Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -  - Nguyễn Thu Trang THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -  - Nguyễn Thu Trang THIẾT KẾ MẪU NỘI KIỂM ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Thương Lan Hà Nội - 2017 Lời cảm ơn Để hồn thành tốt luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Võ Thị Thương Lan – người trực tiếp hướng dẫn em tiến hành đề tài Cô tận tình bảo giúp đỡ em nhiều suốt trình làm việc học tập thời gian qua Cô không truyền thụ cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu công việc mà cịn khơi gợi, bồi đắp tính cẩn thận, tự giác, đạo đức nghề nghiệp lòng say mê nghiên cứu khoa học em, giúp em vượt qua khó khăn để tự tin, vững bước đường chọn Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Phạm Anh Thùy Dương, chị người bảo, chia sẻ với em nhiều công việc sống, giúp em có thái độ nghiêm túc, chu với việc giao Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Tạ Bích Thuận, người động viên, khích lệ em nhiều suốt thời gian qua, giúp em hồn thành tốt cơng việc Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Ngô Thị Hà, CN Nguyễn Quang Duy bạn phịng thí nghiệm Sinh Y bên cạnh, cổ vũ tinh thần ủng hộ em suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè tin tưởng, ủng hộ động viên, giúp em hoàn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thu Trang DNA RNA gDNA cs IC SHOX2 ACTB CFF dNTPs PCR Real-time PCR RT-PCR Ct UV GMO SNPs DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Bảng 2.1 Trình tự oligo mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện phản ứng tổng hợp đoạn IC 26 UnIC Bảng 2.3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR IC UnIC với 26 cặp mồi Trans-CFF Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR IC sau xử lý bisulfite với cặp 27 mồi Shox-UnCFF Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR gDNA sau xử lý bisulfite với 27 cặp mồi Shox-Me-F/R Bảng 2.6 Thành phần điều kiện phản ứng Real-time PCR khuếch 29 đại mẫu nội kiểm sau xử lý bisulfite Bảng 2.7 Thành phần phản ứng nối IC UnIC vào vector pTZ57 30 Bảng 2.8 Thành phần điều kiện phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc 31 với cặp mồi vector pTZ57 Bảng 2.9 Thành phần điều kiện phản ứng mở vòng plasmid 32 enzyme giới hạn Bảng 3.1 Kết đo nồng độ IC UnIC sau tinh 36 Bảng 3.2 Giá trị ΔCt trung bình mẫu chuẩn 41 Bảng 3.3 Kết khảo sát pUnIC nồng độ khác 42 Bảng 3.4 Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý bisulfite nhóm pIC trộn 44 gDNA mẫu máu Bảng 3.5 Giá trị ΔCt tỷ lệ xử lý bisulfite nhóm pIC trộn gDNA mẫu bệnh phẩm 46 Hình Hình 1.1 Ch Hình 1.2 Hệ Hình 1.3 Th Hình 1.4 Sự Hình 1.5 Tr Hình 1.6 Cá Hình 1.7 Ph Hình 1.8 Ph Hình 2.1 Mơ Hình 2.2 Sơ mồ Hình 2.3 Sơ Hình 2.4 Sơ Hình 3.1 Kế Un Hình 3.2 Kế Un po Hình 3.3 Kế po Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang 37 đoạn chèn IC (giếng 1-7), mang đoạn chèn UnIC (giếng 814) gel agarose 2% Hình 3.5 Kết điện di pIC (giếng 1) pIC (giếng 2) gel 37 agarose 1% Hình 3.6 Kết điện di gel agarose 1% plasmid IC trước 38 (giếng 1) sau cắt (giếng 2) với enyme giới hạn ScaI Giếng 3: plasmid UnIC sau cắt với ScaI Hình 3.7 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR mẫu MT15 39 MT15-XL với cặp mồi Trans-CFF Shox-UnCFF gel polyacrylamide 8% Hình 3.8 Đồ thị so sánh giá trị ΔCt ba nhóm mẫu chuẩn 41 Hình 3.9 Đường chuẩn pUnIC nồng độ khác nhau, từ 0.4 pg 43 đến 200 pg Hình 3.10 Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite ba nhóm pIC phối 45 trộn gDNA mẫu máu Mẫu chuẩn pUnIC sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC xử lý hồn tồn với bisulfite Hình 3.11 Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite ba nhóm pIC 47 phối trộn gDNA mẫu bệnh phẩm Mẫu chuẩn pUnIC sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC xử lý hoàn tồn với bisulfite Hình 3.12 Kết giải trình tự pIC số mẫu sau xử lý bisulfite 48 Hình 3.13 (A) Kết giải trình tự pIC mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng 49 IC (B) Kết giải trình tự vùng promoter gen SHOX2 mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng IC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG 1.1.1 Giới thiệu kỹ thuật PCR 1.1.2 PCR định lượng (Real-time PCR) 1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng 1.2 MẪU NỘI KIỂM 1.2.1 Mẫu nội kiểm DNA 1.2.2 Mẫu nội kiểm RNA 1.3 QUÁ TRÌNH XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE 1.3.1 Giới thiệu phương pháp xử lý DNA với bisulfite 1.3.2 Nguyên tắc trình xử lý DNA với bisulfite 1.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DNA SAU XỬ LÝ BISUL 1.4.1 Xác định nồng độ DNA phương pháp đo quang phổ 1.4.2 Định lượng DNA sau xử lý bisulfite Real-time PCR 1.4.3 Xác định mức độ xử lý DNA với bisulfite CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1 Nguyên liệu 2.2.2 Hóa chất 2.2.3 Thiết bị 2.3 2.3.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp xử lý DNA 2.3.2 Phương pháp PCR 25 2.3.3 Phương pháp Real-time PCR 28 2.3.4 Phương pháp tách dòng 29 2.3.5 Phương pháp biến nạp 30 2.3.6 Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc 31 2.3.7 Phương pháp tách plasmid 31 2.3.8 Phương pháp cắt enyme giới hạn 32 2.3.9 Phương pháp điện di 32 2.3.10 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 33 2.3.11 Phương pháp giải trình tự gen 33 2.3.12 Phương pháp phân tích thống kê 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 THIẾT KẾ IC VÀ UnIC 34 3.1.1 Tổng hợp đoạn IC UnIC 34 3.1.2 Tách dòng IC UnIC 36 3.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu IC 38 3.2 KHẢO SÁT pUnIC (MẪU CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG pIC) .40 3.2.1 Khảo sát giá trị ΔCt mẫu chuẩn 40 3.2.2 Dựng đường chuẩn pUnIC 42 3.3 KHẢO SÁT LƯỢNG pIC CHO QUÁ TRÌNH XỬ LÝ BISULFITE 43 3.3.1 Đánh giá mức độ xử lý bisulfite cho nồng độ khác pIC 43 3.3.2 Giải trình tự 48 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Các phương pháp sinh học phân tử áp dụng chẩn đốn lâm sàng địi hỏi độ xác, độ nhạy độ đặc hiệu cao Một công cụ hữu hiệu giúp nâng cao độ tin cậy cho thử nghiệm phân tử sử dụng mẫu đối chứng nội kiểm Đối chứng nội kiểm tham gia kiểm sốt quy trình, phản ứng mà khơng ảnh hưởng đến chất phân tử đích, đảm bảo kết xác với có độ tin cậy cao Các mẫu nội kiểm sử dụng nhiều cho quy trình tách chiết khuếch đại DNA/RNA góp phần xây dựng hệ thống phát biến đổi di truyền hay chẩn đoán mầm bệnh hiệu Các biến đổi di truyền ngoại sinh trở thành dấu chuẩn phân tử chẩn đoán bệnh Trong đó, tượng methyl hóa nghiên cứu phổ biến methyl hóa mức số gen có liên quan chặt chẽ tới q trình hình thành phát sinh ung thư Trong phương pháp sử dụng để nghiên cứu tượng này, xử lý DNA với bisulfite có ưu hẳn phương pháp khác Tuy nhiên, chưa có hệ thống nội kiểm thực hồn thiện để kiểm sốt q trình xử lý bisulfite Việc bổ sung mẫu nội kiểm cho phương pháp phân tích methyl hóa góp phần kiểm định tính xác kết quả, hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite” nhằm đưa công cụ hỗ trợ việc kiểm sốt q trình xử lý bisulfite đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite Đề tài thực Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Hình 3.11 Đồ thị so sánh tỷ lệ xử lý bisulfite ba nhóm pIC phối trộn gDNA mẫu bệnh phẩm Mẫu chuẩn pUnIC sử dụng làm đối chứng tương đương với