Nghiên cứu này có mục tiêu là tạo tái tổ hợp ADN của gen VP28 ở virus trong tế bào nấm men nhằm thu được chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi.
VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN DỊNG HĨA VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRONG TẾ BÀO NẤM MEN PICHCHIA PASTORIS Ngô Thị Ngọc Thủy1, Nguyễn Viết Dũng2, Đặng Thị Trà My1 TÓM TẮT Virus gây bệnh đốm trắng loại virus phổ biến nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm he giới Việt Nam Nghiên cứu có mục tiêu tạo tái tổ hợp ADN gen VP28 virus tế bào nấm men nhằm thu chủng nấm men có khả biểu protein VP28 ngoại bào làm nguyên liệu cho việc điều chế vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi Đoạn gen VP28 khuếch đại kỹ thuật Polymerase chain reaction; sản phẩm khuếch đại sau dịng hóa vào vector pPIC9K để tạo tái tổ hợp pPIC9K-VP28 pPIC9K-VP28 biến nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 để biểu protein mục tiêu cảm ứng biểu methanol Quá trình sàng lọc 200 chủng nấm men sau biến nạp thực Kết thu chủng nấm men có mang pPICK9KVP28 có khả cảm ứng biểu protein VP28 ngoại bào Áp dụng phương pháp Bradford để đo nồng độ protein ngoại bào chủng nghiên cứu theo thời gian lên men P pastoris lượng protein tổng số cao sau 72 ni cấy 106,9 μg/ml Từ khóa: Pichia pastoris, protein, VP28, WSSV I MỞ ĐẦU Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) xuất năm 1992 Trung Quốc (Chou ctv, 1995) loại virus gây bệnh nghiêm trọng phổ biến cho lồi tơm he Ở Việt Nam, virus phát năm 1993 từ đến chúng nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại kinh tế lớn cho nghề nuôi tôm Theo cục Thú y, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, năm 2012, bệnh đốm trắng xuất vùng nuôi tôm 19 tỉnh thành nước với tổng diện tích bệnh 8.108,5 Bảy tháng đầu năm 2013, dịch bệnh đốm trắng xuất lây lan nhanh 23 tỉnh với tổng diện tích bệnh 7.030 Nhằm giảm thiểu thiệt hại dịch bệnh đốm trắng gây ra, biện pháp phịng bệnh thảo dược, chất kích thích miễn dịch đặc biệt protein/DNA tái tổ hợp (vắc xin/tolerine), thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu sau tượng “đáp ứng miễn dịch” (quasi-immune response) tôm (Venegas ctv, 2000) công bố Việc sử dụng kỹ thuật tạo protein DNA tái tổ hợp nghiên cứu Việt Nam với mục tiêu phát triển kháng thể đa dịng chẩn đốn bệnh đốm trắng (Nguyễn Quỳnh Anh 2006; Bùi Thị Bích Hằng, 2012) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật việc nghiên cứu chế tạo vắc xin/tolerine phòng bệnh đốm trắng tôm Nghiên cứu phần đề tài cấp Bộ: “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất tolerin có khả hạn chế lây lan virus gây bệnh đốm trắng tôm Sú nuôi thương phẩm Đồng sông Phân Viện Nghiên cứu Thuỷ sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: thuyngo8@yahoo.com Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 6/2014 79 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cửu Long” thực việc dịng hóa biểu gen mã hóa protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tế bào nấm men để làm nguyên liệu cho việc chế tạo vắc xin/tolerine phịng bệnh cho tơm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng virus đốm trắng sử dụng nghiên cứu chủng thu tỉnh Quảng Ngãi thời gian dịch