1 Thiết kế vector biểu PDFpET22b(+) Vector pGEMT sau xác định