pIC xử lý hoàn toàn với bisulfite Nghiên cứu Warnecke cs năm 2002 rằng, việc sử dụng nhiều DNA đầu vào xử lý bisulfite làm cạn kiệt bisulfite phản ứng làm tăng pH thơng qua việc hình thành sản phẩm phụ NH Điều dẫn tới trình chuyển đổi DNA với bisulfite diễn khơng hồn tồn Warnecke cs (2002) việc sử dụng 10 µg gDNA khiến mức độ chuyển đổi giảm, tăng tỷ lệ DNA sợi đôi (DNA không bị xử lý bisulfite) hỗn hợp DNA sau xử lý [53] Vì vậy, vùng gen phân tích DNA lặp lại việc giới hạn lượng DNA đưa vào xử lý phải tính tốn kĩ cho phù hợp với khả xử lý bisulfite phương pháp, hóa chất sử dụng Lượng gDNA kit xử lý khuyến cáo (khoảng 0.5 µg – µg) phù hợp nghiên cứu methyl hóa vùng gen đơn bản, cịn nghiên cứu methyl hóa DNA lặp lại lượng gDNA nên sử dụng hơn, tùy thuộc vào số lượng gen có mặt tế bào 47 3.3.2 Giải trình tự pIC đoạn DNA nhân tạo nên khơng có vị trí C bị methyl hóa gDNA Về lý thuyết, pIC xử lý hoàn toàn với bisulfite tất C biến đổi thành T Để kiểm tra điều này, chúng tơi tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại pIC sau xử lý bisulfite với cặp mồi Trans-CFF-F/R Kết giải trình tự góp phần khẳng định lại việc khảo sát phân tích tỷ lệ xử lý pIC trình bày phần trước Sản phẩm PCR tinh với Exo-SAP trước giải trình tự theo phương pháp Sanger Trình tự xử lý phân tích phần mềm BioEdit Kết trình bày Hình 3.12, màu ứng với nucleotide thể đỉnh Khi trình tự sản phẩm PCR khơng đồng có tượng đỉnh kép (hai đỉnh chồng nhau) Trong trường hợp này, C chưa xử lý hết thành T cho kết đỉnh kép T-C Hình 3.12 Kết giải trình tự pIC số mẫu sau xử lý bisulfite.(1): Mẫu máu T110 thả 10 ng pIC, tỷ lệ xử lý 0.78 (2): Mẫu đúc CP9 thả 0.3 ng pIC, tỷ lệ xử lý 0.86 (3): Mẫu đúc CP126 thả 0.005 ng pIC, tỷ lệ xử lý 0.96 48 Kết Hình 3.12 cho thấy, trình tự mẫu (1) thả 10 ng pIC nhiễu, đặc biệt vị trí C chưa xử lý hết thành T Mức độ xử lý mẫu ba mẫu giải trình tự (tỷ lệ xử lý 0.78) Khi lượng pIC xử lý giảm xuống cịn 0.3 ng mẫu (2), chúng tơi nhận thấy trình tự pIC xử lý bớt nhiễu số vị trí có đỉnh kép T-C chứng tỏ pIC xử lý chưa hoàn toàn Đối với mẫu thả 0.005 ng pIC, trình tự thu tốt, tất vị trí C biến đổi thành T Các đỉnh trình tự rõ ràng tách nhau, pIC xử lý hoàn toàn Như vậy, kết giải trình tự pIC sau xử lý bisulfite hoàn toàn phù hợp với kết phân tích tỷ lệ xử lý pIC nồng độ khác Dựa vào kết phân tích trên, lựa chọn 0.005 ng pIC lượng phù hợp để khảo sát mức độ xử lý DNA với bisulfite Để khẳng định lại kết quả, chọn mẫu bệnh phẩm thả 0.005 ng pIC, dương tính với methyl SHOX2 (mẫu KP65, tỷ lệ xử lý pIC 0.97) để giải trình tự kiểm tra đồng thời gDNA pIC Kết giải trình tự Hình 3.13A cho thấy tất vị trí C IC biến đổi thành T Hình 3.13B cho thấy tất C tự vùng gen đích biến đổi hồn tồn thành T, vị trí CpG (gạch chân đỏ) giữ nguyên sau trình xử lý bisulfite Các đỉnh trình tự rõ ràng khơng có tín hiệu nhiễu Như vậy, IC gDNA xử lý hoàn toàn với bisulfite Hình 3.13 (A) Kết giải trình tự pIC mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng IC (B) Kết giải trình tự vùng promoter gen SHOX2 mẫu đúc KP65 thả 0.005 ng IC 49 Đối với gen SHOX2, mẫu bệnh phẩm lành tính mẫu ung thư bị methyl hóa, nhiên tỷ lệ methyl hóa khác mẫu, tùy thuộc vào đặc tính mơ bệnh [58] Sự gia tăng số copy DNA SHOX2 tế bào ung thư nguyên nhân làm cho tỷ lệ methyl hóa SHOX2 tế bào lành thấp so với tế bào ung thư [38, 58] Nếu trình xử lý DNA với bisulfte xảy khơng hồn tồn dẫn đến việc bắt cặp khơng đặc hiệu mồi gây dương tính giả [37, 53] Hiện tượng dương tính giả làm thay đổi tỷ lệ methyl hóa hai nhóm bệnh, chí làm thay đổi giá trị cut-off methyl khiến việc đánh giá mức độ methyl hóa khơng cịn xác Qua đó, chúng tơi