Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (e urophylla x e exserta)

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2017 ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 \ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Việt Cƣờng Hà Nội, 2017 i LỜI CẢM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Việt Cường – Trưởng môn Lai giống sinh học hạt phấn trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, phòng đào tạo sau đại học Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, thầy giáo tồn thể anh chị em đồng nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt chương trình học luận văn Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè đơn vị công tác giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Linh Đam ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………… …….i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU A Ngoài nƣớc 1.1 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn 1.2 Giới thiệu thị SSR số ứng dụng chọn giống 1.2.1 Giới thiệu thị SSR (Simple Sequence Repeat) 1.2.2 Ưu điểm chọn giống thị phân tử 1.2.3 Một số ứng dụng thị phân tử chọn giống B Trong nƣớc 15 1.3 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn Việt Nam 15 1.4 Ứng dụng thị phân tử chọn giống Việt Nam 17 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu 20 2.2 Nội dung 20 2.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.3.1 Vật liệu sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình 20 2.3.2 Vật liệu sử dụng để phân tích liên quan cặp mồi SSR với tính trạng sinh trưởng bạch đàn lai 21 2.3.3 Các cặp mồi SSR sử dụng nghiên cứu 24 2.4 Hóa chất thiết bị 24 iii 2.4.1 Hóa chất 24 2.4.2 Thiết bị 25 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu 25 2.5.2.Phương pháp đo nồng độ quang phổ kế 26 2.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 26 2.5.4 Phương pháp điện di gel agarose 1% 27 2.5.5 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 5% 27 2.5.6 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 29 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Thu thập thơng tin trình tự từ mồi SSR có liên quan đến lồi bạch đàn 32 3.2 Sàng lọc cặp mồi SSR để tìm cặp mồi SSR đa hình 34 3.2.1 Tách chiết ADN tổng số điện di kiểm tra 34 3.2.2 Xác định điều kiện PCR tối ưu cho việc nhân đoạn SSR 36 3.2.3 Kết phân tích đa hình điện di gel polyacrylamide 38 3.3 Xác định cặp mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh .47 3.4 Kiểm chứng thị có liên quan đến tính trạng sinh trưởng 53 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị 59 PHỤ LỤC 67 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Bảng Hình 3.1 Kết q Hình 3.2 Kết q Hình 3.3 Kết q Hình 3.4 Mức đ Hình 3.5 Kết q EMB Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Kết q Kết q polya Kết q g vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 2.2 Nội dun Danh mục 22 mẫu sử dụng để Các dòng bạch đàn lai sinh trưởng n Bình Dương (2002-2012) 2.3 Các dịng bạch đàn lai sử dụng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 3.1 Kết đo OD mẫu ADN tổng 3.2 3.3 3.4 Nhiệt độ bắt cặp 205 cặp mồi E nghiên cứu (chi tiết phụ lục Số alen hệ số PIC 106 cặp m 53 thị SSR có độ đa hình cao đư SSR liên kết với sinh trưởng nhanh 3.5 Các kiểu gen 104 phân 3.6 Kết điện di cặp mồi liên qu 3.7 Tương quan cặp mồi EMBR 3.8 3.9 Các dòng bạch đàn lai thể trường khảo nghiệm Bầu Bàng Bình Sự liên kết thị SSR với ĐẶT VẤN ĐỀ Cải thiện sinh trưởng (năng suất) rừng mục tiêu chọn giống quan trọng nhiều chương trình nghiên cứu lâm nghiệp, nhiên suất có hệ số di truyền thấp Năng suất tính trạng số lượng phức tạp thể qua thông số đường kính chiều cao, tổng hợp nhiều tính trạng khác nhau, ảnh hưởng lớn yếu tố môi trường Sự khác biệt suất phân li hai gen mà phân li nhiều gen, với ảnh hưởng gen nhỏ Tính trạng số lượng khơng phân li thành nhóm cụ thể, ta khơng thể đơn giản sử dụng nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu Các nghiên cứu chọn giống trồng lâm nghiệp nước quốc tế có trợ giúp cơng nghệ sinh học có thành công định, nghiên cứu ứng dụng thị phân tử chọn giống bạch đàn (E globulus, E nitens) Bundock cộng 2008; Freeman cộng 2009 cho thấy thị SSRs, RAPDs có tương quan đến sinh trưởng đường kính với mức đóng góp biến dị kiểu hình từ 3,8 đến 17,9%, tác giả số tính trạng chất lượng mật độ gỗ, hàm lượng xenlulơ, lignin đóng góp cho mức biến dị từ 5,6 - 12,3% [20] [28] Theo Brondani cộng sự, (2006) đồ liên kết cho lồi E grandis, số 172 thị có 153 (89%) thị giữ nguyên vị trí đồ chung cho Eucalyptus Trong đồ liên kết cho lồi E urophylla có 140 152 (92%) thị giữ nguyên vị trí đồ chung [19] Anand Raj Kumar Kullan cộng (2012) nghiên cứu di truyền tính trạng tăng trưởng, tỷ trọng gỗ biểu gen hai gia đình lai trở lại lồi Bạch đàn urơ Bạch đàn grandis xác định QTL đường kính thân 12 QTL cho tỷ trọng gỗ Các QTLs cho đường kính tỷ trọng gỗ cho thấy mức đóng góp biến đổi kiểu hình 3,1 - 54 EMBRA89 55 EMBRA92 56 EMBRA97 57 EMBRA99 58 EMBRA100 59 EMBRA101 60 EMBRA102 88 61 EMBRA104 62 EMBRA105 63 EMBRA107 64 EMBRA111 65 EMBRA113 66 EMBRA114 70 EMBRA120 71 EMBRA124 72 EMBRA125 73 EMBRA126 74 EMBRA127 75 EMBRA129 76 EMBRA131 77 EMBRA132 78 EMBRA133 79 EMBRA135 80 EMBRA136 81 EMBRA137 82 EMBRA138 83 EMBRA139 84 EMBRA140 89 85 EMBRA142 86 EMBRA143 87 EMBRA146 88 EMBRA147 89 EMBRA148 90 EMBRA149 91 EMBRA150 92 EMBRA151 93 EMBRA152 94 EMBRA153 95 EMBRA154 96 EMBRA155 97 EMBRA156 98 EMBRA157 99 EMBRA160 100 EMBRA162 101 EMBRA165 102 EMBRA166 103 EMBRA167 104 EMBRA168 105 EMBRA169 90 106 EMBRA170 107 EMBRA171 108 EMBRA173 109 EMBRA175 110 EMBRA176 111 EMBRA177 112 EMBRA179 113 EMBRA180 114 EMBRA182 115 EMBRA185 116 EMBRA186 117 EMBRA188 118 EMBRA189 119 EMBRA190 120 EMBRA191 121 EMBRA192 122 EMBRA193 123 EMBRA194 124 EMBRA196 125 EMBRA197 126 EMBRA198 91 127 EMBRA199 129 EMBRA203 130 EMBRA204 131 EMBRA205 132 EMBRA206 133 EMBRA207 134 EMBRA208 135 EMBRA209 136 EMBRA210 137 EMBRA213 139 EMBRA214 141 EMBRA217 142 EMBRA218 143 EMBRA219 144 EMBRA223 145 EMBRA224 146 EMBRA225 147 EMBRA227 148 EMBRA229 149 EMBRA230 150 EMBRA232 92 151 EMBRA233 152 EMBRA237 153 EMBRA238 155 EMBRA241 156 EMBRA236 157 EMBRA257 158 EMBRA258 159 EMBRA263 160 EMBRA269 161 EMBRA277 162 EMBRA278 163 EMBRA288 164 EMBRA290 165 EMBRA291 166 EMBRA292 167 EMBRA296 168 EMBRA298 169 EMBRA303 170 EMBRA304 171 EMBRA313 172 EMBRA318 93 173 EMBRA321 174 EMBRA324 176 EMBRA332 177 EMBRA333 178 EMBRA337 180 EMBRA341 183 EMBRA351 184 EMBRA352 185 EMBRA356 186 EMBRA358 187 EMBRA359 188 EMBRA360 189 EMBRA361 190 EMBRA362 191 EMBRA363 192 EMBRA364 195 EMBRA369 197 EMBRA372 198 EMBRA374 199 EMBRA375 200 EMBRA377 94 201 EMBRA378 202 EMBRA379 203 EMBRA382 204 EMBRA385 205 EMBRA386 95 Phụ lục 03 : Sinh trƣởng dòng bạch đàn lai Bầu Bàng Bình Dƣơng (8/2002 - 8/2006) C«ng D TT thøc UE3 UC1 PN2 UE27 UC90 UE33 UE24 U6 UU9 10 UE30 11 UE85 12 PN14 13 UE26 14 UE86 15 UE59 16 UE73 17 UU15 18 UC77 19 UC2 20 UE31 21 UE25 22 UE35 23 UE23 24 UE34 Xtb 25 UU16 26 UE5 27 UE84 28 UU11 29 UC80 30 UU8 31 GU 94 96 32 UC78 33 GU 92 34 UE4 35 UC81 36 UC18 Fpr LSD 97 Phụ lục 04: Sinh trƣởng dòng bạch đàn lai Bình Dƣơng (2002 - /2006) C«ng STT thøc UE3 UE33 UE27 UC80 UE24 UC1 PN2 PN14 UE59 10 UC90 11 UE26 12 U6 13 UE30 14 UU15 15 UE85 16 UU8 17 UE35 18 UC77 19 UE86 20 UC2 21 UU16 22 UE34 23 UU9 24 UE31 25 UE73 26 UE4 27 UE84 28 UE23 98 29 GU 94 30 UE5 31 GU 92 32 UU11 33 UC78 34 UC18 35 UE25 36 UC81 LSD Fpr ... SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành:... 1.1 Những nghiên cứu chọn giống bạch đàn 1.2 Giới thiệu thị SSR số ứng dụng chọn giống 1.2.1 Giới thiệu thị SSR (Simple Sequence Repeat) 1.2.2 Ưu điểm chọn giống thị phân tử ... 204 lai từ cặp bố mẹ Bạch đàn urơ với lồi Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn saligna Bạch đàn pellita Trong số cá thể lai từ tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn