Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Luận văn thạc sỹ chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG Học Viên: Đoàn Văn Thuyết Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tính PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Hoàng PGS.TS Nguyễn Quang Huy HÀ NỘI – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hoàng PGS.TS Nguyễn Quang Huy tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, cô giáo thuộc khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh truyền đạt cho tơi kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán thuộc phịng Cơng nghệ Sinh học phịng Cơng nghệ Hóa sinh/Viện Cơng nghệ mới/Viện KH-CN qn sự, cán Viện Hóa học – Mơi trường quân sự/Bộ Tư lệnh Hóa học, người giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho tơi điều kiện tốt để hồn thành luận văn Luận văn thực với kinh phí đề tài khoa học cơng nghệ cấp Viện KH-CN quân sự, theo Hợp đồng số 290/2014/HĐKHCN Hà Nội, ngàytháng năm 2015 Học viên Đào Thị Hương Giang Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG BẢNG VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme acetylcholinesterase 1.1.1 Lịch sử phát vai trò enzyme acetylcholinesterase 1.1.2 Phân loại enzyme acetylcholinesterase 1.1.3 Phân bố chức enzyme acetylcholinesterase 1.1.4 Cấu tạo enzyme acetylcholinesterase 1.2 Tổng quan phƣơng pháp tinh enzyme acetylcholinesterase 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu tinh enzyme acetylcholinesterase giới .10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tinh enzyme acetylcholinesterase Việt Nam 12 1.3 Một số nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 13 1.4 Ứng dụng enzyme acetylcholinesterase 14 1.5 Một số nghiên cứu nhân dòng biểu gen acetylcholinesterase 16 1.5.1 Đặc điểm gen mã hóa enzyme acetylcholinesterase 16 1.5.2 Một số nghiên cứu nhân dòng biểu gen acetylcholinesterase .17 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 24 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phƣơng pháp định lƣợng protein thu đƣợc 25 2.2.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 25 2.2.3 Phƣơng pháp tinh enzyme acetylcholinesterase 27 2.2.4 Đánh giá độ chế phẩm thu đƣợc phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) Laemmli (1970) 28 2.2.5 Phƣơng pháp đông khô 29 2.2.6 Nghiên cứu số tính chất enzyme acetylcholinesterase 29 2.2.7 Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số 30 2.2.8 Phƣơng pháp tổng hợp cDNA 30 2.2.9 Phƣơng pháp PCR 31 2.2.10 Điện di gel agarose 31 2.2.11 Phƣơng pháp nhân dòng vào vector pGEMT 31 2.2.12 Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α 32 2.2.13 Phƣơng pháp giải trình tự 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Khảo sát hoạt độ acetylcholinesterase số sinh vật 34 3.2 Tinh enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bị 34 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang 3.2.1 Tinh sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose 35 3.2.2 Tinh enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75 .36 3.2.3 Kiểm tra độ chế phẩm acetylcholinesterase từ hồng cầu bò SDS – page 39 3.2.4 Đông khô chế phẩm enzyme acetylcholinesterase 40 3.3 Nghiên cứu số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 43 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterarse .43 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 43 3.4 Nhân dịng giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị 44 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ máu bò tổng hợp cDNA 44 3.4.2 Nhân gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò 44 3.4.3 Nhân dịng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị vào vector pGEM T 45 3.4.4 Giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị 49 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang DANH MỤC HÌNH Hình Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Hình 1.10 Hình 1.11 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 24 Đào Thị Hương Giang Dale H H (1914), "The action of certain esters and ethers of choline and their relation to muscarine", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol 6, pp 147-190 25 Daniel, Kelly et al (2008), “Computational studies on the solvolysis of the chemical warfare agent VX”, Journal of Physical Organic Chemistry, Vol 21, pp 321-328 26 De La Hoz D., Doctor B P., Ralston J S., Rush R S., and Wolfe A D (1986), “A simplified procedure for the purification of large quantities of fetal bovine serum