thấy rằng, việc kiểm sốt q trình xử lý bisulfite vùng gen đích IC quan trọng cần thiết Để tránh tượng dương tính giả xử lý DNA với bisulfite khơng hồn tồn, đặc biệt, thử nghiệm cần độ xác tin cậy cao, tỷ lệ chuyển đổi DNA với bisulfite khuyến cáo phải đạt 0.995 [63] So sánh với nghiên cứu mình, chúng tơi thấy tỷ lệ xử lý 0.005 ng pIC mẫu bệnh phẩm đạt 0.99±0.10, gần với khuyến cáo Kết giải trình tự phù hợp với kết phân tích định lượng Vì vậy, thời gian tới, tập trung khảo sát pIC xung quanh khoảng 0.005 ng đánh giá kĩ mối liên quan mức độ xử lý pIC với mức độ xử lý gDNA vùng gen đích đồng thời đánh giá ảnh hưởng mức độ xử lý bisulfite lên tỷ lệ methyl hóa vùng gen đích Mặc dù pIC chúng tơi thiết kế cịn số điểm chưa thật tối ưu chưa mô xác cấu hình DNA đích với khảo sát khả quan ban đầu này, coi pIC thị tương đối cho trình xử lý DNA với bisulfite, tảng để tiếp tục phát triển hệ pIC tối ưu nghiên cứu sau 50 KẾT LUẬN Qua kết thu nghiên cứu, rút số kết luận sau: Thiết kế thành công mẫu nội kiểm (IC) hỗ trợ việc kiểm sốt q trình xử lý bisulfite vùng gen đích SHOX2 mẫu chuẩn (UnIC) cho việc đánh giá tỷ lệ xử lý bisulfite IC Xác định khoảng giá trị ΔCt mẫu chuẩn: 0.48 ± 0.05, cho phép đánh giá mức độ xử lý IC với bisulfite Bước đầu khảo sát xác định lượng pIC sử dụng phù hợp cho q trình xử lý bisulfite gen đích 0.005 ng KIẾN NGHỊ Khảo sát pIC nồng độ từ 0.3 ng đến 0.005 ng Sử dụng IC để đánh giá mức độ xử lý bisulfite q trình xác định mức độ methyl hóa gen SHOX2 mẫu bệnh phẩm ung thư phổi 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương (2017), Ứng dụng kỹ thuật Real-time pcr để phát đột biến - 455g/a gen Fibrinogen beta bệnh nhân nhồi máu tim trẻ tuổi, Tạp chí nghiên cứu Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Lê Đình Roanh (2004), Nghiên cứu phát triển kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đoán số bệnh ung thư, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp bộ, Trường Đại học Y Hà Nội Tiếng Anh Akbarian A., Shahhosseiny M H., Vafaei S., Moslemi E., Ghahri M (2015), "Designing novel and simple competitive internal amplification control for reliable pcr diagnosis of Herpes Simplex Virus", Jundishapur Journal of Microbiology, 8(2): e16260 Balinsky C A., Delhon G., Smoliga G., Prarat M., French R A., Geary S J., Rock D L., Rodriguez L L (2008), "Rapid preclinical detection of sheeppox virus by a real-time PCR assay", Journal of Clinical Microbiology, 46(2), pp 438-442 Barbas C F., Burton D R., Scott J K., Silverman G J (2007) "Quantitation of DNA and RNA", Cold Spring Harbor Protocols, 2007(11), pdb-ip47 Barekati Z., R Radpour, C Kohler, Zhong X Y (2010), “Specificity of methylation assays in cancer research: a guideline for designing primers and probes”, Obstetrics and Gynecology International, 2010, pp 1-7 Beld M., Minnaar R., Weel J., Sol C., Damen M., van der Avoort H., Boom R (2004), “Highly sensitive assay for detection of enterovirus in clinical 52 specimens by reverse transcription-PCR with an armored RNA internal control”, Journal of Clinical Microbiology, 42(7), pp 3059-3064 Cankovic M (2013), Laboratory Testing for Prognostic and Predictive Markers in Gliomas, Clinical Management and Evolving Novel Therapeutic Strategies for Patients with Brain Tumors InTech Cottenet G., Blancpain C., Sonnard V., Chuah P F (2013), "Development and validation of a multiplex real-time PCR method to simultaneously detect 47 targets for the identification of genetically modified organisms", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 405(21), pp 6831-6844 10 Darst R P., Pardo C E., Ai L (2010), “Bisulfite sequencing of