Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Luận văn thạc sỹ chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm ĐÀO THỊ HƢƠNG GIANG Học Viên: Đoàn Văn Thuyết Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tính PGS.TS Bùi Phƣơng Thuận CỦA ENZYME TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ACETYLCHOLINESTERASE TỪ HỒNG CẦU BÒ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Hoàng PGS.TS Nguyễn Quang Huy HÀ NỘI – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hoàng PGS.TS Nguyễn Quang Huy tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô giáo thuộc khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán thuộc phòng Công nghệ Sinh học phòng Công nghệ Hóa sinh/Viện Công nghệ mới/Viện KH-CN quân sự, cán Viện Hóa học – Môi trường quân sự/Bộ Tư lệnh Hóa học, người giúp đỡ nhiều để hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Luận văn thực với kinh phí đề tài khoa học công nghệ cấp Viện KH-CN quân sự, theo Hợp đồng số 290/2014/HĐKHCN Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Đào Thị Hương Giang Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG BẢNG VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme acetylcholinesterase 1.1.1 Lịch sử phát vai trò enzyme acetylcholinesterase 1.1.2 Phân loại enzyme acetylcholinesterase 1.1.3 Phân bố chức enzyme acetylcholinesterase 1.1.4 Cấu tạo enzyme acetylcholinesterase 1.2 Tổng quan phƣơng pháp tinh enzyme acetylcholinesterase 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu tinh enzyme acetylcholinesterase giới 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tinh enzyme acetylcholinesterase Việt Nam 12 1.3 Một số nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 13 1.4 Ứng dụng enzyme acetylcholinesterase 14 1.5 Một số nghiên cứu nhân dòng biểu gen acetylcholinesterase 16 1.5.1 Đặc điểm gen mã hóa enzyme acetylcholinesterase 16 1.5.2 Một số nghiên cứu nhân dòng biểu gen acetylcholinesterase 17 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 24 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phƣơng pháp định lƣợng protein thu đƣợc 25 2.2.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 25 2.2.3 Phƣơng pháp tinh enzyme acetylcholinesterase 27 2.2.4 Đánh giá độ chế phẩm thu đƣợc phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) Laemmli (1970) 28 2.2.5 Phƣơng pháp đông khô 29 2.2.6 Nghiên cứu số tính chất enzyme acetylcholinesterase 29 2.2.7 Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số 30 2.2.8 Phƣơng pháp tổng hợp cDNA 30 2.2.9 Phƣơng pháp PCR 31 2.2.10 Điện di gel agarose 31 2.2.11 Phƣơng pháp nhân dòng vào vector pGEMT 31 2.2.12 Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α 32 2.2.13 Phƣơng pháp giải trình tự 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Khảo sát hoạt độ acetylcholinesterase số sinh vật 34 3.2 Tinh enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 34 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang 3.2.1 Tinh sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose 35 3.2.2 Tinh enzyme Acetylcholinesterase qua cột Sephadex TM G-75 36 3.2.3 Kiểm tra độ chế phẩm acetylcholinesterase từ hồng cầu bò SDS – page 39 3.2.4 Đông khô chế phẩm enzyme acetylcholinesterase 40 3.3 Nghiên cứu số tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò 43 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterarse 43 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme acetylcholinesterase 43 3.4 Nhân dòng giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò 44 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ máu bò tổng hợp cDNA 44 3.4.2 Nhân gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò 44 3.4.3 Nhân dòng gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò vào vector pGEM T 45 3.4.4 Giải trình tự gen mã hóa AChE từ hồng cầu bò 49 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Khớp thần kinh – cấu trúc truyền xung thần kinh Hình 1.2 Mô cấu trúc bậc AChE Công thức hóa học số acid amin tạo thành trung tâm Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 hoạt động AChE Sự phù hợp không gian nhóm chức trung tâm hoạt