acetylcholinesterase”, Life Science Journal, Vol 39, pp 195–199 27 Ecobichon D.J (1996), “Toxic effects of pesticides ”, Cassarett and Doull‟s Toxicology, Vol 5, pp 655–666 28 Fischer M., Ittah A., Gorecki M., Werber M.M (1995) "Recombinant human acetylcholinesterase expressed in Escherichia coli: refolding, purification and characterization", Biotechnol Appl Biochem, Vol 21, pp 295-311 29 Fischer M., Ittah A., Liefere I and Gorecki M (1993), "Expression and reconstitution of biologically active human acetylcholinesterase from Escherichia coli", Cellular and Molecular Neurobiology, Vol 13, pp 25-38 30 Fisher W., Piazza C.C., Bowman L.G., Hagopian L.P., Owens J.C., & Slevin I (1992), “A comparison of two approaches for identifying reinforcers for persons with severe and profound disabilities”, Journal of Applied Behavior Analysis, Vol 25, pp 491–498 31 Fournier D., Karch F., Bride J.M., Hall L M C., Berge J.B and Spierer P (1989), “Drosophi la melanogaster acetylcholinesterase gene : structure , evolution and mutation”, Journal of Molecular Biology, Vol 210, pp 15-22 32 Greenblatt H.M., Guillou C., Guenard D., Argaman A., Botti S., Badet B., Thal C., Silman I., Sussman J.L (2004), The Complex of a Bivalent Derivative of Galanthamine with Torpedo Acetycholinesterase Displays Drastic Deformation of the Active-Site Gorge: Implications for Structure- Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Based Drug Design, Journal of the American Chemical Society, Vol 126, pp 15405 33 Habibe Budak, Kaya Bilge Özcan, Melda Şişecioğlu, Hasan Ozdemir (2013), “Purification of acetylcholinesterase by 9-amino-1,2,3,4 – tetrahydroacridine from human erythrocytes”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 170, pp 198-209 34 Hall L.M.C., Malcolm C.A (1991), “The acetylcholinesterase gene of Anopheles stephensi”, Cellular and Molecular Neurobiology, Vol 11, pp 131-141 35 Hank Ellison D (2007), "Hanbook of Chemical and Biological warfare Agents", CRC Press, pp 47 36 Hayour H., Bouraiou A., Bouacid S., Berre F., Carboni B., Roisnel T., et al (2011), “Synthesis and X-ray structures of new cycloalka [e] pyrano [2,3b] pyridinederivatives: novel tacrine analogues”, Tetrahedron Letters, Vol 52, pp 4868–4871 37 Henn B.C., McMaster S., and Padilla S.J (2006), “Measuring cholinesterase activity in human saliva”, Journal of Toxicology and Environmental Health A, Vol 69(19), pp 1805–1818 38 Hoffmamn F., Fourner D and spierer P (1992), “Minigene rescues acetylcholinesterase lethal mutations in Drosophila melanogaster”, Journal of Molecular Biology, Vol 223, pp 17-22 39 Husain K (1994), “Phenylvalerate and choline ester hydrolases in the platelets of human, hen, rat and mouse”, Human and Experimental Toxicology Vol 13, pp 157–159 40 Itai Mendelson, Chanoch kronman, Naomi ariel, Avigdor shafferman and Baruch velan (1998), "Bovine acetylcholinesterase: cloning, expression and characterization", Biochemical Journal, Vol 334, pp 251-259 41 Ji Young Son, Sook shin, Kwang ho choi and In kook park (2002), “Purification of soluble acetylcholinesterase from Japanese quail brain by Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang affinity chromatography”, International Journal Of Biochemistry And Cell Biology, Vol 34, pp 204-210 42 Jin Q.H., Shi Y.F., He H.Y., Ng K.K., Jiang H., Yang L., et al (2002), “Isolation of acetylcholinesterase from apoptotic human lung fibroblast cells by antibody affinity chromatography”, Biotechniques, Vol 33, pp 92–97 43 Jingquan Li, Qian Ba, Jun Yin, Songjie Wu, Fangfang Zhuan, Songci Xu, Junyang Li, Joelle K Salazar, Wei Zhang, Hui Wang (2013), “Surface Display of Recombinant Drosophila melanogaster Acetylcholinesterase for Detection of Organic Phosphorus and Carbamate Pesticides”, PLoS ONE 8(9): e72986 doi:10.1371/journal.pone.0072986 44 Kasim Abass, Askar A., Caleb Kudi and A jonh Moody (2011), “Purification of solube acetylcholinesterase from sheep liver by affinity chromatography”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 165, pp 336 – 346 45 Keane S & Ryan M.F (1999), “Purification, characterisation, and inhibition by monoterpenes of acetylcholinesterase from the waxmoth Galleria mellonella (L.)”, Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol 29, pp 1097–1104 46 Krasowski M.D., McGehee D.S., and Moss J (1997), “Natural inhibitors of cholinesterases; Implications for adverse drug reactions”, Canadian Journal of Anesthesia, Vol 44 (5 Pt 1), Vol 525–534 47 Li B., Stribley J