(Luận văn thạc sĩ) bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu tam thất hoang (panax stipuleanatush t tsai et k m feng) trồng tại sapa lào cai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUẾ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng) TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HUẾ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatusH.T.Tsai et K.M Feng)TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: PGS.TS ĐỖ THỊ HÀ PGS.TS DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tơi xin gửi lời cám ơn đến tồn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng tạo điều kiện cho làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo trường dìu dắt, giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập suốt năm qua Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tri ân đến PGS.TS Đỗ Thị Hà, PGS.TS Dương Thị Ly Hương, DS Phạm Thị Thúy, người ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến cán nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu, thầy cô Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Tôi xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCN-TB.07C/13-18, 20152017 (Chương trình Tây Bắc) tài trợ kinh phí để tơi thực nội dung nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên giúp hồn thành khóa luận Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu tơi khó tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khố luận thêm hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Huế DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa DĐVN IV Dược điển Việt Nam HCT-116 Dòng tế bào ung thư ruột kết người 116 HepG2 HL-60 Tế bà ung thư gan HepG2 Dòng tế bào ung thư bạch cầu người 60 HPLC-MS/MS Sắc ký lỏng hiệu cao – phổ khối/ phổ khối IC50 Nồng độ ức chế 50% LD50 Liều gây chết 50% NF-κB P Rf RSD SD SKLM Yếu tố nhân kappa B Panax Hệ số di chuyển Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TT Thuốc thử TTH Tam thất hoang DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng Trang Bảng Phân bố loài thuộc chi Panax L Bảng Saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol 20(S)protopanaxatriol Bảng Saponin khung dammaran khác Bảng Saponin dẫn chất ocotillol Bảng Saponin dẫn chất acid oleanolic Bảng Các polyacetylen số loài thuộc chi Panax L Bảng Các hợp chất saponin phân lập từ tam thất hoang 10 Bảng Độ ẩm dược liệu tam thất hoang 27 Bảng Tỷ lệ tro toàn phần dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 10 Tỷ lệ tro không tan acid dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 11 Hàm lượng saponin toàn phần dược liệu tam thất hoang 30 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 13 Ảnh hưởng thời gian phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 14 Ảnh hưởng nồng độ thuốc thử vanillin 33 Bảng 15 Ảnh hưởng nồng độ thuốc thử acid perchloeric 34 Bảng 16 Độ hấp thụ quang dãy dung dịch chuẩn 36 Bảng 17 Kết xác định độ lặp lại phương pháp đo quang 37 Bảng 18 Kết xác định độ phương pháp 38 Bảng 19 Kết định lượng saponin tổng số mẫu tam thất hoang 38 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình Tam thất hoang Hình Saponin dẫn chất acid oleanolic 10 Hình Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatusH.T Tsai etK.M Feng) tươi 16 Hình Vi phẫu 23 Hình Vi phẫu thân 24 Hình Vi phẫu thân rễ 25 Hình Bột 26 Hình Bột thân 26 Hình Bột thân rễ 27 Hình 10 Sắc ký đồ dịch chiết tam thất hoang (B) chất chuẩn stipuleanosid R1(06) stipuleanosid R2 (05) 29 Hình 11 Phổ hấp thụ dung dịch khoảng bước sóng từ 300 – 800nm 31 Hình 12 Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang 32 Hình 13 Đồ thị ảnh hưởng thời gian phản ứng tới mật độ quang 33 Hình 14 