động với nhóm phân tử chất acetylcholine Công thức hóa học acetylcholine Mô hình trạng thái trung gian tƣơng tác chất truyền thần 10 kinh acetylcholine với enzyme AChE làm lỏng lẻo liên kết CO dẫn đến thủy phân acetylcholine thành choline acid acetic Hình 1.7 Hình 1.8 Cấu trúc gen mã hóa AChE số động vật 17 So sánh trình tự axit amin suy diễn AChE từ Aedes 18 aegypti (Ad), Anopheles stephensi (An) Drosophila melanogaster (Dr) Hình 1.9 Hình 1.10 Quy trình nhân dòng biểu AChE bò 20 So sánh trình tự axit amin BoAChE với trình tự 21 AChE khác Hình 1.11 Quy trình xây dựng plasmid tái tổ hợp pYES-DEST52-AChE 23 Hình 2.1 Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho AChE vào vector pGEM T 32 Hình 3.1 Hoạt độ AChE số đối tƣợng nghiên cứu 34 Sắc ký đồ trao đổi ion qua cột DEAE - Sepharose tinh 35 Hình 3.2 Hình 3.3 AChE từ hồng cầu bò Sắc ký đồ lọc gel qua cột Sephadex G75 tinh AChE từ Khóa 2013 – 2015 36 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang hồng cầu bò Điện di đồ AChE từ hồng cầu bò sau giai đoạn tinh Hình 3.4 39 qua cột trao đổi ion DEAE - Sepharose cột lọc gel SephadexTM G75 Hình 3.5 Quy trình tinh enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu 42 bò Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme AChE 43 Hình 3.7 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ enzyme AChE 44 Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen AChE từ 45 Hình 3.8 máu bò Sự hình thành khuẩn lạc sau biến nạp hỗn hợp gắn Hình 3.9 46 đoạn gen hóa AChE vector pGEMT vào E coli chủng DH5α Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector 47 pGEM-AchE Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm plasmid pGEM- AChE 48 Hình 3.12 Kết PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE 48 So sánh trình tự gen AChE nghiên cứu trình tự 50 Hình 3.13 AChE bò đƣợc công bố giới (NM_001076220.1) Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Phân tích vị trí cắt enzyme giới hạn có trình tự 50 gen AchE Các vị trí glycosyl hóa vị trí hình thành cầu nối disunfua 51 AChE bò Trình tự acid amin enzyme AChE bò với vị trí trung 52 tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn Trình tự acid amin enzyme AChE ngƣời với vị trí Khóa 2013 – 2015 52 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang trung tâm hoạt động đƣợc khoanh tròn Hình 3.18 So sánh trình tự gen AChE nghiên cứu trình tự 54 AChE ngƣời đƣợc công bố giới (M55040.1) DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng kit Biovision 26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 31 Kết thu đƣợc qua bƣớc tinh AChE từ 37 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Khóa 2013 – 2015 hồng cầu bò Một số kết nghiên cứu tinh enzyme AChE 38 Kết đông khô phân đoạn protein sau sắc ký 40 trao đổi ion Thành phần phản ứng ligase AChE vào vector pGEM T 46 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang DANH MỤC VIẾT TẮT ACh Acetylcholine AChE Acetylcholinesterase AchI Acetylthiocholine iodide BVTV Bảo vệ thực vật BchE Butyrylcholineserase CAT Chloramphenicol acetyl-transferase CB Carbamate CBB Coomassie brilliant blue cDNA Complementary DNA (DNA bổ trợ) ChE Cholinesterase ChOH Choline CM-cellulose Carboxymethyl-cellulose CNS Hệ thống thần kinh trung ƣơng DEAE-cellulose Diethylaminoethyl-cellulose DTNB Chất sinh màu 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Khóa 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Khóa 2013 – 2015 Đào Thị Hương Giang 57 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Hình 3.18 So sánh trình tự gen AChE bò nghiên cứu trình tự AChE ngƣời đƣợc công bố giới (M55040.1) Trình tự axit amin protein AChE ngƣời đƣợc nghiên cứu công bố sở liệu trình tự protein UniProt So sánh trình tự acid amin AChE ngƣời bò cho thấy, AChE ngƣời có axit amin trung tâm hoạt động (active site) subsite – định tính đặc hiệu hoạt động enzyme - trùng với AChE bò (Hình 3.17) Trình tự gen AchE bò thu đƣợc nghiên cứu có tƣơng đồng 91% so với trình tự gen AChE ngƣời đƣợc công bố giới (hình 3.18) Bên cạnh đó, AChE ngƣời đƣợc nhân dòng biểu thành công E.coli [28] Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất AChE bò đƣờng tái tổ hợp, biến nạp vào E.coli hoàn toàn khả thi Khóa 2013 – 2015 58 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trình nghiên cứu nhƣ trên, đƣa số kết luận sau: Đã nghiên cứu xác định đƣợc hoạt độ enzyme Acetylcholinesterase máu 04 sinh vật (bò, lợn, ngan gà) Kết cho thấy hoạt độ AChE sinh vật tƣơng đối thấp (AChE < 0,05 U/mg nguyên liệu tƣơi) Trong đó, hoạt độ AChE bò cao đạt 0,024 U/mg nguyên liệu tƣơi Đã tinh thành công enzyme AChE từ hồng cầu bò phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel Chế phẩm AChE thu đƣợc phân đoạn cao 148 U/mg Đã thu đƣợc 304,6 mg AChE dạng đông khô từ hồng cầu bò có hoạt độ riêng 110 U/mg Chế phẩm AChE hoạt động tối thích pH khoảng 7-8 , nhiệt độ tối ƣu khoảng 30-40oC Đã nhân thành công đoạn gen mã hóa cho AChE, đoạn gen có kích thƣớc khoảng 1,8 kb từ hồng cầu bò phƣơng pháp RT-PCR Đồng thời nhân dòng thành công đoạn gen vào vector pGEM T Trình tự đoạn gen mã hóa cho AChE từ hồng cầu bò Việt Nam tƣơng đồng 100% so với trình tự gen AChE đƣợc công bố ngân hàng gen giới (NM_001076220.1) Trình tự vị trí cắt enzyme giới hạn HindIII, BamHI, EcoRI, NdeI, XhoI đƣợc thiết kế thêm trình tự nhận biết hai enzyme giới hạn NdeI vào đầu 5‟ EcoRI vào đầu 3‟ Khóa 2013 – 2015 59 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu để tối ƣu hóa điều kiện tinh nhằm tăng hoạt độ enzyme acetylcholinesterase Khóa 2013 – 2015 60 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đinh Ngọc Tấn, (1998), Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nâng cao hoạt độ enzyme cholinesterase tách từ nguồn nguyên liệu nước ứng dụng phân tích chất độc photpho, Luận án tiến sĩ hóa học Lê Minh Trí, (2005), Nghiên cứu khai thác ứng dụng enzyme acetylcholinesterase chẩn đoán chất độc phospho hữu cơ, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Minh Trí, (2010), Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng ứng dụng acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Tiếng Anh A Singh, Sunil K Jaiswal and B Sharma (2013), "Effect of low temperature stress on acetylcholinesterase activity and its kinetics in 5th instar larvae of Philosamia ricini", Journal of Biochemistry Research, Vol 1(2), p 17-25 Ahmed M., Latif N., Khan R.A., Ahmad A., Rocha J.B.T., Mazzanti C.M., Bagatini M.D., Morsch V.M., Schetinger M.R.C (2012), "Enzymatic and biochemical characterization of Bungarus sindanus snake venom acetylcholinesterase", The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, Vol 18, pp 236-243 Aliriz S., Turkoglu V (2003), “Purification and characterization of acetylcholinesterase from the Lake Van fish (Chalcalburnus tarichii Pallas, 1811), Prep Biochem Biotechnol, Vol 33(2), pp 137-45 Anderson R B., and Key, B., (1999), "Role of acetylcholinesterase in the development of axon tracts within the embryonic vertebrate brain", Int J Dev Neurosci, Vol 17, pp 787-793 Khóa 2013 – 2015 61 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Andrade M.T., Lima J.A., Pinto A.C., Rezende C.M., Carvalho M.P and Epifanio R De A (2005), Indole alkaloids from Taberneamontana australis (Muell Arg.) Miers that inhibit acetycholinesterase enzyme, Bioorg, Medicinal Chemistry, Vol 13 Arpagaus M., Kott M., Vatsis K P, Bartels Cynthia F., La Du Bert N., Lockridge O (1990), “Structure of the gene for human butyrylcholinesterase Evidence for a single copy”, Biochemistry, Vol 29(1), pp 124-31 10 Arrieta D.E., McCurdy S.A., Henderson J.D., Lefkowitz L.J., Reitstetter R., Wilson B.W (2009), “Normal range of human red blood cell acetylcholinesterase activity”, Drug and Chemical Toxicology, Vol 32, pp 182 – 185 11 Askar K.A., Kudi A.C & Moody A.J (2011), “Purification of soluble acetylcholinesterase from sheep liver by affinity chromatography”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 165, pp 336–346 12 Assis C.R., Castro P.F., Amaral I.P., Carvalho E.V., Carvalho L.B., Bezerra R.S (2010), “Characterization of acetylcholinesterase from the brain of the Amazonian tambaqui (Colossoma macropomum) and in vitro effect of organophosphorus and carbamate