Phân lập và tuyển chọn nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Huyền Nhung PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61 HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ NGUYÊN THÀNH Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose 1.1.1 Cellulose 1.1.2 Hemicellulose 1.1.3 Lignin 1.2 Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) 12 1.2.1 Glycoside hydrolase 12 1.2.2 Họ GH 61 15 1.3 Giới thiệu chung nấm mốc 16 1.3.1 Định nghĩa 16 1.3.2 Hình thái cấu trúc 17 1.3.3 Sinh sản nấm mốc 18 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Đối tƣợng 24 2.2 Hóa chất, trang thiết bị máy móc 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị máy móc: 25 2.3 Thành phần môi trƣờng dùng nghiên cứu 25 2.3.1 Môi trường Czapeck bột giấy 25 2.3.2 Môi trường PDA 26 2.3.3 Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme 26 2.3.4 Môi trường YM 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp phân lập 27 2.4.2 Làm giống 28 2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào: 28 2.4.4 Tách chiết enzyme 28 2.4.5 Xác định hoạt tính cellulase (IU) DNS 29 2.4.6 Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS 30 2.4.7 Định lượng protein theo phương pháp Lowry 32 2.4.8 Điện di protein 33 2.4.9 Phương pháp finger printing 35 2.4.10 Phương pháp phân tích D – gluconic acid 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết phân lập 40 3.2 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase, xylanase phƣơng pháp DNS 41 3.3 Phân tích hoạt tính enzyme cellulase xylanase loại chất carbon khác 44 3.4 Định lƣợng protein phƣơng pháp Lowry 46 3.5 Phân tích thành phần protein hệ enzyme 47 3.6 Xác định có mặt enzyme GH61 phân tích D – gluconic acid .52 3.7 Phân nhóm dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào kỹ thuật fingerprinting 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 MỞ ĐẦU Ngày với phát triển xã hội, ngành công – nông – lâm nghiệp … phát triển cách mạnh mẽ Bên cạnh phát triển lượng chất thải từ ngành thải môi trường ngày nhiều, làm ô nhiễm môi trường sống khơng sinh vật mà cịn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới người Ngoài chất thải nhân tạo khó bị phân hủy có số chất thải có nguồn gốc từ sinh vật khó bị phân hủy điều kiện thường hay sinh vật thông thường chintin, lignocellulose, pectin… Trong lingocellulose chủ yếu Sự tồn đọng lignocellulose môi trường gây ô nhiễm mơi trường mà cịn làm đứt qng chu trình tuần hồn vật chất tự nhiên Do việc phân giải lignocellulose có vai trị quan trọng khơng mơi trường mà cịn sinh vật Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Tuy nhiên, lignocellulose chất khó bị phân giải điều kiện thường, có số sinh vật có khả phân hủy chúng Bên cạnh đó, q trình địi hỏi tham gia nhiều enzyme khác đặc biệt enzyme họ Glycoside Hydrolase Nhằm mục đích tăng suất trình thủy phân lignocellulose thành đường đơn, đường đôi từ phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đưa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống người vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), thực đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose Lignocellulose thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin (Hình 1.1) Cellulose hemicellulose đại phân tử cấu tạo từ gốc đường khác nhau, lignin polymer dạng vòng tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo hàm lượng polymer thực vật khác lồi Ngồi ra, cịn tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển điều kiện môi trường Thành phần lignocellulose trình bày bảng 1.1 [10] Hình 1.1: Thành phần lignocellulose Nguồn lignocellulose Thân gỗ cứng Thân gỗ mềm Vỏ lạc Lõi ngô Giấy Vỏ trấu Vỏ trấu lúa mì Rác phân loại Lá Hạt Giấy báo Giấy thải từ bột giấy hóa học Chất rắn nước thải ban đầu Chất thải lợn Phân bón gia súc Cỏ bờ biển Bermuda Cỏ mềm Các loại cỏ Bã thô Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [8] Lượng lớn lignocellulose thải từ ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, lượng lớn sinh khối thực vật dư thừa coi rác thải biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhiên liệu sinh học, hóa chất, nguồn lượng rẻ cho trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho người thức ăn cho động vật [10] 1.1.1 Cellulose Cellulose hợp chất hữu có công thức (C 6H10O5)n, polysaccharide gồm chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến 10.000 đơn phân D – glucose nối với liên kết 1,4 β - glucoside [6] [8] Cellulose thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật, nhiều loại tảo lớp nấm trứng (Oomycetes) Một số loài vi khuẩn chế tiết cellulose để tạo thành màng sinh học Cellulose hợp chất hữu phổ biến trái đất Khoảng 33% khối lượng khô thực vật cellulose (sợi 90%, gỗ 40 -50% gai dầu khô khoảng 75%) [9] [23] [24] Khác với carbohydrate phức tạp khác tinh bột, glycogel có cấu trúc cuộn lại phân nhánh, phân tử mở rộng cấu tạo giống hình que cứng, cellulose có cấu trúc mạch thẳng Sự khác biệt đơn phân cellulose nối với cầu nối 1,4 β – glycoside; carbohydrate khác lại liên kết 1,4 α – glycoside Nhờ đặc tính mà phân tử cellulose dai hơn, bền hơn, khó phân hủy điều kiện thường [2] [14] Cellulose cấu tạo thành chuỗi dài gồm 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose xếp đối song song tạo thành vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, sợi cạnh liên kết với liên kết hydro Các vi sợi lại liên kết với tạo thành vi sợi lớn hay cịn gọi bó mixen có đường kính 20 nm, sợi mixen có khoảng trống lớn Khi tế bào non, khoảng chứa đầy nước, tế bào già chứa đầy lignin hemicellulose Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường tìm thấy hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin chất khác, cellulose vi khuẩn tinh khiết, có hàm lượng nước cao nhiều [23] Các mạch cellulose liên kết với nhờ liên kết hydro lực Van der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc kết tinh vơ định hình Trong vùng kết kinh, phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng khó bị cơng enzyme hóa chất Ngược lại, vùng vơ định hình, cellulose liên kết lỏng lẻo nên dễ bị cơng Có hai kiểu cấu trúc cellulose đưa nhằm mô tả vùng kết tinh vơ định hình [4] Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) [4] - Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng định hướng theo chiều dài sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 A, xếp xen kẽ với vùng vơ định hình - Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều dài sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn hai điểm a b hình vẽ Các đơn vị xếp thành chuỗi nhờ vào mạch glucose nhỏ, vị trí dễ bị thủy phân Đối với đơn vị lặp lại, hai đầu vùng vơ định hình, vào giữa, tính chất kết tinh cao Trong vùng vơ định hình, liên kết β – glucoside monomer bị thay đổi góc liên kết, cuối đoạn gấp, ba phân tử monomer xếp tạo thay đổi 180 cho tồn mạch Vùng vơ định hình dễ bị công tác nhân thủy phân vùng tinh thể thay đổi góc liên kết liên kết cộng hóa trị (β – glucoside) làm giảm độ bền nhiệt động liên kết, đồng thời vị trí khơng tạo liên kết hydro Nhiều tính chất cellulose phụ thuộc vào độ dài chuỗi mức độ trùng hợp, số lượng đơn phân glucose tạo nên phân tử polymer Cellulose từ bột gỗ có độ dài chuỗi điển hình 300 1700 đơn phân, sợi thực vật khác cellulose vi khuẩn có độ dài chuỗi khác nhau, từ 800 đến 10.000 đơn phân [5] Các phân tử với chiều dài chuỗi nhỏ kết từ phân hủy cellulose, gọi cellodextrin, trái ngược với chuỗi cellulose dài, cellodextrin thường hòa tan nước dung môi hữu Một số động vật, đặc biệt động vật nhai lại mối, tiêu hóa cellulose với giúp đỡ vi sinh vật sống cộng sinh ruột Con người tiêu hóa cellulose chừng mực [13], nhiên chủ yếu hoạt động chất hỗ trợ tiêu hóa thường gọi "chất xơ" Cellulose dùng công nghiệp ngày chủ yếu lấy từ bột giấy Chúng chủ yếu sử dụng để sản xuất bìa giấy, phạm vi nhỏ chuyển thành sản phẩm dẫn xuất giấy bóng kính tơ nhân tạo Chuyển đổi cellulose từ trồng nhiên liệu vào nhiên liệu sinh học ethanol cellulosic nghiên cứu nguồn nhiên liệu thay 1.1.2 Hemicellulose Hemicellulose polymer carbohydrate phức tạp chiếm 25-30% tổng trọng lượng khơ gỗ Nó polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp cellulose [12] Nó thường tìm thấy liên kết với cellulose thành tế bào thứ cấp thực vật, chúng có mặt thành tế bào sơ cấp [19] Hemicellulose thuật ngữ nhóm homo - heteropolymer bao gồm đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, nhóm thế: L – arabinose, acid – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic D – glucuronic Các phân tử đường liên kết với liên kết 1,4 β 1,3 β – glycoside Sự khác biệt với cellulose hemicellulose có phân nhánh với chuỗi bên ngắn gồm loại đường khác nhau; đó, chúng dễ bị thủy phân so với cellulose [12] Thành phần hemicellulose gỗ cứng glucuronoxylan gỗ mềm Glucomannan Glucuronoxylan gỗ cứng thực vật thân thảo gồm mạch 1,4 β – D – xylan với nhóm 1,2 α – – O – methyl – D – giucuronic acid (hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose (Hình 1.3) Xylan trong gỗ mềm thực vật thân thảo khác với xylan gỗ cứng chỗ chúng có arabinofuranose liên kết với mạch xylan liên kết 1,3 α (Hình 1.4) [20] 18 Sinnott, M L (1990) "Catalytic mechanisms of enzymatic glycosyl transfer" Chem Rev, 90, 1171-1202 19 Slavin, JL; Brauer, PM; Marlett, JA (1981) "Neutral detergent fiber, hemicellulose and cellulose digestibility in human subjects", The Journal of Nutrition, 111 (2): 287–97 20 Thomas W Jeffries (1994), “Biodegradation of lignin and hemicelluloses”, Biochemistry of Microbial Degradation, 233-277.hemi4 21 Updegraff DM (1969) "Semimicro determination of cellulose in biological materials".Analytical Biochemistry, 32 (3): 420–424 22 W Boerjan, J Ralph, M Baucher (2003), "Lignin bios", Ann Rev Plant Biol, 54 (1), 519–549 Các nguồn khác 23 http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose 24 http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html 25 http://en.wikipedia.org/wiki/Lignin 62 PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NGUỒN GỐC CỦA 40 CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP ĐƢỢC Kí hiệu STT chủng FEC 500 FEC 501 FEC 502 FEC 504 FEC 505 FEC 507 FEC 508 FEC 509 FEC 511 10 FEC 512 11 FEC 513 12 FEC 514 13 FEC 515 14 FEC 516 15 FEC 517 16 FEC 518 17 FEC 519 18 FEC 520 19 FEC 521 20 FEC 523 21 FEC 531 22 FEC 532 23 FEC 534 24 FEC 535 25 FEC 536 26 FEC 537 27 FEC 538 28 FEC 540 29 FEC 543 30 FEC 544 31 FEC 545 32 FEC 546 33 FEC 447 34 FEC 548 35 FEC 550 36 FEC 551 37 FEC 552 38 FEC 553 39 FEC 554 40 FEC 556 65 PHỤ LỤC 2: HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC FEC 504 FEC 513 FEC 515 66 FEC 516 FEC 518 FEC 519 67 FEC 520 FEC 521 FEC 523 68 FEC 532 FEC 538 FEC 544 69 FEC 546 FEC 548 70 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐO OD540 (XYLANASE) THEO PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNS Kí hiệu chủng FEC 514 FEC 514A FEC 514W FEC 515 FEC 515A FEC 515W FEC 516 FCE 516A FEC 516w FEC 519 FEC 519A FEC 519W FEC 523 FEC 523A FEC 523W FEC 534 FEC 534A FEC 534W FEC 544 FEC 544A FEC 544W FEC 550 FEC 550A FEC 550W FEC 551 FEC 551A FEC 551W FEC 552 FEC 552A FEC 552W STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 71 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ ĐO OD660 THEO PHƢƠNG PHÁP LOWRY Đƣờng chuẩn BSA: Kết đo OD STT Kí hiệu chủng FEC 514 FEC 514A FEC 514W FEC 515 FEC 515A FEC 515W FEC 516 72 FCE 516A FEC 516w 10 FEC 519 11 FEC 519A 12 FEC 519W 13 FEC 523 14 FEC 523A 15 FEC 523W 16 FEC 534 17 FEC 534A 18 FEC 534W 19 FEC 544 20 FEC 544A 21 FEC 544W 22 FEC 550 23 FEC 550A 25 FEC 551 26 FEC 551A 27 FEC 551W 28 FEC 552 29 FEC 552A 30 FEC 552W 73 ... (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), thực đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose Lignocellulose... glycoside hydrolase 61 phân loại dựa vào việc đo lường hoạt động endo-1,4-β-D-glucanase số thành viên họ hoạt động enzyme yếu Khác với enzyme GH khác, enzyme họ GH61 khơng có khả thủy phân liên kết glycoside... pháp phân lập Các loại mẫu lấy địa điểm thời gian khác Các mẫu có chứa nấm mốc pha loãng dung dịch muối NaCl 0.9% Sau nấm mốc phân lập mơi trường Czapeck bột giấy Quy trình tiến hành phân lập