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ thuốc thử vanillin 34 Hình 15 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ thuốc thử acid perchloric 35 Hình 16 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn bước sóng 550 nm 36 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Panax 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan dược liệu tam thất hoang 1.2.1 Thực vật học 1.2.2 Thành phần hóa học 10 1.2.3 Tác dụng dược lý công dụng 12 1.3 Tổng quan tiêu chuẩn dược liệu 13 CHƯƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu, hóa chất máy móc, thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Mô tả 17 2.2.2 Vi phẫu 17 2.2.3 Soi bột 17 2.2.4 Độ ẩm 17 2.2.5 Tro toàn phần 17 2.2.6 Tro không tan acid 17 2.2.7 Định tính 18 2.2.8 Định lượng 19 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Đặc điểm vi phẫu bột 22 3.1.1 Đặc điểm vi phẫu 22 3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 25 3.2 Độ ẩm 27 3.3 Tro toàn phần 28 3.4 Tro không tan acid 28 3.5 Định tính 29 3.6 Định lượng 30 3.6.1 Định lượng theo phương pháp cân 30 3.6.2 Định lượng theo phương pháp đo quang 30 3.7 Bàn luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC i PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG ii ĐẶT VẤN ĐỀ Nhắc đến thảo dược, người ta không nhắc đến “Sâm” Ngày nay, thuật ngữ“Sâm” không dùng để nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), mà để gọi chung cho nhiều loài thuộc chi Panax L chúng có tác dụng q tương tự Nhiều lồi chi Sâm (Panax), đặc biệt loài nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng; syn.: P pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.) , thuốc quý, ưa chuộng, tiếng có giá trị cao[14] Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng) ghi nhận tài liệu thuốc sử dụng nhiều thuốc dân gian, đặc biệt dân tộc miền núi Tây Bắc Tuy nhiên, thời điểm này, nước ta giới nghiên cứu loại sâm tản mạn.Tam thất hoang sử dụng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress, kích thích tiêu hóa, an thần [3] lại lồi q có nguy tuyệt chủng cao Việt Nam[15] Ngày nay, nguyên liệu dược liệu bị làm giả làm nhái nhiều nhiều chế phẩm từ dược liệu chất lượng, tam thất hoang ngoại lệ Điều làm ảnh hưởng đến sức khỏe người, gây lòng tin người sử dụng với thuốc chế phẩm từ dược liệu Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu cần thiết Cho đến nay, dược liệu tam thất hoang chưa đưa vào dược điển Việt Nam, dược điển Trung Quốc, Ấn Độ chưa có chuyên luận cho dược liệu Do vậy, thực đề tài : “Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng)trồng Sapa – Lào Cai” với mục tiêu: Xây dựngđược tiêu chuẩn cho dược liệu tam thất hoang trồng Sa Pa– Lào Cai Để đạt mục tiêu đề tài thực nội dung sau: - Phân tích đặc điểm vi học dược liệu - Xây dựng phương pháp định lượng dược liệu - Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với số tiêu chí chung Dược điển Việt Nam IV CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Panax 1.1.1 Đặc điểm thực vật a) Phân loại phân bố: Vị trí phân loại chi PanaxL theo Takhtajan[72]: Giới: Thực vật - Plantae Ngành: Ngọc lan- Magnoliophyta Lớp: Ngọc lan- Magnoliopsida Bộ: Hoa tán Apiales Họ: Ngũ gia bì(nhân sâm) Araliaceae Chi: Sâm Panax L Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học có nghiên cứu loài thuộc chi Panax Theo Flora of China (2007)[81], Trung Quốc chi Panax có loài Theo trang The plant list, chi Panax bao gồm 47 tên khoa học thực vật, có 12 lồi thứ chấp nhận với mức độ tin cậy cao Phân bố 12 loài bảng sau: Bảng Phân bố loài thuộc chi Panax L STT Loài Phân bố Panax bipinnatifidus Seem Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, tìm thấy Việt Nam Panax ginseng