A., Ticu A., Xie W., Schopfer L M., Hammond P., Brimijoin S., Hinrichs S H., and Lockridge O (2000), “Abundant tissue butyrylcholinesterase and its possible function in the acetylcholinesterase knockout mouse”, Journal of Neurochemistry, Vol 75 (3), pp 1320–1331 48 Li Y., Camp S and Taylor P (1992), “Tissue specific expression and alternative message processing of the mammalian acetylcholinesterase gene” Journal of Biological Chemistry, Vol 268, pp 5790-7 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 49 Đào Thị Hương Giang Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L and Randall R.J (1951), “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, Journal of Biological Chemistry, Vol 193, pp 265-275 50 Marchot P., Bourne Y., Prowse C.N., Bougis P.E., and Taylor P (1998), “Inhibition of mouse acetylcholinesterase by fasciculin, crystal structure of the complex and mutagenesis of fasciculin”, Toxicon, Vol 36, pp 1613– 1622 51 Maulet Y., Camp S., Gibney G., Rachnsky T., and Taylor P (1990), “Single gene encodes glycophospholipidanchored and asymmetric acetylcholinesterase forms: alternative coding exons contain inverted repeat sequences”, Neuron, Vol 4, pp 289-301 52 Min Ma, Bin Zhang and Sheng-cai Li (2011), “Purification and partial characterization of acetlcholinesterase from Pardosa astrigera L Koch”, Journal of Cell and Animal Biology, Vol (1), pp 11-16 53 Mohd Sha Aidil Sharif, M Izuan Effendi Halmi, Amir Syahir, Wan Lutfi Wan Johari and M Yunus Shukor (2014), "Assessment of Acetylcholinesterase from Channa micropeltes as a Source of Enzyme for Insecticides Detection", International Journal of Agriculture and Biology, Vol 16, pp 389‒394 54 Mutero A and Fournier D (1992), “Post – translational modifications of Drosophila acetylcholinesterase In vitro mutagenesis and expression in Xenopus oocytes”, The Journal of Biological Chemistry, Vol 267, pp 1695 -1700 55 Mutero A., Pralavorio M., Bride J.M and Fournier D (1994), “Resistance associated point mutations in insecticide insensitive acetylcholinesterase”, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, pp 5922–5926 56 Nicola Anthony, Thomas Rocheleau, Giovani Mocelin, Hwa-Jung Lee, Richard ffrench-Constant (1995), “Cloning, sequencing and functional expression of an acetylcholinesterase gene from the yellow fever Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang mosquito Aedes aegypti”, Federation of European Biochemical Societies, Vol 368, pp 461-465 57 Nigg H.N., Ramos L.E., Graham E.M., Sterling J., Brown S., and Cornell J.A (1996), “Inhibition of human plasma and serum butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) by alphachaconine and alpha solanine”, Fundamentals of pharmacology and applications in pharmacogenetics, Vol 33, pp 272–281 58 Palmer K., Berger A.K., Monastero R., Winblad B., Backman L., Fratiblioni L (2007), “Predictors of progression from mild cognitive impairment to Alzhimer disease”, Neurology, Vol 68 (19), pp 1596-1602 59 Patocka J (1998), “Huperzine A – An interesting anticholinesterase compound from the Chinese herbal medicine”, Acta Medica, Vol 41(4), pp 155–157 60 Paulus J.M., Maigne J., and Keyhani E (1981), “Mouse megakaryocytes secrete acetylcholinesterase”, Blood, Vol 58, pp 1100– 1106 61 Pezzementi L., Sutherland D., Sanders M., Soong W., Milner D., McClellan J.S., Sapp M., Coblentz W.B., Rulewicz G., and Merritt “Structure and function of cholinesterases from S (1998), agnathans and cephalochordates: Implications for the evolution of cholinesterases”, Handbook of Pesticide Toxicology, Vol 2, pp 105–110 62 Piau A., Nourhashemi F., Hein C., Caillaud C., & Vellas B (2011), “Progress in the development of new drugs in Alzheimer's disease”, The Journal of Nutrition, Health & Aging, Vol 15, pp 45–57 63 R.C Baselt (2008), Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man, 8th edition, Biomedical Publications, Foster City, CA, pp 389-391 64 Radic Z., Gibney G., Kawamoto S., Macphee-Quigley K., Bongiorno C and Taylor P (1992), “Express of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants”, Biochemistry, Vol 31, pp 9760-7 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 65 Đào Thị Hương Giang Schwartz A.R., Pizon A.F., Brooks D.E (2008), “Dextromethorphan induced serotonin syndrome”, Clinical Toxicology (Philadelphia Pa.), Vol 46 (8), pp 771-773 66 Shen T., Tai K., Henchman R.H., McCammon J.A (2003), “Molecular dynamics of acetylcholinesterase”, Accounts of Chemical