bệnh; loại virus dùng nghiên cứu Dieu (2010) cung cấp trường Đại học Wageningen, Hà Lan 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Công việc tiến hành Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản từ tháng 4/2013 đến tháng 12/2013 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tạo vector tái tổ hợp pPick9K-VP28 (1) Chuẩn bị gen VP 28 vector Khuếch đại tinh cấu trúc gen VP28 (Jha ctv, 2007) Đoạn gen VP28 virus nhân lên số lượng phương pháp polymerase chain reaction (PCR) sử dụng cặp mồi VP28YE-FW (5’-AAAGAATTCATGGATCTTTCTTTCA CTCTTTCGGG-3’) mang trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn EcoRI VP28YE-R-His (5’-GCGGCCGCATG AT G AT G AT G AT G AT G C T C G G T C T C AGTGCCAGAG-3’) có gắn trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn NotI trình tự mã hóa liên tục amino acid Histidine (phần gạch chân) Điều kiện phản ứng: 94°C phút sau chu kỳ 95°C 30 giây, 55°C 45 giây, 72°C 60 giây lặp lại 35 lần phản ứng giữ 72°C 10 phút trước kết thúc Sản phẩm phản ứng điện di gel agarose 1,5% kiểm tra tia UV Sản phẩm PCR gen VP28 650bp 80 Sản phẩm PCR sau tinh cách sử dụng kit PCR purification (Invitrogen) thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Tinh plasmid pPICK9K Plasmid pPIC9K vi khuẩn E coli DH5α tinh kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification (A1330, Promega, Mỹ) Cụ thể, khuẩn lạc E coli DH5α mang vector pPIC9K mơi trường LB có ampicilin chọn ni sinh khối mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin (100µg/ml), ni cấy lắc (200 vịng/phút) 37°C; sinh khối thu sau 18-24 ni cấy Sau đó, plasmid pPIC9K sinh khối vi khuẩn nuôi cấy tinh kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Plasmid tinh bảo quản -20°C Xử lý DNA VP28 plasmid tinh enzyme cắt giới hạn DNA VP28 plasmid tinh xử lý với enzyme cắt giới hạn EcoRI NotI Thành phần hóa chất tham gia q trình phân cắt bao gồm: 1,6μl nước cất; 30,0μl DNA (VP28) pPIC9K; 4,0μl NEB Buffer (10X); 2,0μl EcoRI (10.000U/μl, NEB); 2,0μl NotI (10.000U/ μl, NEB) 0,4μl BSA 100X Hỗn hợp cắt ủ qua đêm 37°C Toàn sản phẩm sau phản ứng điện di gel agarose 1% sau tinh lại hóa chất Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Mỹ) Sản phẩm sau tinh bảo quản -20°C (2) Tạo vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 Gen VP28 vector pPIC9K sau xử lý với enzyme EcoRI NotI nối enzyme gắn kết T4 ligase (Promega, Mỹ) Phản ứng nối bao gồm thành phần: 2μl nước cất, 1μl dung dịch đệm 10x, 1μl VP28/EcoRINotI, 5μl pPIC9K/EcoRI-NotI, 1,0μl T4 ligase, ủ nhiệt độ phòng Bằng việc thiết lập pPICK9K-VP28 vị trí chèn cặp enzyme EcoRI NotI, hệ thống vector cho phép biểu protein VP28 tái tổ hợp mang trình TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN tự peptide α-factor, protein VP28 với 6xHis gắn đầu C-terminal P pastoris tiết mơi trường ni cấy Trong q trình tiết mơi trường, trình tự peptide α-factor tự động cắt bỏ (3) Phương pháp hóa biến nạp chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp Sử dụng phương pháp biến nạp sốc nhiệt để chuyển sản phẩm nối pPIC9K-Vp28 vào tế bào khả nạp E coli JM109 (L2001, Promega, Mỹ) Quy trình tóm tắt sau: lấy 2μl sản phẩm nối pPIC9K-VP28 cho vào 50 μl E coli giữ lạnh, khuấy nhẹ ủ 15 phút đá lạnh; cho vào