Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia a trước chuyển phôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS Đặng Tiến Trường TS Trần Đức Long Hà Nội – 10/2019 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu thực nghiệm để hồn thành luận văn, tơi may mắn nhận hỗ trợ vật chất tinh thần từ thầy cô, cộng bạn bè Tôi trân trọng giúp đỡ q báu Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS Đặng Tiến Trường – Phó Chủ nhiệm Bộ mơn Giải Phẫu, Học viện Qn Y, người trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, kĩ chuyên ngành tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu ngày hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Đức Long – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người hỗ trợ, động viên, bảo tơi khắc phục thiếu sót truyền cho kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đặc biệt thầy cô Bộ môn Di truyền học - người giảng dạy cho tơi q trình học tập; cán Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt ThS.BS Nguyễn Minh Tâm, cán Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW Bệnh viện Nam Học Hiếm muộn Hà Nội tận tình hỗ trợ tơi suốt q trình thu mẫu Cuối tơi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới người bạn, người anh chị em Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ giúp tơi vượt qua giai đoạn khó khăn sống nói chung q trình hồn thiện luận văn nói riêng Một lần tơi xin chân thành cảm ơn ghi nhớ Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019 Học viên Nguyễn Kim Ngân Nguyễn Kim Ngân – K26 CH MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh hemophilia A 1.1.1 Tổng quan hemophilia A .3 1.1.2 Cơ sở phân tử bệnh 1.1.3 Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A 11 1.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A 15 1.2.1 Kỹ thuật chẩn đốn trước chuyển phơi 15 1.2.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A 16 1.3 Phân tích di truyền liên kết 19 1.3.1 Ứng dụng phân tích di truyền liên kết 19 1.3.2 Chỉ thị phân tử STR 21 1.3.3 Các số đa hình di truyền 22 1.4 Kỹ thuật PCR đa mồi 22 1.5 Kỹ thuật điện di mao quản 24 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 26 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu đa hình gen 27 2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 29 2.4 Các kỹ thuật sử dụng 29 2.4.1 Giai đoạn tối ưu xác định tính đa hình 29 2.4.2 Giai đoạn áp dụng phân tích di truyền trước chuyển phơi .38 2.4.3 Giai đoạn xác nhận kết chẩn đoán trước sinh 39 2.5 Các tiêu nghiên cứu 40 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 2.6 Địa điểm thời gian nghiên cứu 40 2.7 Vấn đề y đức đạo đức nghiên cứu 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A Việt Nam 41 3.1.1 Các STR nằm cách gen F8 1Mb 41 3.1.2 Kết tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại STR 42 3.1.3 Chỉ số đa hình số dị hợp tử STR 48 3.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT-M mẫu tế bào phôi 52 3.2 Áp dụng thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A 56 3.2.1 Áp dụng quy trình PGT-M gia đình bệnh nhân 56 3.2.2 Kết mang thai chẩn đốn trước sinh cho gia đình bệnh nhân 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 Kết luận 68 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu lâm sàng Bảng Các phương pháp phát đột biến gây bệnh hemophilia 10 Bảng Một số STR sử dụng chẩn đoán Hemophilia A 18 Bảng Thành phần D2 32 Bảng Thành phần Mastermix 33 Bảng Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 34 Bảng Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi 34 Bảng Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang .35 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang 35 Bảng 10 Thông tin mồi huỳnh quang 36 Bảng 11 Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản 36 Bảng 12 Chu trình nhiệt biến tính DNA 36 Bảng 13 Thông tin STR sử dụng nghiên cứu 42 Bảng 14 Trình tự mồi khuếch đại thị STR 43 Bảng 15 Kết nồng độ độ tinh DNA tách từ mẫu máu 44 Bảng 16 Nồng độ mồi phản ứng PCR đa mồi 47 Bảng 17 Kết tính tốn số Ho, He, PIC 49 Bảng 18 Kết nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa 52 Bảng 19 Kết phân tích đột biến gen F8 phơi IVF 63 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu biến dạng khớp Hình Vị trí gen tổng hợp FVIII Hình Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Việt Nam .6 Hình Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 Hình Cơ chế đột biến đảo đoạn intron Hình Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A 11 Hình Vị trí mồi A, B, P, Q Long-range PCR phát đảo đoạn int22 gen F8 12 Hình Kết LD-PCR phát đảo đoạn int22 gen F8 13 Hình Vị trí cắt giới hạn enzyme BclI 14 Hình 10 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen 16 Hình 11 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 24 Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu 28 Hình 13 Phần mềm Tandem Repeat Finder số thiết đặt để sàng lọc 30 Hình 14 Giao diện phân tích kết phần mềm Genemapper 4.0 37 Hình 15 Sơ đồ vị trí STR sử dụng nghiên cứu NST X 41 Hình 16 Kết tối ưu hóa mồi X1 đến X5 dải nhiệt độ 55, 60, 65 44 o Hình 17 Kết tối ưu hóa mồi X6 đến X10 dải nhiệt độ 55, 60, 65 C .44 o Hình 18 Kết tối ưu hóa mồi X11 đến X15 dải nhiệt độ 55, 60, 65 C 45 Hình 19 Kết điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có .46 Hình 20 Kết điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng độ phản ứng hiệu chỉnh 48 Hình 21 Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho quần thể nghiên cứu 50 Hình 22 Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He quần thể nghiên cứu .50 Hình 23 Biểu đồ số đa hình PIC quần thể nghiên cứu .51 Hình 24 Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử thị STR bên gen F8 52 Hình 25 Kết tối ưu hóa phơi bào 53 Hình 26 Kết tối ưu hóa phôi bào 54 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hình 27 Kết tối ưu hóa phơi bào 54 Hình 28 Kết tối ưu hóa phơi bào 55 Hình 29 Kết tối ưu hóa phơi bào 55 Hình 30 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q1 57 Hình 31 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q2 58 Hình 32 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q3 59 Hình 33 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, phôi Q4 60 Hình 34 Kết phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu 62 Hình 35 Kết chẩn đoán trước sinh Longrange PCR Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực 64 Hình 36 Kết điện di mao quản phân tích STR mẫu máu bố, mẹ, dịch ối 65 Hình 37 Kết chẩn đốn trước sinh phân tích di truyền liên kết sử dụng STR thiết kế 66 Chữ viết tắt ADO Bp CGH CSGE DHPLC DNA DOP F8 FVIII FISH Ho He Int1 Int22 I-PCR IVF ICSI MDA Mbp Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 49 Mansouritorghabeh H., L Manavifar, A Banihashem, A Modaresi, A Shirdel, M Shahroudian, G Shoja-e-Razavi, H Pousti and H Esmaily (2013), "An investigation of the spectrum of common and rare inherited coagulation disorders in North-Eastern Iran", Blood Transfusion 11(2), pp 233 50 Massaro J., C Wiezel, Y Muniz, E Rego, L De Oliveira, C MENDES‐ JUNIOR and A Simões (2011), "Analysis of five polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in the Brazilian population", Haemophilia 17(5), pp e936-e943 51 Mirchandani G G., J H Drake, S L Cook, B C Castrucci, H S Brown and C P Labaj (2011), "Surveillance of bleeding disorders, Texas, 2007", American journal of preventive medicine 41(6), pp S354-S359 52 MRC-Holland (2008), MRC-Holland,, truy cập ngày 29/9-2016, trang 53 Mühle C., M Zenker, N Chuzhanova and H Schneider (2007), "Recurrent inversion with concomitant deletion and insertion events in the coagulation factor VIII gene suggests a new mechanism for X‐chromosomal rearrangements causing hemophilia A", Human mutation 28(10), pp 1045-1045 54 Myrin‐Westesson L., F Baghaei and F Friberg (2013), "The experience of being a female carrier of haemophilia and the mother of a haemophilic child", Haemophilia 19(2), pp 219-224 55 Nakaya S., T C Hsu, S Geraghty, M Manco‐Johnson and A Thompson (2004), "Severe hemophilia A due to a 1.3 kb factor VIII gene deletion including exon 24: homologous recombination between 41 bp within an Alu repeat sequence in introns 23 and 24", Journal of Thrombosis and Haemostasis 2(11), pp 1941-1945 56 Nei M and A K Roychoudhury (1974), "Sampling variances of heterozygosity and genetic distance", Genetics 76(2), pp 379-390 57 Oldenburg J., V Ivaskevicius, S Rost, A