pesticides”, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol 29(10), pp 2243-8 13 Augustinsson K.B (1948), “Cholinesterases, a study in comparative enzymology”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol 15(Suppl 52), pp 1– 182 14 Augustinsson K.B (1959a), “Electrophoresis studies on blood plasma esterases: I Mammalian plasmata”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol 13, pp 571–592 15 Augustinsson K.B (1959b), “Electrophoresis studies on blood plasma esterases: II Avian, reptilian, amphibian and piscine plasmata”, Acta Physiologica Scandinavica, Vol 13, pp 1081–1096 Khóa 2013 – 2015 62 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 16 Đào Thị Hương Giang Bany I.A., Dong M.Q., Koelle M.R (2003), “Genetic and cellular basic for acetylcholine inhibition”, The Journal of Neuroscience, Vol 23, pp 80608069 17 Barbosa Filho J.M., Karina C., Paula Medieros, Margareth de Fátima F.M Diniz, Leônia M Batista Petrônio F Athayde-Filho, Marcelo S Silva, Emídio V.L da-Cunha, Jackson R.G Silva Almeida, Lucindo J QuitansJúnior (2006), Natural products inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase, Revista Brasileira de Famacognosia, Vol 16, pp 258285 18 Bartels C.F., Xie W., MillerLindholm A K., Schopfer L M., and Lockridge O (2000), “Determination of the DNA sequences of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase from cat and demonstration of the existence of both in cat plasma”, Biochemical Pharmacol, Vol 60(4), pp 479–487 19 Bon S., Huet M., Lemonnier M., Rieger F., Masssoulie J (1976), “Molecular forms of Electrophorus acetylcholinesterase, molecular weight and composition", European Journal of Chemistry, Vol 68, pp 523 – 530 20 Carroll R.T Grimm J.L., Hepburn T.W & Emmerling M.R (1995), “Purification of acetylcholinesterase by tacrin affinity chromatography”, Protein Expression and Purification, Vol pp 389–393 21 Chen J.W., Ling K.H (1996), “Territrems, naturally occurring specific irreversible inhibitors of acetylcholinesterase”, Journal of Biomedical Science, Vol 3, pp 54–58 22 Chiappa S., Brimijoin S (1998), "Pharmacologic tests of a role for acetylcholinesterase in promoting neurite outgrowth by dorsal root ganglia", Structure and Function of Cholinesterases and Related Proteins, pp 585– 592 23 Culetto E., Combes D., Fedon Y., Roig A., Toutant J P., and Arpagaus M (1999), “Structure and promoter activity of the 5' flanking region of ace1, the gene encoding acetylcholinesterase of class A in Caenorhabditis elegans”, Journal of Molecular Biology, Vol 290, pp 951–966 Khóa 2013 – 2015 63 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 24 Đào Thị Hương Giang Dale H H (1914), "The action of certain esters and ethers of choline and their relation to muscarine", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol 6, pp 147-190 25 Daniel, Kelly et al (2008), “Computational studies on the solvolysis of the chemical warfare agent VX”, Journal of Physical Organic Chemistry, Vol 21, pp 321-328 26 De La Hoz D., Doctor B P., Ralston J S., Rush R S., and Wolfe A D (1986), “A simplified procedure for the purification of large quantities of fetal bovine serum acetylcholinesterase”, Life Science Journal, Vol 39, pp 195–199 27 Ecobichon D.J (1996), “Toxic effects of pesticides ”, Cassarett and Doull‟s Toxicology, Vol 5, pp 655–666 28 Fischer M., Ittah A., Gorecki M., Werber M.M (1995) "Recombinant human acetylcholinesterase expressed in Escherichia coli: refolding, purification and characterization", Biotechnol Appl Biochem, Vol 21, pp 295-311 29 Fischer M., Ittah A., Liefere I and Gorecki M (1993), "Expression and reconstitution of biologically active human acetylcholinesterase from Escherichia coli", Cellular and Molecular Neurobiology, Vol 13, pp 25-38 30 Fisher W., Piazza C.C., Bowman L.G., Hagopian L.P., Owens J.C., & Slevin I (1992), “A comparison of two approaches for identifying reinforcers for persons with severe and profound disabilities”, Journal of Applied Behavior Analysis, Vol 25, pp 491–498 31 Fournier D., Karch F., Bride J.M., Hall L M C., Berge J.B and Spierer P (1989), “Drosophi la