bể nhiệt 42°C 45 giây ủ lại đá lạnh phút Dung dịch sau bổ sung 950μl môi trường SOC lạnh nuôi cấy lắc (200 vòng/ phút) 37°C Chia 1000μl hỗn hợp thành hai phần trải đĩa mơi trường LB Agar có ampiciline (100 μg/ml) ủ 37°C qua đêm Sự diện pPIC9KVP28 vi khuẩn kiểm tra phương pháp PCR với mồi VP28YE-FW và VP28YE-R-His Đồng thời, diện gen VP28 vector tái tổ hợp pPICK9kVP28 xác định máy giải trình tự AB system với mồi giải trình tự AOX1 Reverse 5’-GCAAATG GCATTCTGACATCC-3’ α factor 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ (Công ty Nam Khoa, Việt Nam) 2.3.2 Điện biến nạp pPICK9K-VP28 vào tế bào nấm men Vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 mở vòng enzyme SalI nhằm tạo điều kiện cho gene mục tiêu gắn chèn vào gene P pastoris GS115 vị trí gene HIS4 giữ gene AOX1 nguyên vẹn Do đó, đa số chủng nấm men có kiểu hình Mut+ - gen AOX1 tự nhiên nấm men ngun vẹn - phát triển tốt mơi trường có methanol Tuy nhiên, plasmid cịn diện trình tự AOX1 nên tái tổ hợp xảy gene AOX1 làm bất hoạt gen, kết dòng nấm men cịn gene AOX2 nên q trình biến dưỡng methanol gọi chủng MutS Ngược lại, kiểu hình Muts gen AOX1 bị bất hoạt nên trình biến dưỡng methanol đi, làm nấm men phát triển mơi trường có methanol pPICK9K-VP28 pPICK9K rỗng (không mang gen mục tiêu) dạng mạch thẳng điện biến nạp vào P pastoris GS115 (Invitrogen, Mỹ) Cụ thể, 10µg pPICK9KVP28 pPICK9K mạch thẳng trộn 80µl tế bào nấm men khả biến tinh cuvette điện biến nạp vô trùng Cuvette ủ đá phút tiến hành điện biến nạp 1500V 1,5 giây Sau đó, 100µl Sorbitol 1M lạnh cho vào cuvette tiến hành trải hỗn hợp tế bào sau điện nạp đĩa môi trường MD, ủ đĩa 28°C Sau 2-3 ngày nuôi cấy, quan sát khuẩn lạc mọc môi trường MD 2.3.3 Chọn lọc dịng P pastoris mang gen VP28 có khả biểu protein (1) Chọn lọc dựa tốc độ tăng trưởng môi trường chứa methanol Chuyển chủng Pichia tái tổ hợp môi trường Minimal dextrose (MD) sau điện biến nạp sang môi trường Minimal methanol (MM), MD Yeast extract peptone dextrose (YPD), theo thứ tự Ủ đĩa môi trường 28°C 2-3 ngày Các chủng Mut+ MutS phân biệt dựa vào mức độ tăng sinh nấm men: Mut+ tăng trưởng bình thường MM MD, khi, MutS tăng trưởng môi trường MD mà không tăng trưởng yếu MM (2) Chọn lọc dòng nấm men mang gene mục tiêu PCR Sự diện plasmid pPIC9K-VP28 dòng P pastoris xác định phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F ( ’ G A C T G G T T C C A AT T G A C A A G C ) AOX1-R (3’GCAAA TGGCATTCTGACATCC) DNA từ dịng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 81 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN nấm men tách chiết kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) theo hướng dẫn nhà sản xuất Điều kiện phản ứng: 10ng DNA; 1,25µl mồi (10µM), 0,5µl dNTP mix (10mM), 2,5µl dung dịch đệm MgCl2 (10x), 1µl Taq polymerase (1U), ddH2O cho đủ 25µl Chế độ nhiệt phản ứng : 94°C phút, sau 30 chu kỳ 94°C giây, 55°C 30 giây, 72°C phút 30 giây cuối chu kỳ 72°C 10 phút Kết điện di agarose gel 1% (3) Chọn dòng P pastoris mang nhiều gen VP28 mơi trường YPD Geneticin Vector pPICK9K có trình tự mã hóa cho gen kanamycine, gen khơng kháng kháng sinh kanamycine mà kháng G418 Mức kháng G418 phụ thuộc vào số lượng gen kanamycine tích hợp P pastoris Giữa gen kanamycine “cassette