C.A.Mey Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc Trung Quốc Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Nhật Bản, Hàn Quốc Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen Miền nam Trung Quốc số nơi Việt Nam Panax pseudoginseng Wall Nê-pan Panax quinquefolius L Canada, Mỹ học TTH phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao, chúng tơi chọn acid oleanolic làm chất chuẩn định lượng saponin tổng phương pháp đo quang.Dựa tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát cực đại hấp thụ điều kiện làm phản ứng đo quang mục 3.6.2.Quy trình đề xuất đề tài có ưu điểm đơn giản, dụng cụ, hóa chất rẻ tiền, an tồn vàcó thể áp dụng cho mẫu có hàm lượng saponin thấp Đồng thời dễ áp dụng phịng thí nghiệm phân tích tiêu chuẩn Tuy nhiên, q trình thao tác thí nghiệm địi hỏi điều kiện phản ứng xác thời gian nhiệt độ để tránh mắc sai số lớn Mặt khác,quá trình tiến hành phản ứng đo quang diễn nhiệt độ thay đổi (ủ 70ºC sau làm lạnh nước đá để dừng phản ứng tránh bay dung mơi) nên kết đo quang khó ổn định Thí nghiệm u cầu hóa chất có độ tinh khiết cao 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đề tài phân tích đặc điểm vi học TTH bao gồm vi phẫu soi bột với đặc điểm đặc trưng - Lần khảo sát, xây dựng thẩm định quy trình định lượng saponin tổng phương pháp đo quang tính theo acid oleanolic - Đây nghiên cứu bước đầu góp phần bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn sở cho dược liệu TTH DĐVN tương lai Trên sở kết đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn sở cho dược liệu tam thất hoang (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm:khơng q 10,0%; tro tồn phần:khơng q 9,0%; tro khơng tan acid: không 2,0%; định lượng: saponin tổng theo phương pháp cân khơng thấp 3,0% tính theo dược liệu khơ kiệt theo phương pháp đo quang tính theo acid oleanolic khơng thấp 8,0% tính theo dược liệu khơ kiệt Kiến nghị - Do thời gian có hạn, đề tàimới xây dựng tiêu chuẩn sở với mẫu trồng Lào Cai Do đó, cần tiến hành nghiên cứu cỡmẫu nhiều để việc kết luận tiêu mang tính đại diện cho dược liệu TTH - Đề xuất xây dựng tiêu định lượng thành phần chính, đặc trưng dược liệu TTH phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao góp phần kiểm sốt tốt chất lượng TTH sản phẩm liên quan đến dược liệu tương lai - Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất dược liệu, tỉ lệ vụn nát xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu TTH - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu tam thất hoang để bổ sung chuyên luận dược liệu TTH Dược điển Việt Nam 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tr 20-21 Trần Tử An Thái Nguyễn Hùng Thu ( 2006), Hố phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.46-47 Võ Văn Chi (2012), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Hà Nội, tr.770 Nguyễn Thượng Dong (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật Dược điển Việt Nam (2010), Tập IV Trần Thanh Hà cộng (2015), "thành phần hóa học cặn chiết ethyl acetat sâm vũ diệp", Tạp chí Dược liệu 2, tr 86 Nguyễn Thị Thu Hương Bùi Thị Kim Cúc (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu Đông dược Việt Nam, Tác dụng bảo vệ gan sâm Việt Nam tổn thương gan thực nghiệm ethanol, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.288-295 Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam đinh lăng trí nhớ", Tạp chí Dược liệu 10(6), tr 196-200 Nguyễn Thị Thu Hương Trần Mỹ Tiên (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress chống trầm cảm sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv Araliaceae) hoạt chất majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu 6(1), tr 2527 10 Nguyễn Thị Thu Hương và cộng (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch sâm Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.464-466 11 Trần Cơng Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học tác dụng dược lý từ thân rễ rễ củ hai loài sâm Panax bipinnatifidus Seem Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng 12 Trần Cơng Luận (2003), "Kết nghiên cứu hóa học sâm Việt Nam", Hội thảo bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh tỉnh Quảng Nam, tr 62-75 13 Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên Nguyễn Tập (2009), " Nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất 42 hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược liệu 14(1), tr 17-23 14 Lã Đình Mỡi cộng (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)-nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr 1152-1158 15 Nguyễn Tập (2006), "Danh mục đỏ thuốc Việt Nam", Tạp chí Dược liệu 11(3), tr 97-105 16 Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền Lê Thanh Sơn (2006), "Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp Tam thất hoang Việt Nam", Tạp chí dược liệu tập 5, tr 177-180 17 Nguyễn Viết Thân (2010), Thực tập dược liệu, Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội 18 Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam trí nhớ", Tạp chí Dược liệu 11(5), tr 202-206 19 Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu 10(1), tr 27-32 20 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010 ), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học sinh học, NXB Khoa học Kỹ Thuật Tiếng Anh 21 Mucalo I and et al (2012), "Effect of American ginseng (Panax quinquefoliusL.) on glycemic control in type diabetes", Coll Antropol 36(4), pp 1435-40 22 Bing Hui L and et al (2010), "Antioxidants potentiate American ginsenginduced killing of colorectal cancer cells", Cancer Letters 289(1), pp 62-70 23 Chang Hwa J and et al (2005), "Effects of wild ginseng (Panax ginseng C.A Meyer) leaves on lipid peroxidation levels and antioxidant enzyme activities in streptozotocin diabetic rats", Journal of Ethnopharmacology 98(3), pp 245250 24 Chih Fu L and et al (2003), "Protection by hot water extract of Panax notoginseng on chronic ethanol-induced hepatotoxicity", Phytotherapy Research 17(9), pp 1119–1122 43 25 Chun L and et al (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells", Bull Korean Chem Soc 32, pp 3513-3518 26 Chun L and et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20(23), pp 7110-7115 27 Chun L and et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of Ginseng Research 37(1), pp 74-79 28 David L Z and David D K (2002), "Peripheral blood mononuclear cell production of TNF- in response to North American ginseng stimulation", Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 80(10), pp 1030-1033 29 Enrico De A and et al (2007), "Study of the efficacy of Korean Red Ginseng in the treatment of erectile dysfunction", Asian Journal of Andrology 9(2), pp 241-244 30 Eun Ah B., Ji Eun Shin and Dong Hyun Kim (2005), "Metabolism of ginsenoside Re by human intestinal microflora and its estrogenic effect", Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(10), pp 1903-1908 31 Fahim M S and et al (1982), "Effect of Panax ginseng on testosterone level and prostate in male rats", Journal of Reproductive Systems 8(4), pp 261-263 32 Feng Q., Yi Ping Ye and Hong Xiang Sun (2006), "Haemolytic activity and adjuvant effect of notoginsenoside K from the roots of Panax notoginseng", Chemistry & Biodiversity 3(10), pp 1144–1152 33 Fujimoto Y and et al (1994), "Polyacetylenes from Panax quinquefolium", Phytochemistry 35(5), pp 1255-1257 34 Fukuyama N., Shibuya M and Orihara Y (2012), "Antimicrobial