Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CỦ ĐẬU VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS.NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện: HUỲNH KIM KHÁNH MSSV: 1211100258 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực chưa tác giả khác công bố nghiên, đồ án Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc hoàn thành luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn đồ ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu đồ án TP.HCM, ngày tháng Sinh viên LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn từ cá nhân tập thể Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Hương, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phịng thí nghiệm Trường Đại học Cơng nghệ TP HCM tạo điều kiện sở vật chất tốt cho tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ bạn nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài hoàn thành luận văn TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Huỳnh Kim Khánh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan củ đậu 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 1.1.3 Tình hình trồng trọt, tiêu thụ kỹ thuật canh tác củ đậu Việt Nam… 16 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tính vị công dụng 1.2 Hợp chất Phenol, Flavonoid Rotenone 1.2.1 Phenol 1.2.2 Flavonoid 1.2.3 Rotenone 1.3 Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp tron 1.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 1.3.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng 1.4 Phương pháp đánh giá độc tính xác định giá trị 1.5 Phương pháp xác định khả đối kháng với vi s ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.Sinh vật thí nghiệm 1.6.1 Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 1.6.2 Các chủng vi sinh vật thí nghiệm CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2.Vật liệu nghiên cứu 2.3.Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 2.3.1 Dụng cụ 2.3.2 Hóa chất 2.4.Phương pháp 2.5.Nội dung thí nghiệm 2.5.1 Phương pháp tách chiết thu cao chiết 2.5.2 Phương pháp định tính số hợp chất thứ cấp củ đậu…… 2.5.3 Phương pháp định lượng số hợp chất thứ cấp củ đậu 63 2.5.4 Phương pháp đánh giá độc tính 2.5.5 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Thu nhận cao chiết từ củ đậu c khác 3.2.Định tính số hợp chất thứ cấp tron 3.2.1 Định tính f 3.2.2 Định tính r ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3 Định lượng số hợp chất thứ cấp chất khô loại cao chiết 76 3.3.1 Hàm lượng chất khô 76 3.3.2 Định lượng polyphenol tổng số 76 3.3.3 Định lượng Flavonoid tổng số 80 3.4 Khảo sát độc tính 84 3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 86 3.5.1 Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli loại cao chiết .86 3.5.2 Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes loại cao chiết 88 3.5.3 Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa loại cao chiết 89 3.5.4 Khơng có hoạt tính kháng số vi sinh vật loại cao chiết 90 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic BVTV: Bảo vệ thực vật db: vật liệu ĐC: Đối chứng DMSO: Dimethyl sulfoxide LC50: Lethal concentration NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth NĐ: Nồng độ OD: Optical density HTHC: Hợp chất thứ cấp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Hiệu tác động Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) ruồi giấm Bảng Phân tích ngu Bảng Bố trí thí nghi Bảng Kết định tính số hợp chất thứ cấp cao chiết củ đậu 75 Bảng Kết hàm lượng chất khô loại cao chiết Bảng 3 Kết đường chuẩn Acid Gallic Bảng Kết hàm lượng polyphenol tổng loại cao chiết củ đậu Bảng Bảng kết đường chuẩn Rutin Bảng Bảng kết Bảng Kết đư Bảng Nồng độ LC50 Bảng Bảng 10 Kết q Bảng 11 Kết q Bảng 12 Kết q Kết kháng ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Nội dung thí nghiệm 58 Sơ đồ 2 Quá trình tách chiết thu cao chiết từ củ đậu 59 Sơ đồ Quy trình định lượng polyphenol tổng 65 Sơ đồ Quy trình đánh giả khả kháng khuẩn cao chiết củ đậu .69 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cây củ đậu 14 Hình Thương lái thu mua củ đậu đồng ruộng 17 Hình Cây củ đậu trồng theo luống 19 Hình Củ đậu đến thời gian thu hoạch 20 Hình Tephrosin 21 Hình Rotenone 21 Hình Củ đậu tốt cho sức khỏe 22 Hình Một số ăn chế biến từ củ đậu 22 Hình Một số hợp chất phenol 24 Hình 10 Một số Eucoflavonoid 25 Hình 11 Cơng thức cấu tạo cấu trúc 3D rotenone 31 Hình 12 Chuỗi truyền điện tử chế tác động rotenone ty thể 32 Hình 13 Rotenone ngăn cản truyền điện tử đến CoQ 32 Hình 14 Chiết lớp chất lỏng 34 Hình 15 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 35 Hình 16 Bộ chiết Soxhlet 37 Hình 17 Máy chiết Kumagawa 38 Hình 18 Bộ lôi nước 38 Hình 19 Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 39 Hình 20 Cột chiết pha rắn 40 Hình 21 Ấu trùng trứng Artemia Nauplii 48 Hình 22 Vi khuẩn Salmonella 50 Hình 23 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 51 Hình 24 Listeria monocytogenes 52 Hình 25 Vi khuẩn Escherichia coli 53 Hình 26 Pseudomonas aeruginosa 54 Hình Lá củ đậu 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết C Nồng độ cao chiết % Giá trị pronit Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết %chết Log10[NĐ] Probit -3.6 Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 8,8299)/1,0237 = - 3,74  LC50 = 0,02% ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết D Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết %chết Log10[NĐ] Probit Giá trịProbit Đường chuẩn -3.5 log10(NĐ) Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 11,154)/1.9234 = -3,2  LC50 = 0,06% ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Bảng giá trị Probit ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kháng khuẩn 3.1 Môi trường  NB - 1,5g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - g pepton - g NaCl - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2  NA - 1,5 g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - g pepton - g NaCl - 15 g agar - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2 The SAS System The ANOVA Procedure Class Level Information Class KKETEC Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source Model Error Corrected Total R-Square 0.847384 Source KKETEC The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A B B B B B 3.3 The SAS System ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dependent Variable: Y Source Model Error Corrected Total Source KKLIS The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N KKLIS 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A A A B B B B B C C C C C 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4 Pseudomonas aeruginosa Dependent Variable: Y Source Model Error Corrected Total Source KKPSEU The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B B B B B C 19 ... nghiên cứu củ đậu thành phần độc tính có giá trị Do vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ củ đậu thử nghiệm độc tính mơ hình in vitro” thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho nghiên. .. MỤC HÌNH Hình 1 Cây củ đậu 14 Hình Thương lái thu mua củ đậu đồng ruộng 17 Hình Cây củ đậu trồng theo luống 19 Hình Củ đậu đến thời gian thu hoạch 20 Hình Tephrosin... bình) cao chiết củ đậu, đánh giá khả kháng khuẩn mơ hình in vitro Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu củ đậu, thành phần hóa học hạt củ đậu, phương pháp