biểu hiện” có mối liên hệ di truyền, dựa vào người ta suy luận dịng có khả kháng G418 nồng độ cao thường chứa nhiều gen biến nạp vào khả biểu protein cao Do đó, dịng P pastoris pPIC9KVP28 chọn lọc theo phương pháp chuyển sang mơi trường YPD có G418 nồng độ 2, 4, 6mg/ml Chọn dịng P pastoris pPIC9K-VP28 có khả kháng G418 nồng độ cao 2.3.4 Biểu protein Các dòng P pastoris pPIC9K-VP28 mọc tốt mơi trường YPD Geneticin 6mg dịng đối chứng (mang plasmid rỗng) chọn để cảm ứng biểu protein mơi trường có bổ sung 2% methanol Cụ thể, khuẩn lạc đơn nấm men ni cấy mơi trường BMGY 28°C có lắc (250 vòng/phút) OD600nm đạt 2-6 thu sinh khối cách ly tâm môi trường nuôi cấy 1500g phút nhiệt độ phòng huyền phù môi trường BMMY cho OD600nm dịch nuôi cấy Tiếp theo, môi trường nuôi cấy bổ sung methanol 100% để 82 đạt nồng độ cuối 2% ủ 28°C có lắc (250 vịng/phút) Sau 24 nuôi cấy, methanol 100% lại bổ sung vào môi trường (nồng độ cuối 2%) nhằm cảm ứng biểu protein Sau 24, 48, 72 nuôi cấy tiến hành thu dịch nuôi cấy xác tế bào cách ly tâm; sản phẩm bảo quản -80°C Sự diện protein VP28 xác tế bào dịch nuôi cấy kiểm tra SDS-PAGE khẳng định lại phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ); hàm lượng protein đo phương pháp Bradford III KẾT QUẢ 3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp pPIC9KVP28 tế bào E.coli JM109 Kết nhân dịng gen mã hóa protein VP28 thể Hình Theo đoạn gen khuyếch đại có độ dài khoảng 650 bp tương đương với độ dài đối chứng dương chủng virus WSSV nhận từ ĐH Arizone (Mỹ) phù hợp với chiều dài lý thuyết sản phẩm khuếch đại 645 bp Sau xử lý với enzyme cắt giới hạn, băng DNA VP28/EcoRI-NotI pPIC9K/EcoRINotI phân tách gel agarose 1,2% cắt để tinh nhằm loại bỏ DNA tạp không mong muốn Kết kiểm tra kích thước, độ VP28/EcoRI-NotI pPIC9K /EcoRI-NotI thể Hình Theo băng VP28/EcoRI-NotI pPIC9K/ EcoRI-NotI có kích thước tương ứng với lý thuyết 645bp 9276bp khơng tạp nhiễm với DNA có kích thước khác Vector tái tổ hợp PIC9K-VP28 chuyển vào E coli JM109 kỹ thuật sốc nhiệt vi khuẩn sau biến nạp trải môi trường thạch LB bổ sung ampicilin 50µg.10-1ml Sáu khuẩn lạc chọn để kiểm tra diện gen VP28 phương pháp PCR với mồi VP28YE-FW VP28YE-R-His Kết TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN phân tích (Hình 3) cho thấy dịng vi khuẩn 6-11 cho kết dương tính với gen VP28 Trong hai khuẩn lạc 11 cho kết khuyếch đại tốt nên chọn cho phân tích với enzyme cắt giới hạn Hình Kết phân tính dịng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 Giếng 6-11: Khuẩn lạc E coli sau biến nạp với pPIC9KVP28 Giếng M: Thang DNA Giếng Pos: Chứng dương với WSSV Giếng Neg: Chứng âm với vi khuẩn E.coli Hình Kết khuyếch đại gen VP28 phương pháp PCR Giếng M: Thang DNA 100bp Giếng Pos: chứng dương; Giếng Neg: chứng âm; W: chủng virus WSSV sử dụng làm khn mẫu Hình VP28 pPIC9K sau xử lý với enzyme EcoRI Not I Giếng M1: thang DNA 1Kb Giếng M2: thang DNA 100bp Sự diện vector tái tổ hợp pPIC9KVP28 hai khuẩn lạc 11 kiểm tra cắt giới hạn với cặp enzyme EcoRI NotI Kết cho thấy vector tái tổ hợp pPIC9K-VP28 dòng vi khuẩn 11 sau xử lý enzyme cắt giới hạn cho hai băng sản phẩm, băng có kích thước nhỏ tương ứng với kích thước gen VP28/EcoRI-NotI băng có kích thước lớn tương đương kích thước