melanogaster acetylcholinesterase gene : structure , evolution and mutation”, Journal of Molecular Biology, Vol 210, pp 15-22 32 Greenblatt H.M., Guillou C., Guenard D., Argaman A., Botti S., Badet B., Thal C., Silman I., Sussman J.L (2004), The Complex of a Bivalent Derivative of Galanthamine with Torpedo Acetycholinesterase Displays Drastic Deformation of the Active-Site Gorge: Implications for Structure- Khóa 2013 – 2015 64 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang Based Drug Design, Journal of the American Chemical Society, Vol 126, pp 15405 33 Habibe Budak, Kaya Bilge Özcan, Melda Şişecioğlu, Hasan Ozdemir (2013), “Purification of acetylcholinesterase by 9-amino-1,2,3,4 – tetrahydroacridine from human erythrocytes”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 170, pp 198-209 34 Hall L.M.C., Malcolm C.A (1991), “The acetylcholinesterase gene of Anopheles stephensi”, Cellular and Molecular Neurobiology, Vol 11, pp 131-141 35 Hank Ellison D (2007), "Hanbook of Chemical and Biological warfare Agents", CRC Press, pp 47 36 Hayour H., Bouraiou A., Bouacid S., Berre F., Carboni B., Roisnel T., et al (2011), “Synthesis and X-ray structures of new cycloalka [e] pyrano [2,3b] pyridinederivatives: novel tacrine analogues”, Tetrahedron Letters, Vol 52, pp 4868–4871 37 Henn B.C., McMaster S., and Padilla S.J (2006), “Measuring cholinesterase activity in human saliva”, Journal of Toxicology and Environmental Health A, Vol 69(19), pp 1805–1818 38 Hoffmamn F., Fourner D and spierer P (1992), “Minigene rescues acetylcholinesterase lethal mutations in Drosophila melanogaster”, Journal of Molecular Biology, Vol 223, pp 17-22 39 Husain K (1994), “Phenylvalerate and choline ester hydrolases in the platelets of human, hen, rat and mouse”, Human and Experimental Toxicology Vol 13, pp 157–159 40 Itai Mendelson, Chanoch kronman, Naomi ariel, Avigdor shafferman and Baruch velan (1998), "Bovine acetylcholinesterase: cloning, expression and characterization", Biochemical Journal, Vol 334, pp 251-259 41 Ji Young Son, Sook shin, Kwang ho choi and In kook park (2002), “Purification of soluble acetylcholinesterase from Japanese quail brain by Khóa 2013 – 2015 65 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang affinity chromatography”, International Journal Of Biochemistry And Cell Biology, Vol 34, pp 204-210 42 Jin Q.H., Shi Y.F., He H.Y., Ng K.K., Jiang H., Yang L., et al (2002), “Isolation of acetylcholinesterase from apoptotic human lung fibroblast cells by antibody affinity chromatography”, Biotechniques, Vol 33, pp 92–97 43 Jingquan Li, Qian Ba, Jun Yin, Songjie Wu, Fangfang Zhuan, Songci Xu, Junyang Li, Joelle K Salazar, Wei Zhang, Hui Wang (2013), “Surface Display of Recombinant Drosophila melanogaster Acetylcholinesterase for Detection of Organic Phosphorus and Carbamate Pesticides”, PLoS ONE 8(9): e72986 doi:10.1371/journal.pone.0072986 44 Kasim Abass, Askar A., Caleb Kudi and A jonh Moody (2011), “Purification of solube acetylcholinesterase from sheep liver by affinity chromatography”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 165, pp 336 – 346 45 Keane S & Ryan M.F (1999), “Purification, characterisation, and inhibition by monoterpenes of acetylcholinesterase from the waxmoth Galleria mellonella (L.)”, Insect Biochemistry and Molecular Biology, Vol 29, pp 1097–1104 46 Krasowski M.D., McGehee D.S., and Moss J (1997), “Natural inhibitors of cholinesterases; Implications for adverse drug reactions”, Canadian Journal of Anesthesia, Vol 44 (5 Pt 1), Vol 525–534 47 Li B., Stribley J A., Ticu A., Xie W., Schopfer L M., Hammond P., Brimijoin S., Hinrichs S H., and Lockridge O (2000), “Abundant tissue butyrylcholinesterase and its possible function in the acetylcholinesterase knockout mouse”, Journal of Neurochemistry, Vol 75 (3), pp 1320–1331 48 Li Y., Camp S and Taylor P (1992), “Tissue specific expression and alternative message processing of the mammalian acetylcholinesterase gene” Journal of Biological Chemistry, Vol 268, pp 5790-7 Khóa 2013 – 2015 66 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 