polyacetylenes from Panax ginseng hairy root culture", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 60(3), pp 377-380 35 Hae Ung L and et al (2005), "Hepatoprotective effect of 20(S)-ginsenosides Rg3 and its metabolite 20(S)-ginsenoside Rh2 on tert-butyl hydroperoxideinduced liver injury", Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(10), pp 1992-1994 36 Hae Ung L and et al (2005), "Hepatoprotective effect of ginsenoside Rb1 and compound K on tert-butyl hydroperoxide-induced liver injury", Liver International 25(5), pp 1069-1073 44 37 Hasegawa H and et al (1994), "Inhibitory effect of some triterpenoid saponins on glucose transport in tumor cells and its application to in vitro cytotoxic and antiviral activities", Planta Medica 60(3), pp 240-243 38 Hirakura K and et al (1991), "Polyacetylenes from the roots of Panax ginseng", Phytochemistry 30(10), pp 3327-3333 39 Hiroshi W and et al (1991), "Effect of Panax ginseng on age-related changes in the spontaneous motor activity and dopaminergic nervous system in the rat", The Japanese Journal of Pharmacology 55(1), pp 51-56 40 Hyo Jin A and et al (2006), "The effect of Panax ginseng on forced immobility time & immune function in mice", Indian Journal of Medical Research 124(2), pp 199-206 41 Jian Hua S., Song Hua H and Xiao Ming S (2007), "Adjuvant effects of protopanaxadiol and protopanaxatriol saponins from ginseng roots on the immune responses to ovalbumin in mice", Vaccine 25(6), pp 1114-1120 42 Jian Bo W and et al (2006), "Simultaneous determination of 11 saponins in Panax notoginseng using HPLC-ELSD and pressurized liquid extraction", Journal of Separation Science 29(14), pp 2190–2196 43 Jiang K Y and Qian Z N (1995), "Effects of Panax notoginseng saponins on posthypoxic cell damage of neurons in vitro", Acta Pharmacologica Sinica 16(5), pp 399-402 44 Jing Tian X., Sangeeta M and Chun Su Y (2005), "Ginseng and diabetes", Am J Chin Med 33(3), pp 397-404 45 Kazuo Y (2000), "Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Pharmaceutical Biology 38(1), pp 16-24 46 Khaled R and et al (2006), "Use of ginseng in medicine with emphasis on neurodegenerative disorders", Journal of Pharmacological Sciences 100(3), pp 175-186 47 Kim H J and et al (1997), "Protection of rat liver microsomes against carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation by red ginseng saponin through cytochrome P450 inhibition", Planta Medica 63(5), pp 415-418 48 Kouichi Y and et al (2012), "New triterpenoid saponins from fruit specimens of Panax japonicus collected in Toyama prefecture and Hokkaido", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 60(6), pp 728-735 49 Kun Z and et al (2002), "Dammarane-type triterpene saponins from Panax japonicus", J Nat Prod 65(3), pp 346–351 45 50 Kyung Tack K and et al (2007), "Protective effect of steamed American ginseng (Panax quinquefolius L.) on V79-4 cells induced by oxidative stress", Journal of Ethnopharmacology 111(3), pp 443–450 51 Lam S K and Ng T B (2002), "A xylanase from roots of sanchi ginseng (Panax notoginseng) with inhibitory effects on human immunodeficiency virus1 reverse transcriptase", Life Sciences 70(25), pp 3049–3058 52 Lutomski J., Luan T.C and Hoa T.T (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family Part IV", Herba Polonica 38(3), pp 137-140 53 Masayuki Y and et al (2003), "Structures of new dammarane-type triterpene saponins from the flower buds of Panax notoginseng and hepatoprotective effects of principal ginseng saponins", J Nat Prod 66(7), pp 922-927 54 Masayuki Y and et al (2003), "Structures of new dammarane-type triterpene saponins from the flower buds of Panax