pPIC9K/EcoRI-NotI (Hình 4); ngồi khơng có vạch phụ xuất hiện, phản ứng cắt thực hồn tồn Hình Kết cắt pPIC9K-VP28 với EcoRI NotI Giếng M1, M2: thang DNA 1kb 100bp Giếng 1, 2: Gen VP28/EcoRI-NotI; pPIC9K/EcoRI-NotI; Giếng 3, 5, 4, 6: pPIC9K-VP28 vi khuẩn 11 chưa xử lý enzyme TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 83 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Để kiểm tra độ xác trình tự gen VP28 vị trí nối với vector pPIC9K, plasmid tái tổ hợp tách từ hai dịng 11 chọn giải trình tự công ty Nam Khoa (Việt Nam) Kết cho thấy giải trình tự gen VP28 dịng giống tương đồng 100% với chủng WSSV phân lập từ nhiều quốc gia gồm Hàn quốc (JX515788.1), Trung Quốc (AF332093.2), Nhật Bản (AY249443.1), Mỹ (AY249442.1), Indonesia (AY249441.1), Ấn Độ (DQ681069.1), Việt Nam (AY168644) công bố ngân hàng liệu NCBI Ngoài ra, phân tích dịch mã cho thấy gen VP28 đặt vector pPIC9K-VP28 cho phép mã hóa protein tái tổ hợp có 204 a.a gắn thêm Histidine vào đầu C-terminal protein (Hình 5) Hình Trình tự nucleotide trình tự amino acid giả định protein VP28 định mã từ vector pPIC9K-VP28 dòng vi khuẩn 11 Từ kết trên, chúng tơi khẳng định tạo hai dịng vi khuẩn E.coli JM109 mang vector pPIC9k chứa gen mã hóa protein VP28 virus WSSV Trên vector pPIC9K, đoạn gen mã hóa protein VP28 gắn thêm trình tự nucleotide mã hóa 6xHis đầu 3’ chèn vào vị trí sau trình tự mã hóa peptide α-factor lạc clone 100 khuẩn lạc clone 11) chọn để kiểm tra kiểu hình cách nuôi cấy môi trường MM, MD YPD 28°C ngày Kết nuôi cấy cho thấy 182 khuẩn lạc có khả mọc tốt môi trường chọn lọc; khuẩn lạc dùng cho trình chọn lọc 3.2 Kết chuyển plasmid pPIC9KVP28 vào nấm men P pastoris GS115 Vector pPIC9K thuộc dạng vector sát nhập, biến nạp sát nhập vào gen tế bào chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng Tế bào nấm men sau điện biến nạp trải mơi trường MD khơng có histidin ủ 2-3 ngày Kết ghi nhận có 400 khuẩn lạc mọc môi trường MD sau điện biến nạp 3.3 Kết sàng lọc dòng P pastoris GS115 mang nhiều gen VP28 Hai trăm khuẩn lạc mọc tốt, to, trịn, rời mơi trường MD (trong có 100 khuẩn 84 Hình Sự diện gene VP28 genome số chủng nấm men Giếng M: Thang DNA 100bp Giếng pPIC9K: plasmid pPIC9K Giếng p-VP28: plasmid pPIC9K-VP28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Giếng P.P: Pichia pastoris Giếng P.pPIC9K: P.pastoris –pPIC9K Giếng 120, 120A, 125, 126, 179: chủng số 120, 120A, 125, 126, 179 Sự diện gen VP28 182 khuẩn lạc nấm men chọn lọc kiểm tra phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F AOX1-R dựa khuôn mẫu DNA tổng số tế bào nấm men Kết cho thấy chủng nghiên cứu cho vạch: khoảng 1.117 bp (kích thước gen VP28 thêm 492bp - kích thước từ vị trí bắt cặp mồi hệ gen P pastoris đến vị trí gắn chèn) khoảng 2,2 kb - kích thước gen AOX1 (Hình 6) Như vậy, tất chủng nấm men kiểm tra có chứa pPICK9K-VP28 genome; nói cách khác, gen VP28 biến nạp thành công vào gen nấm men P pastoris với kiểu hình Mut+ Sau tạo dịng thành cơng, q trình sàng lọc dịng P.pastoris có khả biểu protein VP28 cao thực cách cấy chuyển 182 khuẩn lạc sang mơi trường YDP có bổ sung G418 nồng độ 4mg/l 6mg/l Kết sàng lọc xác định 123/182 khuẩn lạc có khả kháng Geneticin 418 nồng độ 4mg/l 62 khuẩn lạc kháng G418 nồng độ 6mg/l (Hình 7) Theo lý thuyết, 62 khuẩn lạc có chứa 14-18 copy gene VP28 genome chúng sử dụng để kiểm tra khả biểu protein VP28 3.4 Kết sàng lọc dịng P pastoris GS115 có khả tiết protein VP28 ngoại bào Sáu mươi hai chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 qua sàng lọc chủng nấm men mang pPICK9K (đối chứng âm) cảm ứng biểu protein môi trường nuôi cấy sinh khối BMGY kích thích methanol 2% mơi trường BMMY 72 Sự diện protein VP28 dịch ni cấy phân tích kỹ thuật Western blot với kháng thể đặc hiệu VP28 Kết biểu protein xác định 25 chủng có diện protein VP28 dịch nuôi cấy Tuy nhiên, chủng: 120, 120A, 125, 126, 179 cho vạch rõ ràng kích thước khoảng 28 kDa gel chạy Western blot với kháng thể kháng VP28 dùng để nghiên cứu Hình Protein VP28 dịch nuôi cấy nấm men M: Thang protein; 120, 120A, 125, 126, 179: chủng nấm men Ctrl(-): Chứng âm-nấm men có pPICK9K rỗng 3.5 Kết biểu protein Hình Kết chọn lọc dịng P pastoris mang tái tổ hợp pPIC9K-VP28 kháng 6ppm Geneticin Năm chủng nấm men có chứa pPICK9kVP28 genome có khả tiết protein ngoại bào cảm ứng biểu lượng protein tiết dịch nuôi cấy xác định theo thời gian: 24, 48 72 Kết đo hàm lượng protein theo thời gian q trình ni cấy cho thấy chủng nghiên cứu có khả tiết protein ngoại bào lượng protein tiết tăng dần theo thời gian lên men từ 24 đến 72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 85 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN (Đồ thị 1); Trong đó, chủng 126 có khả tiết lượng protein cao (106,9μg/ml) sau 72 nuôi cấy Đồ thị Nồng độ protein tổng số chủng nghiên cứu thời điểm khác trình lên men IV THẢO LUẬN Trên giới, nhiều tác giả dịng hóa biểu protein VP28 tế bào vi khuẩn khả biến E.coli để làm nguyên liệu để chế tạo vắc xin/tolerine (Witteveldt ctv., 2004; 2006; Satoh ctv., 2008) Ngoài E coli, số nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn khả biến khác như: vi khuẩn gram dương Brevibacillus brevis (Caipang et al., 2008), tế bào côn trùng (Du et al., 2006) để dịng hóa gen vỏ virus gây bệnh đốm trắng tôm nuôi Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi Thị Bích Hằng (2012) thành cơng việc dịng hóa gen VP28 virus đốm trắng vào tế bào khả biến E.coli để tạo kháng thể ứng dụng việc chẩn đoán nhanh bệnh Việc dùng tế bào nấm men để dịng hóa biểu protein nhóm nhỏ nhà nghiên cứu quan tâm hiệu bảo vệ loại vắc xin/tolerine - sản phẩm q trình dịng hóa - mang lại cao cho thời gian bảo hộ dài loại vắc xin/tolerine khác Cụ thể, Jha ctv (2006, 2007) xác định dùng rVP28 biểu hiệu qua tế bào nấm men phương pháp tiêm cho ăn đem lại hiệu 86 bảo vệ cho crayfish trước bệnh đốm trắng sau ngày kéo dài tới 21 ngày sau dùng rVP28 Trong đó, thời gian bảo hộ rVP28 biểu vi khuẩn gram âm E.coli vi khuẩn gram dương Brevibacillus choshinensis B brevis tôm 10 ngày, ngày 14 ngày (Caipang et al., 2008; Mavichak et al., 2009; Witteveldt et al., 2006) Chính vậy, việc tạo ngun liệu dịng nấm men có mang pPICK9K-VP28 có khả tiết protein ngoại bào bước khởi đầu cho nghiên cứu vắc xin/tolerine phịng bệnh đốm trắng cho tơm ni Việt Nam V KẾT LUẬN Đoạn gen VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm nhân bản, gắn với plasmid pPICK9K dịng hóa thành cơng vào vi khuẩn khả nạp E coli JM109 tế bào nấm men P