DNA”, Current Protocols in Molecular Biology, 15, pp 1-17 11 Dingle K E., Crook D., Jeffery K (2004), "Stable and noncompetitive RNA internal control for routine clinical diagnostic reverse transcription-PCR", Journal of Clinical Microbiology, 42(3), pp 1003-1011 12 Dingle K E., Crook D., Jeffery K (2004), "Stable and noncompetitive RNA internal control for routine clinical diagnostic reverse transcription-PCR", Journal of Clinical Microbiology, 42(3), pp 1003-1011 13 Dreier J., Störmer M., Kleesiek K (2005), “Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays” Journal of Clinical Microbiology, 43(9), pp 4551-4557 14 Ehrich M., Zoll S., Sur S., Van Den Boom D (2007), "A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment", Nucleic Acids Research, 35(5), e29 53 15 Ehrich M., Zoll S., Sur S., Van den boom D (2007), “A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment”, Nucleic Acids Research, 35(5), e29 16 Espy M J., Uhl J R., Sloan L M., Buckwalter S P., Jones M F., Vetter E A., Smith T F (2006), "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing", Clinical Microbiology Reviews, 19(1), pp 165-256 17 Frommer M., McDonald L E., Millar D S., Collis, C M., Watt F., Grigg G W., Paul C L (1992), “A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, 89(5), pp 1827-1831 18 Garibyan L., Avashia N (2013), “Polymerase chain reaction”, Journal of Investigative Dermatology, 133(3), pp 1-4 19 GeneProof (2017), Product Catalogue, Czech Republic 20 Genereux D P., Johnson W C., Burden A F., Stöger R., Laird C D (2008), “Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failedconversion frequencies”, Nucleic Acids Research, 36(22), e150 21 Grunau C., Clark S J., Rosenthal A (2001), “Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters”, Nucleic Acids Research, 29(13), e65-e65 22 Gutala R V., Reddy P H (2004), "The use of real-time PCR analysis in a gene expression study of Alzheimer’s disease post-mortem brains", Journal of Neuroscience Methods, 132(1), pp 101-107 54 23 Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C (2001), “An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression”, Methods, 25(4), pp 386-401 24 Hayatsu H (2008), “The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research”, Mutation Research, 659(1), pp 77-82 25 Hayatsu H., Negishi K., Shiraishi M (2004), “Accelerated bisulfite-deamination of cytosine in the genomic sequencing procedure for DNA methylation analysis”, Nucleic Acids Symposium Series (Oxford Academic), 48, pp 261–262 26 Hayatsu H., Wataya Y., Kai K., Iida S (1970), “Reaction of sodium bisulfite with uracil, cytosine, and their derivatives”, Biochemistry, 9(14), pp 2858–2866 27 Heid C A., Stevens J., Livak K J., Williams P M (1996), “Real time quantitative PCR”, Genome Research, 6(10), pp 986-994 28 Hernandez H G., Tse M Y., Pang S C., Arboleda H., Forero D A (2013), “Optimizing methodologies for PCR-based DNA methylation analysis”, Biotechniques, 55(4), pp 181-197 29 Hernández H G., Tse M Y., Pang S C., Arboleda H., Forero D A (2013), “Bisulfite conversion”, BioTechniques, 55(4), pp 181-197 30 Hernandez-Rodriguez P., Ramirez A G (2012), “Polymerase chain reaction: types, utilities and limitations”, Polymerase Chain Reaction InTech 31 Holmes E E., Jung M., Meller S., Leisse A., Sailer V., Zech J., Dietrich D (2014), “Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion of DNA 55 from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine”, PloS one, 9(4), e93933 32 Hoorfar J., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M., Fach P (2004), “Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays”, Journal