49 Đào Thị Hương Giang Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L and Randall R.J (1951), “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, Journal of Biological Chemistry, Vol 193, pp 265-275 50 Marchot P., Bourne Y., Prowse C.N., Bougis P.E., and Taylor P (1998), “Inhibition of mouse acetylcholinesterase by fasciculin, crystal structure of the complex and mutagenesis of fasciculin”, Toxicon, Vol 36, pp 1613– 1622 51 Maulet Y., Camp S., Gibney G., Rachnsky T., and Taylor P (1990), “Single gene encodes glycophospholipidanchored and asymmetric acetylcholinesterase forms: alternative coding exons contain inverted repeat sequences”, Neuron, Vol 4, pp 289-301 52 Min Ma, Bin Zhang and Sheng-cai Li (2011), “Purification and partial characterization of acetlcholinesterase from Pardosa astrigera L Koch”, Journal of Cell and Animal Biology, Vol (1), pp 11-16 53 Mohd Sha Aidil Sharif, M Izuan Effendi Halmi, Amir Syahir, Wan Lutfi Wan Johari and M Yunus Shukor (2014), "Assessment of Acetylcholinesterase from Channa micropeltes as a Source of Enzyme for Insecticides Detection", International Journal of Agriculture and Biology, Vol 16, pp 389‒394 54 Mutero A and Fournier D (1992), “Post – translational modifications of Drosophila acetylcholinesterase In vitro mutagenesis and expression in Xenopus oocytes”, The Journal of Biological Chemistry, Vol 267, pp 1695 -1700 55 Mutero A., Pralavorio M., Bride J.M and Fournier D (1994), “Resistance associated point mutations in insecticide insensitive acetylcholinesterase”, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, pp 5922–5926 56 Nicola Anthony, Thomas Rocheleau, Giovani Mocelin, Hwa-Jung Lee, Richard ffrench-Constant (1995), “Cloning, sequencing and functional expression Khóa 2013 – 2015 of an acetylcholinesterase gene 67 from the yellow fever Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang mosquito Aedes aegypti”, Federation of European Biochemical Societies, Vol 368, pp 461-465 57 Nigg H.N., Ramos L.E., Graham E.M., Sterling J., Brown S., and Cornell J.A (1996), “Inhibition of human plasma and serum butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) by alphachaconine and alpha solanine”, Fundamentals of pharmacology and applications in pharmacogenetics, Vol 33, pp 272–281 58 Palmer K., Berger A.K., Monastero R., Winblad B., Backman L., Fratiblioni L (2007), “Predictors of progression from mild cognitive impairment to Alzhimer disease”, Neurology, Vol 68 (19), pp 1596-1602 59 Patocka J (1998), “Huperzine A – An interesting anticholinesterase compound from the Chinese herbal medicine”, Acta Medica, Vol 41(4), pp 155–157 60 Paulus J.M., Maigne J., and Keyhani E (1981), “Mouse megakaryocytes secrete acetylcholinesterase”, Blood, Vol 58, pp 1100–1106 61 Pezzementi L., Sutherland D., Sanders M., Soong W., Milner D., McClellan J.S., Sapp M., Coblentz W.B., Rulewicz G., and Merritt “Structure and cephalochordates: function of Implications cholinesterases S (1998), from agnathans and for the evolution of cholinesterases”, Handbook of Pesticide Toxicology, Vol 2, pp 105–110 62 Piau A., Nourhashemi F., Hein C., Caillaud C., & Vellas B (2011), “Progress in the development of new drugs in Alzheimer's disease”, The Journal of Nutrition, Health & Aging, Vol 15, pp 45–57 63 R.C Baselt (2008), Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man, 8th edition, Biomedical Publications, Foster City, CA, pp 389-391 64 Radic Z., Gibney G., Kawamoto S., Macphee-Quigley K., Bongiorno C and Taylor P (1992), “Express of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants”, Biochemistry, Vol 31, pp 9760-7 Khóa 2013 – 2015 68 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 65 Đào Thị Hương Giang Schwartz A.R., Pizon A.F., Brooks D.E (2008), “Dextromethorphan induced serotonin syndrome”, Clinical Toxicology (Philadelphia Pa.), Vol 46 (8), pp 771-773 66 Shen T., Tai K., Henchman R.H., McCammon J.A (2003), “Molecular dynamics of acetylcholinesterase”, Accounts of Chemical Research, Vol 35 (6), pp 332-340 67 Silman I., and Sussman J.L (2008), “Acetylcholinesterase: How is