notoginseng and hepatoprotective effects of principal ginseng saponins", J Nat Prod 66(7), pp 922-927 55 Masayuki Y and et al (1997), "Bioactive saponins and glycosides VIII notoginseng (1) : new dammarane-type triterpene oligoglycosides, notoginsenosides-A, -B, -C, and -D, from the dried root of Panax notoginseng (BURK.) F H CHEN", Chemical & pharmaceutical bulletin 45(6), pp 10391045 56 Minh Duc Nguyen and et al (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv collected in Central Vietnam II", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 42(1), pp 115-122 57 Mun Chual R and et al (2005), "Polyacetylenic compounds, ACAT inhibitors from the roots of Panax ginseng", Jounal of Agricultural and Food Chemistry 53(4), pp 919-922 58 Nguyen Thi Thu Huong and et al (1996), "Efects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and gastric lesion in psychologically stressed mice", Pharmacology Biochemistry anh Behavior 53, pp 957-963 59 Nobuyuki O and et al (1994), "Protective effect of ginseng saponins against impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol", Biological and Pharmaceutical Bulletin 17(2), pp 270-274 60 Noriko F., Hiroyuki T and Yukihiro S (2000), "Isolation of the pharmacologically active saponin ginsenoside Rb1 from ginseng by immunoaffinity column chromatography", J Nat Prod 63(2), pp 283–285 46 61 Omar M E A S., Somaia A N and Mahmoud S A (2002), "The effect of ginseng on bile-pancreatic secretion in the rat increase in proteins and inhibition of total lipids and cholesterol secretion", Pharmacological Research 45(4), pp 349–353 62 Qi Zhen D and et al (2003), "Isolation of dammarane saponins from Panax notoginseng by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A 1008(2), pp 173-180 63 Robbie Y K C and et al (2002), "Estrogen-like activity of ginsenoside Rg1 derived from Panax notoginseng", Indocrinol Metab 87(8), pp 3691-3695 64 Rosemary B D and et al (2001), "American ginseng transcriptionally activates p21 mRNA in breast cancer cell lines ", J Korean Med Sci 16, pp Suppl: S5460 65 Sakata T and et al (1987), "Central effects of ginsenosides on the feeding behavior and response to stress in rats", Korea-Japan Panax Ginseng Symposium 9, pp 20-28 66 Sang Jin C and et al (2008), "Effects of a polyacetylene from Panax ginseng on Na+ currents in rat dorsal root ganglion neurons", Brain Research 1191, pp 75-83 67 Sang Chul S., Hun Yeoung K and Byung Hoon H (1983), "Polyacetylenes from Panax ginseng roots", Phytochemistry 22(8), pp 1817-1818 68 Seemann B (1868), "On the genus Panax.", Journal of Botany (Moral) 6, pp 52–58 69 Shibata S (2001), "Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds", J.Korean Med Sci 16(suppl), pp 28-37 70 Shoji Y., Ryoji K and Osamu T (1977), "New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A MEYER (1) chikusetsusaponins-L5, -L9a and -L10", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 25(8), pp 2041-2047 71 Takao K and et al (1999), "Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Cancer Letters 147(1-2), pp 11-16 72 Takhtajan Armen L (1980), "Outline of the classification of flowering plants (magnoliophyta)", The Botanical Review 46(3), pp 225-359 47 73 Thi Hong Van Le and et al (2014), "Processed Vietnamese ginseng: Preliminary results in chemistry and biological activity", Journal of ginseng research 38(2), pp 154–159 74 Tran Q.L and et al (2002), "Hepatoprotective effect of majonoside R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)", Planta Medica 68(5), pp 402-406 75 Un Ho J and et al (2007), "Inhibitory effect of Panax notoginseng on nitric oxide synthase, cyclo-oxygenase-2 and neutrophil functions", Phytotherapy