of Clinical Microbiology, 42(5), pp 1863-1868 33 Hughes K J., Tomlinson J A., Griffin R L., Boonham N., Inman A J., Lane C R (2006), “Development of a one-step real-time polymerase chain reaction assay for diagnosis of Phytophthora ramorum”, Phytopathology, 96(9), pp 975-981 34 Jin L., Wang W., Hu D (2013), “The conversion of protonated cytosine-SO3(-) to uracil-SO3(-): insights into the novel induced hydrolytic deamination through bisulfite catalysis”, Physical Chemistry Chemical Physics, 15(23), pp 9034-9042 35 Joshi M., Deshpande J D (2010), “Polymerase chain reaction: methods, principles and application”, International Journal of Biomedical Research, 2(1), pp 81-97 36 Jung M., Uhl B., Kristiansen G., Dietrich, D (2017), “Bisulfite conversion of DNA from tissues, cell lines, buffy coat, FFPE tissues, microdissected cells, swabs, sputum, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine”, Population Epigenetics: Methods and Protocols, 1589, pp 139159 37 Kate P., Laura M., Wenjia Q., Susan C (2011), “DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis”, Journal of Visualized Experiments, 56, e3170 56 38 Kneip C., Schmidt B., Seegebarth A., Weickmann S., Fleischhacker M., Liebenberg V., Dietrich D (2011) “SHOX2 DNA methylation is a biomarker for the diagnosis of lung cancer in plasma”, Journal of Thoracic Oncology, 6(10), pp 1632-1638 39 Kreuzer K A., Bohn A., Lupberger J., Solassol J., Le Coutre P., Schmidt, C A (2001), “Simultaneous absolute quantification of target and control templates by real-time fluorescence reverse transcription-PCR using 4-(4′dimethylaminophenylazo) benzoic acid as a dark quencher dye”, Clinical Chemistry, 47(3), pp 486-490 40 Kubista M., Andrade J M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Ståhlberg A (2006), “The real-time polymerase chain reaction”, Molecular Aspects of Medicine, 27(2), pp 95-125 41 Lang A H., Drexel H., Geller-Rhomberg S., Stark N., Winder T., Geiger K., Muendlein A (2011), "Optimized allele-specific real-time PCR assays for the detection of common mutations in KRAS and BRAF", The Journal of Molecular Diagnostics, 13(1), pp 23-28 42 Leontiou C A., Hadjidaniel M D., Mina P., Antoniou P., Ioannides M., Patsalis P C (2015), “Bisulfite conversion of DNA: performance comparison of different kits and methylation quantitation of epigenetic biomarkers that have the potential to be used in non-invasive prenatal testing”, PloS one, 10(8), e0135058 43 Life technologies (2012), Basic of real-time PCR 44 Lin T., Yang L., Denver C., Lavulo L (2011), “An internal control for monitoring DNA extraction and PCR inhibition in real-time PCR assays”, Pathology, 43(1), pp 78-79 57 45 Lipp M., Shillito R., Giroux R., Spiegelhalter F., Charlton S., Pinero D., Song P (2005), “Polymerase chain reaction technology as analytical tool in agricultural biotechnology”, Journal of AOAC International, 88(1), pp 136-155 46 Liu W., D A Saint (2002), “A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics”, Analytical Biochemistry, 302(1), pp 52-59 47 Liu W., Zhao X., Zhang P., Mar T T., Liu Y., Zhang Z., Han C., Wang X (2013), "A one step real-time RT-PCR assay for the quantitation of Wheat yellow mosaic virus (WYMV)", Virology Journal, 10(1), pp 173 48 Louie M., Louie L., Simor A E (2000), “The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases”, Canadian Medical Association Journal, 163(3), pp 301-309 49 Luciano P., Bertea C M., Temporale G., Maffei M E (2007), “DNA internal standard for the quantitative determination of hallucinogenic plants in plant mixtures”, Forensic Science International: Genetics, 1(3), pp 262266 50 Mitchell S M., Ross J P., Drew H R., Ho T., Brown G S., Saunders N F., Duesing K R., Buckley M J, Dunne R., Beetson I., Rand K N, McEvoy A., Thomas M L., Baker R T., Wattchow D A, Young G P., Lockett T J., Pedersen S K., LaPointe L C., Molloy P L (2014), "A panel of genes methylated with high frequency in colorectal cancer", BMC cancer, 14(1), pp 54 58 51 Morrison T B., Weis J J., Wittwer C T (1998) “Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification”, Biotechniques, 24(6), pp 954-962 52 Parashar D., Chauhan D S., Sharma V D., Katoch V M (2006), “Applications of real-time PCR technology to mycobacterial research”, Indian Journal of Medical Research, 124(4), pp 385 53 Warnecke P M., Stirzaker C., Song J., Grunau C., Melki J R., Clark S J (2002) "Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing", Methods, 27(2), pp 101-107 54 Rådström P., Löfström C., Lövenklev M., Knutsson R., Wolffs P (2008), “Strategies for overcoming PCR inhibition”, Cold Spring Harbor Protocols, 2008(3), pp 149-161 55 RealStar® (2017), Zika Virus RT-PCR Kit U.S Instructions for Use, San Francisco, USA 56 Sarkar S., Horn G., Moulton K., Oza A., Byler S., Kokolus S., Longacre M (2013), “Cancer development, progression, and therapy: an epigenetic overview”, International Journal of Molecular Sciences, 14(10), pp 21087-21113 57 Schmittgen T D., Livak K J (2008), "Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method", Nature Protocols, 3(6), pp 1101-1108 58 Schneider K U., Dietrich D., Fleischhacker M., Leschber G., Merk J., Schäper F., Kneip C (2011), “Correlation of SHOX2 gene amplification and DNA methylation in lung cancer tumors”, BMC cancer, 11(1), pp 102 59 59 Shiraishi M., Hayatsu H (2004), “High-speed conversion of cytosine to uracil in bisulfite genomic sequencing analysis of DNA methylation”, DNA Research, 11(6), pp 409-415 60 Urich M A., Nery J R., Lister R., Schmitz R J., Ecker J R (2015), "MethylCseq library preparation for base-resolution whole-genome bisulfite sequencing" Nature Protocols, 10(3), pp 475-483 61 Weisenberger D J., Campan M., Long T I., Kim M., Woods C., Fiala E., Laird P W (2005), “Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight”, Nucleic Acids Research, 33(21), pp 6823-6836 62 Wong M L., Medrano J F (2005), “Real-time PCR for mRNA quantitation”, Biotechniques, 39(1), pp 75-88 63 Wreczycka K., Gosdschan A., Yusuf D., Gruening B., Assenov Y., Akalin A (2017), “Strategies for analyzing bisulfite sequencing data”, Journal of Biotechnology, 261, pp 105-115 64 Yang A S., Estécio M R., Doshi K., Kondo Y., Tajara E H., Issa J P J (2004),"A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite PCR of repetitive DNA elements", Nucleic Acids Research, 32(3), e38-e38 65 Yang Y., Sebra R., Pullman B S., Qiao W., Peter I., Desnick R J., Geyer C R., DeCoteau J F., Scott S A (2015), "Quantitative and multiplexed DNA methylation analysis using long-read single-molecule real-time bisulfite sequencing (SMRT-BS)" BMC Genomics, 16(1), pp 350 60 ... tiến hành đề tài: ? ?Thiết kế mẫu nội kiểm đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite? ?? nhằm đưa cơng cụ hỗ trợ việc kiểm sốt trình xử lý bisulfite đánh giá mức độ xử lý DNA với bisulfite Đề tài thực... trình xử lý mức độ xử lý bisulfite hay không cần xem xét [42] Để đánh giá mức độ xử lý, phương pháp chủ yếu đưa kiểm tra khả khuếch đại DNA sau xử lý bisulfite với cặp mồi dành cho DNA trước xử lý. .. 1.2 MẪU NỘI KIỂM 1.2.1 Mẫu nội kiểm DNA 1.2.2 Mẫu nội kiểm RNA 1.3 QUÁ TRÌNH XỬ LÝ DNA VỚI BISULFITE 1.3.1 Giới thiệu phương pháp xử lý DNA với bisulfite