pastoris GS 115 Năm chủng nấm men Pichia patoris có chứa pPICK9K-VP28 gen có khả biểu protein mục tiêu VP28 dạng ngoại bào điều kiện cảm ứng methanol với nồng độ 2% lượng protein tổng số tiết cao sau 72 nuôi cấy 106,9 μg/ml TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Quỳnh Anh, 2006 Báo cáo đề tài: “Dịng hố biểu Gen mã hoá Protein vỏ VP28 VP281 Virus gây hội chứng đốm trắng ( WSSV ) E.coli” Bùi Thị Bích Hằng, 2012 Tạo tái tổ hợp DNA VP28 virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú Tạp chí khoa học 2012:22a 1-7 Trường Đại Học Cần Thơ Cục Thúy Y- Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn, 2012 Báo cáo Hội nghị tổng kết nuôi tơm nước lợ Tình hình dịch bệnh tơm ni năm 2012 triển khai kế hoạch năm 2013 Cục Thú Y - Bộ nông nghiệp phát triển nông thơn, 2013 Báo cáo Tình hình dịch bệnh, dịch tễ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN bệnh đốm trắng (WSD) hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tôm nuôi tháng đầu năm 2013 số đề xuất quản lý rủi ro AHPND Tài liệu phục vụ Hội nghị Bạc Liêu – 6/8/2013 Tài liệu tiếng Anh Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., 2008 Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus) japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320 Chou, H.Y., Huang, C.Y., Wang, C.H., Chiang, H.C and Lo, C.F, 1995 Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan Diseases of Aquatic Organisms 23(3):p 165-173.Du, H.H., Xu, Z R., Wu, X F., Li, W F., Dai, W., 2006 Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus Aquaculture, 2006 260(1-4), p 39-43 Huang, J., Song, X.L., Yu, J., Yang, C.H., 1994 Baculoviral hypodermal and haematopoietic necrosis-pathology of the shrimp explosive epidermic disease Yellow Sea Fishery Research Institute, Qingdae, P.R China.Jha, R.K., Xu, Z R., Bai, S J., Sun, J Y., Li, W F., Shen, J., 2007 Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris Fish & Shellfish Immunology, 2007 22(4), p 295-307 Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006 The efficacy of recombinant vaccines against white spot syndrome virus in Procambarus clarkii Immunology Letters, 2006 105(1), p 68-76 Mavichak, R K., Hirino, H., Aoki, I., Kiyono, T., Yuki, Y., 2009 Protection of pacific white shrimp, Liptopenaeus vannamei against white spot virus following administration of N-terminus truncated recombinant VP28 protein expressed in Gram positive bacteria, Brevibacillus choshinensis Aquaculture Science 57:83-90 Satoh, J., T Nishizawa, Yoshimizu, M., 2008 “Protection against white spot syndrome virus (WSSV) infection in kuruma shrimp orally vaccinated with WSSV rVP26 and rVP28.” Diseases of Aquatic Organisms 82(2), 89-96 Takahashi Y., Itami T., Kondo M., Maeda M., Fujii R., Tomonaga S., Supamattaya K., Boonyaratpalin S., 1994 Electron microscopy evidence of bacilliform virus infection in Kuruma shrimp (Penaeus Japonicus) Fish Pathol 29:121-125.Venegas, C A., L Nonaka, Mushiake, K., Nishizawa, T., Muroga, K., 2000 “Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV).” Diseases of Aquatic Organisms 42(2), 83-89 Van Hulten M.C., Westenberg M., Goodall S.D., Vlak J.M., 2000 Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp Virology 266, 227-36 Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., Tung, M., Chang, C., Su, M and Kou, G., 1995 Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon Diseases of Aquatic Organisms, 1995 23, 239-242 Witteveldt, J., J M Vlak, van Hulten, M C W., 2004 “Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vác xin.” Fish & Shellfish Immunology 16(5), 571-579 Witteveldt, J., J M Vlak, van Hulten, M C W., 2006 “Increased tolerance of Litopenaeus vannamei to white spot syndrome virus (WSSV) infection after oral application of the viral envelope protein VP28.” Diseases of Aquatic Organisms 70(1-2), 167-170 Wongteerasupaya C., Vicker J.E., Sriurairatana S., Nash G.L., Akarajarmorn A., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W., 1995 A nonoccluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon Disease of Aquatic Organism 21, 69–77 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 87 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN DEVELOP DNA RECOMBINANT VP28 OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN YEAST PICHIA PASTORIS Ngo Thi Ngoc Thuy1, Nguyen Viet Dung2, Dang Thi Tra My1 ABSTRACT White spot syndrome virus (WWSSV) is a popular and devastating virus to Penaeus shrimp-culture industry worldwide The aim of this study is to develope DNA recombinant VP28 of the virus in yeast P pastoris for expressing protein VP28 extracellularly in order to make materials for recombinant protein vaccine/tolerine against WSSV in shrimp DNA fragment content of VP28 was amplified from WSSV and its product was digested by restriction enzyme EcoRI and NotI; then cloned into plasmid pPICK9K to make recombinant vector pPICK9K-VP28 This vector, after that was transformed into Pichia pastoris GS115 to express protein VP28 The screening of 200 yeast clones after transformation was conducted and yeast clones which expressed protein VP28 extracellular were selected for Bradford assay The results indicated that the total extracellular protein containing VP28 increased with fermentation periods of 24, 48 and 72 hours and the highest concentration of total protein reached to 106.9 μg.ml-1 Keywords: Pichia pastoris, protein, VP28 , WSSV Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hiền Ngày nhận bài: 10/02/2014 Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014 Ngày duyệt đăng: 30/3/2014 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research, Research Institute for Aquaculture No Email: thuyngo8@yahoo.com Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No 88 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 ... thực việc dịng hóa biểu gen mã hóa protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tế bào nấm men để làm nguyên liệu cho việc chế tạo vắc xin/tolerine phịng bệnh cho tơm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... tế bào trùng (Du et al., 2006) để dịng hóa gen vỏ virus gây bệnh đốm trắng tôm nuôi Ở Việt Nam, Nguyễn Quỳnh Anh (2006), Bùi Thị Bích Hằng (2012) thành cơng việc dịng hóa gen VP28 virus đốm trắng. .. nấm men có mang pPICK9K -VP28 có khả tiết protein ngoại bào bước khởi đầu cho nghiên cứu vắc xin/tolerine phịng bệnh đốm trắng cho tơm ni Việt Nam V KẾT LUẬN Đoạn gen VP28 virus gây bệnh đốm trắng