Research 21(2), pp 142–148 76 Voces J and et al (2004), "Ginseng administration protects skeletal muscle from oxidative stress induced by acute exercise in rats", Brazilian Journal of Medical and Biological Research 37(12), pp 1863-1871 77 Wang C Z and et al (2006), "Phytochemical and analytical studies of Panax notoginseng (Burk.) FH Chen", Journal of Natural Medicines 60(2), pp 97106 78 Wen Kui L and John F F (2001), "Determination of 24(R)-pseudoginsenoside F11 in North American ginseng using high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 25(2), pp 257–265 79 Wen Zhi Y and et al (2014), "Saponins in the genus Panax L (Araliaceae): A 80 81 82 83 systematic review of their chemical diversity", 106, pp 7-24 Wolf Dieter R and et al (2006), "Neuroprotective effects of ginsenosides", Acta Neurobiol Exp 66(4), pp 369-375 Raven P H Wu Z Y., Hong D Y (2007), Flora of China, Science Pressand, Beijing Missouri Botanical Garden Press,, St Louis, pp 489 - 491 Xi Sheng X and et al (2009), "Ginsenoside Rg1, a major active component isolated from Panax notoginseng, restrains tubular epithelial to myofibroblast transition in vitro", Journal of Ethnopharmacology 122(1), pp 35-41 Yang Chong R and et al (1985), "Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica 7, pp 103-106 84 Young Ho K., Ki Hyun P and Hyune Mo R (1996), "Transcriptional activation of the Cu,Zn-superoxide dismutase gene through the AP2 site by ginsenoside Rb2 extracted from a medicinal plant, Panax ginseng", The Journal of Biological Chemistry 271, pp 24539-24543 48 85 Zhao R and McDaniel W F (1998), "Ginseng improves strategic learning by normal and brain‐damaged rats", 7, pp 1619-1624 86 Zou K., Zhu S and Katsuko K (2002), "Analysis of saponins of Panax stipuleanatus by using HPLC and APIMS/MS techniques", J Chin Three Gorges Univ 24, pp 355-358 87 Cheok Choon Y., Salman Hanaa Abdel K and Sulaiman R (2014), "Extraction and quantification of saponins: A review", Food Research International 59, pp 16-40 88 Zhongbo W (2007), "Determination of Oleanolic Acid Saponin in Panax japonicus CA Mey with Spectrophotometry", Journal of Anhui Agricultural Sciences 35(26), pp 8094 49 PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC i PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG Tam thất hoang (thân rễ) Dược liệu thân rễ phơi hay sấy khô tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng), họ Nhân sâm (Araliaceae) Mô tả: Thân rễ nằm ngang, có hình dạng thn dài, nhiều đốt nhiều vết lõm, phân nhánh, dài 5-10 cm, đường kính 1,5-3,0 cm Mặt ngồi màu nâu xám nhạt, nhiều rễ nhỏ, dài, mọc thành dải Chất tương đối cứng giòn, dễ bẻ, mặt bẻ phẳng, màu vàng nâu, màu đậm Mùi thơm hắc, vị đắng Vi phẫu: Lớp bầngồm 3-5 hàng tế bào hình chữ nhật, xếp xuyên tâm, bong tróc nhiều Mơ mềm vỏ gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, rải rác có ống tiết chất nhựa tinh thể calci oxalat hình cầu gai Libe-gỗ hình thoi xếp đặn, cách tia tủy rộng Tầng phát sinh libe-gỗ thành vòng liên tục Mơ mềm ruột gồm nhiều tế bào có kích thước lớn, chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác có ống tiết ly bào Bột: Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm hắc, vị đắng Mảnh bần tế bào hình chữ nhật, thành dày, màu xám Mảnh mô mềm gồm tế bào hình đa giác, thành mỏng, mang nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai có kích thước 20-25 μm Các mảnh mạch gồm mạch mạng, mạch vạch, thường thấy mạch mạng Hạt tinh bột đứng đơn lẻ tập trung thành đám, hình trịn có rốn rõ, kích thước 3-5 µm Định tính: A Lấy g bột dược liệu, thêm 15 ml ethanol 70% (TT) đun cách thủy 10 phút, lọc Lấy khoảng ml dịch lọc pha loãng với nước cất thành 10 ml Lắc mạnh 15 giây, có bọt bền B Phương pháp sắc ký lớp mỏng ii Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển: hệ dung môi n- butanol : acid acetic : nước (4:5:1), lấy lớp Dung dịch thử: Lấy 1g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol (TT), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu: hòa mg loại stipuleanosid R1 stipuleanosid R2 ml methanol (TT) Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký khoảng 8-10 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy 120ºC xuất rõ vết Các vết sắc ký đồ dung dịch thử phải có màu sắc giá trị Rf giống vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Độ ẩm: Không 10,0% Tro tồn phần: Khơng q 9,0% Tro khơng tan acid: Không 2,0% Định lượng: saponin tổng A Định lượng theo phương pháp cân: Cân xác 10 g bột dược liệu rây qua rây số 335 (đã đươc đo độ ẩm) chiết Soxhlet với khoảng 100 ml n-hexan (TT) để loại chất béo (khoảng giờ), lấy bã bay hết n-hexan Sau chiết 100 ml methanol (TT) Cất thu hồi dung môi áp suất giảm thu cắn Hòa tan cắn 20 ml nước cất lắc với nbutanol bão hòa nước (TT) đến lớp n-butanol nhạt màu Gộp dịch n-butanol, rửa lần nước cất Cất thu hồi dung mơi áp suất giảm đến cắn, hịa tan cắn ml ethanol 80% chuyển vào cốc xác định khối lượng trước Bốc cách thủy cắn Sấy khô cắn 105ºC Cân cắn Tính hàm lượng saponin tổng theo cơng thức: Trong đó: X hàm lượng saponin tổng dược liệu (%); Mc khối lượng cao thu (g); iii Mt khối lượng mẫu thử (g); A hàm ẩm dược liệu (%) Hàm lượng saponin tổng khơng 3,0% tính theo dược liệu khơ kiệt B Định lượng theo phương pháp đo quang: Cân xác khoảng 5,0 g bột dược liệu, chiết hồi lưu với ethanol 50% (tỉ lệ dung môi : dược liệu = 10 : 1) 70ºC lần, lần 0,5 Lọc, gộp dịch chiết loại dung mơi áp suất giảm thu cắn tồn phần Cân xác khoảng 5,0 mg cắn pha ethanol tuyệt đối (TT) vừa đủ 10 ml thu dung dịch thử có nồng độ 0,5 mg/ml Lấy xác ml dung dịch thử cho vào cốc có mỏ, bốc đến cắn Thêm 0,6 ml dung dịch vanilin/ acid acetic băng (50 mg/ml) (TT) 1,2 ml acid perchloric (TT), ủ 70ºC 20 phút Sau làm lạnh nhanh cốc nước đá định mức 10 ml acid acetic băng Tiến hành đo quang bước sóng λ = 550 nm Các tính tốn dựa phương trình đường chuẩn với dãy dung dịch chuẩn acid oleanolic có nồng độ từ µg/ml đến 20 µg/ml làm phản ứng màu dung dịch thử Hàm lượng saponin tổng dược liệu tam thất hoang tính theo acid oleanolic tính theo cơng thức sau: Trong đó: C: nồng độ acid oleanolic dung dịch mẫu thử (g/ml); k: hệ số pha loãng; A: hàm ẩm cao (%); B: Hàm ẩm dược liệu (%); mcao: khối lượng cao chiết (g); mcân: khối lượng cao dùng định lượng (g); mdl: khối lượng dược liệu dùng định lượng (g) Hàm lượng saponin tổng không thấp 8,0% tính theo dược liệu khơ kiệt Bảo quản Để nơi khơ thống, tránh ẩm mốc Tính vị, quy kinh Tam thất hoang có vị ngọt, đắng, tính ấm Quy kinh can, vị Cơng năng, chủ trị iv Tán ứ, định thống Chủ trị: dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress Chế biến Thu hoạch thân rễ vào tháng 9-12, lấy rửa sạch, phơi khô sấy nhiệt độ 60ºC v ... cho dược liệu Do vậy, thực đề t? ?i : ? ?Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Tam th? ?t hoang (Panax stipuleanatus H .T. Tsai et K. M Feng )trồng Sapa – Lào Cai? ?? với m? ??c tiêu: Xây dựng? ?ược tiêu chuẩn. .. NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HUẾ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM TH? ?T HOANG (Panax stipuleanatusH. T. Tsai et K. M Feng)TRỒNG T? ??I SAPA – LÀO CAI KHÓA LUẬN T? ? ?T NGHIỆP... kiểu nội ti? ?t tố sinh dục, chống đái tháo đường, gi? ?m đau chống vi? ?m [4] 1.2 T? ??ng quan dược liệu tam th? ?t hoang 1.2.1 Thực v? ?t học Tam th? ?t hoang gọi dã tam th? ?t, Tam th? ?t rừng, S? ?m tam th? ?t, Bình