Fregin, K White, E Holinski-Feder, C R Müller and B H Weber (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A", Journal of biochemical and biophysical methods 47(1), pp 39-51 74 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 58 Oldenburg J., J Schröder, H H Brackmann, C Müller-Reible, R Schwaab and E Tuddenham (2004), Environmental and genetic factors influencing inhibitor development, Seminars in hematology, Elsevier, tr 82-88 59 Oldenburg J., J Schröder, J Graw, V Ivaskevicius, H Brackmann, W Schramm, C Müller, E Seifried and R Schwaab (2003), "[Significance of mutation analysis in patients with haemophilia A]", Hamostaseologie 23(1), pp 6-12 60 Peng W., H Takabayashi and K Ikawa (2007), "Whole genome amplification from single cells in preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 131(1), pp 13-20 61 Peyvandi F., G Jayandharan, M Chandy, A Srivastava, S Nakaya, M Johnson, A Thompson, A Goodeve, I Garagiola and S Lavoretano (2006), "Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia 12(s3), pp 82-89 62 Piyamongkol W., M G Bermúdez, J C Harper and D Wells (2003), "Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop‐ out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis", Molecular Human Reproduction 9(7), pp 411-420 63 Poláková H., I Zmetáková and L Kádasi (2003), "Long distance PCR in detection of inversion mutations of F8C gene in hemophilia A patients", General physiology and biophysics 22(2), pp 243-254 64 QIAGEN (2017), NGS using Whole Genome Amplified DNA, chủ biên 65 Radal K (1995), Structure and Biology of factor VIII, Hematology: Basic principles and practice, Vol 66 Ray P., R Winston and A Handyside (1995), Single cell analysis for diagnosis of cystic fibrosis and Lesch-Nyhan syndrome in human embryos before implantation, Nucleic Acids Symposium Series, [London]: Information Retrieval Ltd., c1979c2000., tr 46 75 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 67 Rosenthal A and D Jones (1990), "Genomic walking and sequencing by oligocassette mediated polymerase chain reaction", Nucleic acids research 18(10), pp 3095 68 Rossetti L C., A Goodeve, I B Larripa and C D De Brasi (2004), "Homeologous recombination between AluSx‐sequences as a cause of hemophilia", Human mutation 24(5), pp 440-440 69 Rossetti L C., C P Radic, I B Larripa and C D De Brasi (2005), "Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR", Clinical chemistry 51(7), pp 1154-1158 70 Santacroce R., M Acquila, D Belvini, G Castaldo, I Garagiola, S Giacomelli, A Lombardi, B Minuti, F Riccardi and R Salviato (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", Journal of human genetics 53(3), pp 275-284 71 Santagostino E., M Mancuso, A Tripodi, V Chantarangkul, M Clerici, I Garagiola and P Mannucci (2010), "Severe hemophilia with mild bleeding phenotype: molecular characterization and global coagulation profile", Journal of Thrombosis and Haemostasis 8(4), pp 737-743 72 Shrestha S., S Dong, Z Li, Z Huang and F Zheng (2016), "Evaluation of factor VIII polymorphic short tandem repeat markers in linkage analysis for carrier diagnosis of hemophilia A", Biomedical Reports 5(2), pp 228-232 73 Stern H (2014), "Preimplantation genetic diagnosis: prenatal testing for embryos finally achieving its potential", Journal of clinical medicine 3(1), pp 280-309 74 Stonebraker J S., P H BOLTON‐MAGGS, J Michael Soucie, I Walker and M Brooker (2010), "A study of variations in the reported haemophilia A prevalence around the world", Haemophilia 16(1), pp 20-32 75 Sukarova E., A Dimovski, P Tchacarova, G Petkov and G Efremov (2001), "An Alu insert as the cause of a severe form of hemophilia A", Acta haematologica 106(3), pp 126-129 76 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 76 Thornhill A R and K Snow (2002), "Molecular diagnostics in preimplantation genetic diagnosis", The Journal of molecular diagnostics: JMD 4(1), pp 11 77 Van de Water N., R Williams, P Ockelford and P Browett (1998), "A 20.7 kb deletion within the factor VIII gene associated with LINE-1 element insertion", 78 Weir B., J Reynolds and K Dodds (1990), "The variance of sample heterozygosity", Theoretical population biology 37(1), pp 235-253 79 Witt M and R P Erickson (1989), "A rapid method for detection of Ychromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction", 80 Zhang L., X Cui, K Schmitt, R Hubert, W Navidi and N Arnheim (1992), "Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis", Proceedings of the National Academy of Sciences 89(13), pp 5847-5851 81 Zhao M., M Chen, A S Tan, F S Cheah, J Mathew, P.