Research, Vol 35 (6), pp 332-340 67 Silman I., and Sussman J.L (2008), “Acetylcholinesterase: How is structure related to function?”, Chemico-biological Interactions, Vol 175(13), pp 3– 10 68 Silver A (1974), “The Biology of Cholinesterases: Frontiers of Biology”, American Elsevier Pub Co 69 Small B.J., Gagnon E., Robinson B (2007), “Early indentification of cognitive deficits: preclinical Alzheimer‟s disease and mild cognitive impairment”, Geriatrics, Vol 62 (4), pp 19-23 70 Soreq H., Ben-Aziz R., Prody C.A., Seidman S., Gnatt A., Neville L., Lieman-Hurwitz J., Lev-Lehman E., Ginzberg D., Lipidot-Lifson Y., et al (1990), “Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G.C-rich attenuating structure”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol 87(24), pp 9688-92 71 Sperling L.E., Steinert G., Boutter J., Landgraf D., Hescheler J., Pollet D., and Layer P.G (2008), "Characterisation of cholinesterase expression during murine embryonic stem cell differentiation", Chemicobiological Interactions, Vol 175(1-3), pp 156–160 72 Strelitz F (1944), “Studies on cholinesterase: Purification of psuedo-cholinesterase from horse serum”, Biochemical journal, Vol 38, pp 86-88 73 Tai K., Shen T., Henchman R.H., Bourne Y., Marchot P., Mc Cammon J.A (2002), “Mechanism of acetylcholineserase inhibition by fasciculin: a 5-NS molecular dynamic simulation”, Journal of the American Chemical Society, Vol 124, pp 6153-6161 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 74 Takahashia Đào Thị Hương Giang T., Naoya Hanaueb N (2010), “Molecular characterization of Hydraacetylcholinesterase and its catalytic activity”, Federation of the European Biochemical Societies, Vol 584, pp 511-516 75 Talesa V., Grauso M., Arpagaus M., Giovannini E., Romani R., and Rosi G (1999), "Molecular cloning and expression of a fulllength cDNA encoding acetylcholinesterase in optic lobes of the squid Loligo opalescens, a new member of the cholinesterase family resistant to diisopropyl fluorophosphate”, Journal of Neurochemistry, Vol 72(3), pp 1250–1258 76 Taylor P (1996), “Cholinesterase agents”, In Goodman and Gilman‟s the Pharmacological Basis of Therapeutics, Vol 9, pp 161–176 77 Traina M.E., and Serpietri L A (1984), “Changes in the levels and forms of rat plasma cholinesterases during chronic diisopropylphosphofluoridate intoxication”, Biochemcal Pharmacology, Vol 33, pp 645–653 78 Vikas Dhulla, Neeraj Dilbaghia and Vikas Hoodab (2014), "Detection of organophosphorus compounds using AChE PVC strip colorimetric method", Der Pharmacia Lettre, Vol (6), pp 304-314 79 Waldemar G., Dubois B., Emre M et al (2007), “Recommendations for the diangnosis and management of the Alzheimer‟s disease and other disorders associated with dementia: EFNS guideline”, European Journal Of Neurology Vol 14(1), pp 21-26 80 Wills J H (1972), “The measurement and significance of changes in the cholinesterase activities of erythrocytes and plasma in man and animals”, CRC critical reviews in toxicology, Vol 1, pp 153–199 81 Yunhua Ding, XiaoMin Wu, JunBin Fang (2011), "Purification and characterization of acetylcholinesterase from brain tissues of Oreochromis aurea and its application in environmental pesticide monitoring", Sciences in Cold and Arid Regions, Vol 3(4), pp 0339–0343 82 Zajicek J (1957), “Studies on the histogenesis of blood platelets and megakaryocytes”, Acta physiologica Scandinavica, Vol 40, pp 1–32 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 83 Đào Thị Hương Giang Zhifan Yang, Jun Chen, Yongqin Chen, and Sijing Jiang (2010), “Molecular cloning and characterization of an acetylcholinesterase cDNA in the brown planthopper, Nilaparvata lugens”, Journal of Insect Science, Vol 10, pp 102 Internet 84 Zmaexpasy.Org/Tools/Protpar-Ref.Html 85 Zmedicowesome.Blogspot.Com/2012/12/Mechanism-of-ActionOf.Html 86 f Zwww.Atsdr.Cdc.Gov/Csem/Cholinesterase/Docs/Cholinesterase.Pd Khóa 2013 – 2015 ... học: TS Trần Văn Tính PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420 114 LUẬN VĂN THẠC... 40 3.3 Nghiên cứu số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 43 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterarse .43 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterase. .. AChE từ hồng cầu bò 44 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ máu bò tổng hợp cDNA 44 3.4.2 Nhân gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị 44 3.4.3 Nhân dịng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bị vào vector