structure related to function?”, Chemico-biological Interactions, Vol 175(13), pp 3– 10 68 Silver A (1974), “The Biology of Cholinesterases: Frontiers of Biology”, American Elsevier Pub Co 69 Small B.J., Gagnon E., Robinson B (2007), “Early indentification of cognitive deficits: preclinical Alzheimer‟s disease and mild cognitive impairment”, Geriatrics, Vol 62 (4), pp 19-23 70 Soreq H., Ben-Aziz R., Prody C.A., Seidman S., Gnatt A., Neville L., Lieman-Hurwitz J., Lev-Lehman E., Ginzberg D., Lipidot-Lifson Y., et al (1990), “Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G.C-rich attenuating structure”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol 87(24), pp 9688-92 71 Sperling L.E., Steinert G., Boutter J., Landgraf D., Hescheler J., Pollet D., and Layer P.G (2008), "Characterisation of cholinesterase expression during murine embryonic stem cell differentiation", Chemico-biological Interactions, Vol 175(1-3), pp 156–160 72 Strelitz F (1944), “Studies on cholinesterase: Purification of psuedocholinesterase from horse serum”, Biochemical journal, Vol 38, pp 86-88 73 Tai K., Shen T., Henchman R.H., Bourne Y., Marchot P., Mc Cammon J.A (2002), “Mechanism of acetylcholineserase inhibition by fasciculin: a 5-NS molecular dynamic simulation”, Journal of the American Chemical Society, Vol 124, pp 6153-6161 Khóa 2013 – 2015 69 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 74 Đào Thị Hương Giang Takahashia T., Naoya Hanaueb N (2010), “Molecular characterization of Hydraacetylcholinesterase and its catalytic activity”, Federation of the European Biochemical Societies, Vol 584, pp 511-516 75 Talesa V., Grauso M., Arpagaus M., Giovannini E., Romani R., and Rosi G (1999), "Molecular cloning and expression of a fulllength cDNA encoding acetylcholinesterase in optic lobes of the squid Loligo opalescens, a new member of the cholinesterase family resistant to diisopropyl fluorophosphate”, Journal of Neurochemistry, Vol 72(3), pp 1250–1258 76 Taylor P (1996), “Cholinesterase agents”, In Goodman and Gilman‟s the Pharmacological Basis of Therapeutics, Vol 9, pp 161–176 77 Traina M.E., and Serpietri L A (1984), “Changes in the levels and forms of rat plasma cholinesterases during chronic diisopropylphosphofluoridate intoxication”, Biochemcal Pharmacology, Vol 33, pp 645–653 78 Vikas Dhulla, Neeraj Dilbaghia and Vikas Hoodab (2014), "Detection of organophosphorus compounds using AChE PVC strip colorimetric method", Der Pharmacia Lettre, Vol (6), pp 304-314 79 Waldemar G., Dubois B., Emre M et al (2007), “Recommendations for the diangnosis and management of the Alzheimer‟s disease and other disorders associated with dementia: EFNS guideline”, European Journal Of Neurology Vol 14(1), pp 21-26 80 Wills J H (1972), “The measurement and significance of changes in the cholinesterase activities of erythrocytes and plasma in man and animals”, CRC critical reviews in toxicology, Vol 1, pp 153–199 81 Yunhua Ding, XiaoMin Wu, JunBin Fang (2011), "Purification and characterization of acetylcholinesterase from brain tissues of Oreochromis aurea and its application in environmental pesticide monitoring", Sciences in Cold and Arid Regions, Vol 3(4), pp 0339–0343 82 Zajicek J (1957), “Studies on the histogenesis of blood platelets and megakaryocytes”, Acta physiologica Scandinavica, Vol 40, pp 1–32 Khóa 2013 – 2015 70 Luận văn Thạc sĩ Khoa học 83 Đào Thị Hương Giang Zhifan Yang, Jun Chen, Yongqin Chen, and Sijing Jiang (2010), “Molecular cloning and characterization of an acetylcholinesterase cDNA in the brown planthopper, Nilaparvata lugens”, Journal of Insect Science, Vol 10, pp 102 Internet 84 Zmaexpasy.Org/Tools/Protpar-Ref.Html 85 Zmedicowesome.Blogspot.Com/2012/12/Mechanism-of-Action-Of.Html 86 Zwww.Atsdr.Cdc.Gov/Csem/Cholinesterase/Docs/Cholinesterase.Pdf Khóa 2013 – 2015 71 [...]... chế nhất định về hiệu suất, hoạt độ, kinh phí và đặc biệt là các điều kiện tiến hành thực nghiệm trong phòng thí nghiệm còn gặp nhiều khó khăn trong việc tinh sạch Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzyme acetylcholinesterase từ hồng cầu bò nhằm xây dựng một quy trình tinh sạch AChE hiệu quả từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền và phổ biến Khóa 2013 – 2015 1 Luận văn Thạc... điện và hồng cầu ngƣời đƣợc tinh sạch bằng sắc ký ái lực và kỹ thuật DNA tái tổ hợp nên chế phẩm enzyme thu đƣợc có hoạt độ riêng rất cao Ở Isarel, bằng cách sử dụng phối hợp sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực, Fisher và cộng sự đã thu đƣợc chế phẩm AChE ở hồng cầu ngƣời có hoạt độ riêng 4572 U/mg [29] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme Acetylcholinesterase ở Việt Nam AChE bắt đầu đƣợc nghiên. .. chế hoạt động của ChE bao gồm những glycoalkaloids họ cà, các steroid có mặt tự nhiên trong khoai tây và một số thực vật khác [46] và territrems của nấm [21] Một số chất kháng ChE khác có trong tự nhiên nhƣ fasciculin từ nọc độc của rắn [50], chaconine và solancine từ các loại củ, cây cà dƣợc [57], và huperzine từ rêu [59] Việc nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất kháng ChE đến hoạt động của enzyme giúp... gian tƣơng tác giữa chất truyền thần kinh acetylcholine với enzyme AChE [86] Các nghiên cứu cũng cho thấy phản ứng diễn ra một cách bình thƣờng nếu nhóm imidazol nằm cách nhóm COO- của acetyl 0,5nm và nếu gốc tyrosin nằm cách Ser 0,25 nm 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp tinh sạch enzyme acetylcholinesterase 1.2.1 Tình hình nghiên cứu tinh sạch enzyme acetylcholinesterase trên thế giới Acetylcholinesterase. .. thật‟ và BuChE –„cholinesterase giả‟ liên quan chặt chẽ đến độc tính của thuốc trừ sâu phospho hữu cơ do các hợp chất phospho hữu cơ có cấu trúc không gian phù hợp với cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE Đây là một trong các điều kiện để chúng cạnh tranh với cơ chất và kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme, do đó làm mất hoạt tính của enzyme Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, ... việc nghiên Khóa 2013 – 2015 13 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Đào Thị Hương Giang cứu ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ, pH lên hoạt độ AChE nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu cũng nhƣ sản xuất chế phẩm AChE lâu dài Tác giả Lê Minh Trí đã nghiên cứu nhiệt độ và pH tối ƣu của AChE tinh sạch từ đối tƣợng ốc bƣơu vàng là 30oC và pH 7,5 [3] Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt... thanh của ngan và ốc bƣơu vàng bằng phƣơng pháp sắc ký cột CM - cellulose và sắc ký cột DEAE cellulose, bƣớc đầu đã xác định đƣợc hoạt độ của AChE ở huyết thanh ngan là 1402,72 U/l và ở ốc bƣơu vàng là 686 ± 5 U/g [2, 3] Ở Việt Nam, nhìn chung chƣa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất AChE Các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tách enzyme này từ các nguồn tự nhiên, khảo sát các tính chất. .. Giang dùng làm nguồn tinh sạch enzyme [26] Ngƣợc lại, trong máu bò trƣởng thành có lƣợng AChE hồng cầu tƣơng đối cao và rất thấp trong huyết tƣơng [82] Ở các loài khác có nhiều loại ChE khác nhau, đầu tiên đƣợc phát hiện bởi các cơ chất và chất ức chế đặc hiệu và gần đây là dựa trên sự phân tích DNA [18] Chức năng sinh lý của ChE hồng cầu và huyết thanh vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ Có khả năng là các... hoạt độ của enzyme AChE Ví dụ AChE đƣợc tinh sạch từ Bungarus sindanus có pH tối ƣu 8,5; nhiệt độ tối ƣu 45oC [5] AChE tinh sạch từ Pardosa astrigera và P vulgaris hoạt động tối ƣu ở pH 7,5, nhiệt độ 30oC [52, 78] Chế phẩm AChE tinh sạch từ Channa micropeltes, Oreochromis aurea có pH và nhiệt độ tối ƣu giá trị lần lƣợt là 7; 7,5 - 8; 30oC, 35 - 40oC [53, 81] Tác giả A.Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh... phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu + Khó sản xuất với quy mô lớn đo hiệu suất thấp và không chủ động nguồn nguyên liệu + Quy trình phức tạp qua nhiều giai đoạn do đó enzyme thƣờng bị mất hoạt tính cũng nhƣ bị mất qua các bƣớc tinh sạch 1.3 Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ của enzyme acetylcholinesterase Nhiệt độ và pH có ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt độ của enzyme Nếu đƣa