-C Wong and S S Chong (2017), "Single‐tube tetradecaplex panel of highly polymorphic microsatellite markers< Mb from F8 for simplified preimplantation genetic diagnosis of hemophilia A", Journal of Thrombosis and Haemostasis 15(7), pp 1473-1483 Tài liệu tham khảo trang web: 82 Hối rối loạn đông máu Việt Nam (2017), Việt Nam có khoảng 30.000 người phụ nữ mang gen bệnh "Rối loạn chảy máu", Viện Huyết học Truyền máu TW, truy cập ngày 13/8-2019, trang web https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/viet-namco-khoang-30-000-nguoi-phu-nu-mang-gen-benh-roi-loan-chaymau/p205i19234.html 83 Viện Y học ứng dụng Việt Nam Bệnh ưa chảy máu - Hemophilia, truy cập ngày 04/09-2019, trang web http://vienyhocungdung.vn/benh-ua-chay-mauhemophilia-20161027112625228.htm 84 Bệnh viện Nam học muộn Hà Nội Thụ tinh ống nghiệm (IVF), truy cập ngày 28/9-2019, trang web https://afhanoi.com/thu-tinh-ong-nghiem 85 Silas H Haemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, trang web https://www.slideshare.net/HelaoSilas/haemophilia-76369646 77 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 86 Bệnh viện Nhi trung ương Phác đồ chẩn đoán điều trị bệnh Hemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, trang web http://benhviennhitrunguong.org.vn/phac-do-chandoan-dieu-tri-benh-hemophilia.html 87 Bệnh viện Phụ sản trung ương, Các phương pháp chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương, truy cập ngày 13/8-2019, trang web http://benhvienphusantrunguong.org.vn/news/tin-tuc-su-kien/cac-phuong-phapchan-doan-truoc-sinh.html 88 Viện huyết học - Truyền máu Trung Ương Xét nghiệm ối loại trừ bệnh máu khó đơng Hemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, trang web https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/xet-nghiem-oi-loai-tru-benh-mau-kho-donghemophilia/p205i15521.html 78 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH PHỤ LỤC Tần số allele STR 50 mẫu không mang gen bệnh (1): F8Int21 DXS1073 116-128 Allele 114 117 119 120 121 122 123 124 125 126 127 Tần suất Allele 1 13 15 40 151 153 154 155 156 158 159 160 162 164 166 167 168 169 171 Tần suất Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 50 mẫu không mang gen bệnh (2): F8Int22 207-217 Allele 206 208 209 210 211 212 213 Tần suất Allele 40 34 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 260 261 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 103 mẫu mang gen bệnh (1): F8Int21 DXS1073 116-128 Allele 119 120 121 122 123 124 125 126 127 133 Tần suất Allele 25 50 34 77 2 142 144 151 152 153 155 156 157 158 159 160 161 163 165 166 167 168 169 170 171 178 Tần suất Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR 103 mẫu mang gen bệnh (2): F8Int22 207-217 Allele 196 207 208 209 210 211 212 220 Tần suất Allele 34 47 43 68 237 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 257 258 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR tổng 153 mẫu (1): F8Int21 DXS1073 116-128 Allele 114 117 119 120 121 122 123 124 125 126 127 133 Tần suất Allele 38 60 16 12 76 83 142 144 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 178 Tần suất Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Tần số allele STR tổng 153 mẫu (2): F8Int22 207-217 Allele 196 206 207 208 209 210 211 212 213 220 Tần suất Allele 34 89 46 104 14 13 233 234 235 236 237 239 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 260 261 ... hemophilia A trước chuyển phơi” với hai mục tiêu: Thiết kế thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 có số ? ?a hình cao quần thể Áp dụng thị thiết. .. Ho, He thị STR Chuyển phôi theo dõi mang thai L? ?a chọn STR cho chẩn đoán hemophilia A Chẩn đoán trước sinh kiểm tra kết Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo giai đoạn: giai đoạn...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền