Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim trên thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MẦU VĂN CẢNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MẦU VĂN CẢNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Ngô Duy Thìn PGS.TS Nguyễn Lai Thành HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, Phòng đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Tế bào, Trƣờng đại học khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Bộ môn Mô – Phô học trƣờng Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp tơi suốt q trình làm việc thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngơ Duy Thìn ngƣời thầy hết lịng giúp đỡ, dìu dắt hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Lai Thành ngƣời thầy hết lịng giúp đỡ, dìu dắt hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô hội đồng chấm luận văn có ý kiến đóng góp quý báu, học cho đƣờng nghiên cứu khoa học Tôi chân thành cảm ơn đồng nghiệp bạn bè giúp đỡ động viên q trình hồn thành luận văn Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn đến cha, mẹ gia đình ngƣời bên động viên, chia sẻ khó khăn dành cho tơi điều kiện thuận lợi Học viên Mầu Văn Cảnh LỜI CAM ĐOAN Tôi Mầu Văn Cảnh, học viên lớp cao học khóa 24 chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên,ĐHQGHN, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Ngơ Duy Thìn PGS.TS Nguyễn Lai Thành Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Mầu Văn Cảnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN MÔ, TỔ CHỨC VAN TIM 1.2 MỘT SỐ VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN PHƢƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠNH SÂU MÔ VAN TIM 1.2.1 Khử trùng hỗn hợp kháng sinh .7 1.2.2 Môi trƣờng bảo quản 1.2.3 Tốc độ hạ nhiệt độ .12 1.2.4 Nhiệt độ bảo quản .14 1.2.5 Rã đông loại bỏ dung dịch bảo quản 15 1.3 Một số quy trình bảo quản van tim ngƣời số ngân hàng van tim giới .17 1.4 GIẢI PHẪU MÔ HỌC VAN TIM .20 1.4.1 Cấu trúc chung van động mạch chủ 21 1.4.2 Cấu trúc vi thể siêu vi thể van động mạch chủ 22 1.5 KHẢ NĂNG SỐNG VÀ THẢI GHÉP CỦA TẾ BÀO MÔ VAN TIM SAU BẢO QUẢN 26 1.5.1 Khả sống nguyên bào sợi .26 1.5.2 Khả sống tế bào nội mô 28 1.5.3 Khả thải ghép mô van tim 29 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 31 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Phân nhóm nghiên cứu 31 2.2.2 Thiết kế thí nghiệm 32 2.2.3 Phƣơng pháp, kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 32 2.2.4 Đánh giá kết bảo quản lạnh sâu van tim .35 2.2.5 Đạo đức nghiên cứu 38 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM 39 3.1.1 Kết lấy mẫu nghiên cứu 40 3.1.2 Kết thực qui trình xử lý bảo quản van tim .42 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VAN TIM SAU BẢO QUẢN 48 3.2.1 Hình thái đại thể 49 3.2.2 Hình thái vi thể 50 3.2.3 Hình thái siêu vi thể 53 3.2.4 Chất lƣợng sống tế bào mô van tim 58 3.2.5 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng mô van tim sau bảo quản 61 KẾT LUẬN 65 KHUYẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BME : Basal Medium Eagle/ Môi trƣờng CPA : Cryoprotectant agents /Chất bảo vệ lạnh DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO : Dimethylsulphoxide FBS : Fetal bovine serum / Huyết bào thai bò GAGs : Glycosaminoglycans H.E : Hematoxyline Eosin/ Nhuộm với Hematoxyline Eosin M199 : Medium 199/ Môi trƣờng 199 RPMI-1640 : Roswell Park Memorial Institute medium 1640/ Môi trƣờng RPMI1640 TEM : Transmission electron microscopy/ Hiển vi điện tử truyền qua DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt quy trình bảo quản số ngân hàng van tim châu Âu 18 Bảng 1.2 Tóm tắt quy trình bảo quản số ngân hàng van tim Bắc Mỹ 19 Bảng 1.3 Tóm tắt quy trình bảo quản số ngân hàng van tim Châu Á - Úc Nam Phi 20 Bảng 3.1 Kết kiểm tra quy trình lấy van tim 40 Bảng 3.2 Kết thực qui trình xử lý bảo quản van tim 42 Bảng 3.3 Kết cấy khuẩn nấm mẫu van tim bảo quản bƣớc lấy tim, xử lý van tim bảo quản 43 Bảng 3.4 Tổng hợp kết quan sát cấu trúc đại thể van tim nhóm nghiên cứu 49 Bảng 3.5 Tổng hợp kết quan sát cấu trúc vi thể van tim nhóm nghiên cứu tiêu nhuộm H.E nhuộm Masson 52 Bảng 3.6 Kết tỷ lệ sống ngun bào sợi mơ van tim nhóm bảo quản lạnh sâu 58 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình hình thành tinh thể đá ngồi tế bào Hình 1.2 Mơ hình hình thành tinh thể đá tế bào Hình 1.3 Mơ hình CPA bảo vệ mơ, tế bào bảo quản lạnh sâu 11 Hình 1.4 Cơ chế vật lí biến đổi tế bào tốc độ hạ nhiệt độ khác bảo quản lạnh 13 Hình 1.5 Hình ảnh van tim, nhìn từ xuống 21 Hình 1.6 Hình vẽ van tim cắt dọc 22 Hình 1.7 Hình ảnh sợi collagen sợi chun van động mạch chủ (A) ảnh hiển vi quang học (B) ảnh hiển vi điện tử quét 24 Hình 1.8 Hình ảnh tiêu nhuộm H-E lớp van tim 25 Hình 2.1 Sơ đồ mơ hình nghiên cứu 32 Hình 2.2 Lấy ba van làm mẫu nghiên cứu .33 Hình 2.3 Sơ đồ lấy mẫu van tim nghiên cứu 33 Hình 3.1 Hình ảnh đại thể mơ van tim trƣớc bảo quản sau bảo quản lạnh 49 Hình 3.2 Hình ảnh vi thể mơ van tim sau bảo quản tháng mơi trƣờng có FBS 50 Hình 3.3 Hình ảnh vi thể mô van tim sau bảo quản tháng 51 Hình 3.4 Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua van tim sau bảo quản tháng Hình A, hình B độ phóng đại 2890 lần; hình C độ phóng đại 11560 lần .54 Hình 3.5 Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua van tim sau bảo quản tháng, độ phóng đại 2900 lần 54 Hình 3.6 Hình ảnh nhuộm Trypan Blue nguyên bào sợi mô van tim trƣớc sau bảo quản với độ phóng đại 300 lần 58 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý tim mạch, có bệnh van tim gia tăng giới Mỗi năm có gần 300.000 ngƣời cần thay van tim, dự báo lên tới 850.000 ngƣời trƣớc năm 2050 [89] Có loại van tim đƣợc sử dụng thay van bệnh lý là: van học van sinh học bao gồm: van nhân tạo sinh học từ động vật van đồng loài (homograft) Thực tế, van sinh học đƣợc ƣu tiên sử dụng trung tâm phẫu thuật tim mạch giới [79] Ví dụ Đức, năm 2008 tổng số 12000 bệnh nhân có tới 78% bệnh nhân ghép van sinh học, 21% ghép van học 1% van đƣợc sửa [27] Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ động vật nhƣ lợn, bò , qua khâu xử lý, có ƣu điểm phải sử dụng thuốc chống đơng, nhƣng lại có thời gian sử dụng ngắn, khoảng 6-8 năm ngƣời trẻ tuổi Để giải tình trạng này, nhiều nhà khoa học sử dụng van tim từ ngƣời cho chết não, cịn tế bào sống để ghép đồng lồi Trong giai đoạn đầu kỹ thuật ghép van tim tƣơi – tức lấy van + bảo quản tƣơi + sử dụng vòng tuần Tuy nhiên, việc lấy ghép van tim tƣơi từ ngƣời cho chết não thƣờng bị động, mô van tim sống đƣợc thời gian ngắn Vì việc chuẩn bị bệnh nhân để ghép phải khẩn trƣơng Trong nhiều trƣờng hợp kích thƣớc van tim ngƣời cho ngƣời nhận không phù hợp Để khắc phục tƣợng này, nhằm chủ động đƣợc nguồn cho nguồn nhận, nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu quy trình bảo quản van tim phục vụ cấy ghép đồng loài Việc bảo quản van tim, mạch máu nhằm giúp cho bác sỹ lâm sàng ln có đƣợc nguồn van tim dự trữ để sử dụng cách chủ động phù hợp với kích cỡ, chủng loại bệnh nhân cần thay Van tim lấy từ đồng lồi vừa khơng cần dùng thuốc chống đơng, lại sử dụng đƣợc tới 20 năm thối hóa, có ƣu vƣợt trội van tim nhân tạo khác 37 Kelvin G.M, Albert E.H., et al (2011), “Guidance for Removal of Fetal Bovine Serum from Cryopreserved Heart Valve Processing”, Cell Tissues Organs, 193(3), pp 264-273 38 Kelvin G.M., Brockbank, Albert E Heacox, and K SchenkeLayland (2011), “Guidance for Removal of Fetal Bovine Serum from Cryopreserved Heart Valve Processing”, Cells Tissues Organs, 193(4), pp 264-273 39 Kelvin G.M., et al (1992), “Effects of storage temperature on viable bioprosthetic heart valves”, Cryobiology, 29(5), pp 537-542 40 Kelvin G.M., et al (2006), “Tissue Preservation”, Advances in Biopreservation, pp 157-186 41 Kelvin G.M., et al (2011), “Allogeneic Heart Valve Storage Above the Glass Transition at −80°C”, The Society of Thoracic Surgeons, 91(6), pp 1829-1835 42 Ketheesan N., Kearney J.N and Ingham E (1996), “The effect of cryopreservation on the immunogenicity of allogeneic cardiac valves”, Cryobiology, 33(1), pp 41-53 43 KGM, B (1990), “Cell viability in fresh, refrigerated, and cryopreserved human heart valve leaflets”, Ann Thorac Surg, 49, pp 848-849 44 Lang S.J, G.M., Carlon-Cardo C, Summers B.D, StatianoCoico L, Hajjar D.P (1994), “Biochemcal and cellular characterization of cardiac valve tissue after cryopreservation or antibiotic preservation”, J Thorac Cardiovasc Surg, 108, pp 63-67 45 Leeming J.P, L.A., Hunt C.J (2005), “Residual antibiotics in allograft heart valve tisue samples following antibiotic disinfection”, J Hosp Infect, 60, pp 231-234 46 Lu J.H, C.Y., Sung H.W, Hwang B, Chong C.K, Chen S.P, Mao S.J, Yang P.Z, Chang Y (1997), “XTT-colorimetric assay as a marker viability in cryoprocessed cardiac valve”, J Mol Cell Cardiol, 29, pp 1189-1194 47 Lupinetti F.M, C.J., King D.M, Khatib H.E, and T.S (1991), “Immunogenicity, antigenicity, and endothelial viability of aortic valves preserved 4C in a nutrient medium”, J Cardiac Surg, 6, pp 454-461 48 Lupinetti F.M, K.J., Rekhter M.D, Brockbank K.G.M, Gordon D (1997), “Procollagen production in fresh and cryopreserved aortic valve grafts”, J Thorac Cardiovasc Surg, 113, pp 102-107 49 Lupinetti F.M, T.T., Kneebone J.M, Bove E.L (1993), “Effect of cryopreservation on the presence of endothelial cells on human valve allografts”, J Thorac Cardiovasc Surg, 106, pp 912-917 50 Mirabet, V., et al (2008), “Long-term storage in liquid nitrogen does not affect cell viability in cardiac valve allografts”, Cryobiology, 57(2), pp 113-121 51 and Misfeld, M and H.H Sievers (2007), “Heart valve macro- microstructure”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 362(1484), pp 1421-1436 52 Mitchell R.N, J.R., Schoen F.J (1995), “Structure-function correlations in cryopreserved allograft cardiac valves”, Ann Thorac Surg, 60, pp 108-113 53 Mochtar B, V.D.K.A., Jongh E.J., Nauta J (1984), “Cell survival in canine aortic heart valves stored in nutrient medium”, Cardiovasc Res, 18, pp 497-501 54 Mohan R, F.X., Walter P, Herman A (1993), “Cryopreserved heart valve allografts can have a normal endothelium”, J Thorac Cardiovasc Surg, 106, pp 912-917 55 Moreno-Cabral C.E., et al (1988), “A simple technique for aortic valve replacement using freehand allograft”, J Cardiovasc Surg, 3, pp 69-76 56 N.D., B (1978), “The observation of collagen and elastin structures in wet whole mounts of pulmonary and aortic leaflets”, J Thorac Cardiovasc Surg, 75, pp 121-130 57 Nakayama S., Ban T., and Okamoto Y (1994), “Fetal bovine serum is not necessary for the cryopreservation of aortic valve tissues”, J Thorac Cardiovasc Surg, 10(3), pp 583-586 58 warm Niwaya K, S.H., Kawachi K and Kitamura S (1995), “Effect of ischemia and cryopreservation on cell viability of human allograft valves”, Ann Thorac Surg, 60, pp 114-117 59 Niwaya, K., et al (1993), “Cell viability assessment of cold- preserved (4 degrees C) and cryopreserved (-196 degrees C) allograft valves by flowcytometric analysis”, Nihon Kyobu Geka Gakkai Zasshi, 41(8), pp 1335-1340 60 O’Brien M.F., et al (1987), “A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies”, The Joural of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 94(6), pp 812-823 61 O’Brien M.F., et al (1991), “Allograft aortic valve replacement comparative clinical analysis of the viable cryopreserved and antibiotic 40 62 C store valve”, J Cardiovasc Surg, 6, pp 534-543 O'Brien M.F, et al (1987), “The viable cryopreserved allograft aortic valve”, J Card Surg, 2, pp 153-167 63 Parker.R (2010), “Banking of heart valves”, Essentials of tissue banking, 1, pp 69-80 64 Peruzzo, A.M., F.D da Costa, and W.M Abrahao (2006), “Microbiologyc control in human heart valves”, Arq Bras Cardiol, 87(6), pp 778-782 65 M.H, Quigley R.L, S.D., Victor T.A., Goldschmidt R.A, Salinger Arentzen C.E, Alexander J.C, Anderson R.W (1995), “Modulation of alloreactivity in transplant recipients by phenotypic manipulation of donor endothelium”, J Thorac Cardiovasc Surg, 109, pp 905-909 66 Quintana A.B., Coda Zabetta C.D., and Baumgartner N.O (2009), “Morphological and biochemical analysis of human cardiac valve allografts after an increment of the cryostorage temperature”, Cryobiology, 59(1), pp 96-101 67 Richard N.M., et al (1998), “Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants”, J Thorac Cardiovasc Surg, 115, pp 118-127 68 Robert T.M., Kelvin G.M., and Haney L.B (1987), “Method for cryopreserving heart valves”, United States Patent, US4890457 69 Rocca F.D, S.S., Guidolin D, Bertiplaglia B, Gerosa G, Casarotto D, Pauletto P (2000), “Cell composition of the human pulmonary valve : a comparative study with the aortic valve-the VESALIO project”, Ann Thorac Surg, 70, pp 1594-1600 70 Ross D.N (1967), “Replacement of aortic and mitral valves with a pulmonary autograft”, Lancet, 2, pp 956-958 71 Sacks M.S, S.D.B., Hiester E.D (1998), “The aortic valve microstructure: effects of transvalvular pressure”, J Biomed, 41, pp 131141 72 Schenke-Layland, K., et al (2006), “Impact of cryopreservation on extracellular matrix structures of heart valve leaflets”, Ann Thorac Surg, 81(3), pp 918-926 73 of Schenke-Layland, K., et al (2007), “Optimized preservation extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability”, Ann Thorac Surg, 83(5), pp 1641-1650 74 Scott, M and I & Vesely (1995), “Aortic valve cusp microstructure: the role of elastin”, Ann Thorac.Surg, 60, pp S391S394 75 Song Y.C, Y.L ,Kneebone J.M, Lupinetti F.M (1997), “Effect of cryopreservation and histocompatibility on type I procollagen gene expression in aortic valve grafts”, J Thorac Cardiovasc Surg, 114, pp 421- 427 76 Stacy cryopreservation A and David techniques G for (2013), “Optimizing cryopreservation tissue solution modifications”, Cryobiology, 66(3), pp 349 77 Stradins P., et al (2004), “Comparison of biomechanical and structural properties between human aortic and pulmonary valve”, Eur J Cardiothorac Surg, 26, pp 634-639 78 Suh, H., et al (1999), “Viability and enzymatic activity of cryopreserved porcine heart valve”, Yonsei Med J, 40(2), pp 184-190 79 Thiene G, V.M (2011), “Anticalcification strategies to increase bioprosthetic valve durability”, J Heart Valve Dis, 20, pp 37-44 80 I Tominaga T, K.T., Masuda Y, Hori T, Kano M, Yasuta O, Katoh (2000), “Viability of cryopreserved semilunar valves: an evaluation of cytosolic and mitochondrial activities”, Ann Thorac Surg, 70, pp 757792 81 Van Der Kamp A.W.M, N.J (1979), “Fibroblast function and the maintenance of the aortic-valve matrix”, Cardiovasc Res., 13, pp 167172 82 Van Der Kamp A.W.M, V.W., Dongen J.M, Nauta J, Galjaard H (1981), “Preservation of aortic heart valves with maintenance of cell viability”, J Surg Res, 30, pp 47-56 83 Villalba, R., et al (2009), “Microbiological analysis of cryopreserved human heart valves after storage: a survey of banks in Spain”, Cell and Tissue Banking, 10(4), pp 345 84 Wain W.H, P.H., Riddell R.W., Ross D.N (1977), “A reevaluation of antibiotic sterilization of heart valve allografts”, Thorax, 32, pp 740-742 85 C.L.J, Wassenaar C, W.E., Van Herwerden, L.A, Aghai Z, Van Tricht Bos E (1995), “Cracks in cryopreserved aortic allografts and rapid thawing”, Ann Thorac Surg, 60, pp 165-167 86 Waterworth P.M, L.E., Bery E.M, Pearce H.M (1974), “A critical investigation into the antibiotic sterilization of heart valve homograft”, Thorax, 29, pp 432-436 87 Wee LingHeng, et al (2013), “International Heart Valve Bank Survey: A Review of Processing Practices and Activity Outcomes”, Journal of Transplantation, 2013, pp 11 88 Wolfinbarger L., B.K.G., Hopkins R.A (2005), “Application of Cryopreservation to Heart Valves”, Cardiac Reconstructions with Allograft Tissues, Springer 89 Yacoub, M.H., Takkenberg, J.J.M (2005), “Will heart valve tissue engineering change the world?”, Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 2, pp 60-61 90 Yacoup M, K.C (1970), “Sterilization of valve homografts by antibiotic solutions”, Circulation, 41, pp 29-32 91 Yankah A.C, D.W., Wottge H.U, Muller-Rucholtz W, Bernhard A (1986), “Kinetics of endothelial cells preserved aortic valve allografts used for heterotopic transplantation in inbred rat strains”, Yorke Medical Books, pp 73-84 92 Yankah A.C, R.G., Wottge H.U, Bernhard A (1985), “Factors influencing endothelial-cell viability during procurement and preservation of valve allografts”, Springer-Verlag Heidelberg, pp 107-111 93 Yankah A.C., Miller D.C., and Ross D N (1987), Cardiac Valve Allografts, Steinkopff Verlag Darmstadt Springer-Verlag, New York MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Phiếu đọc kết tiêu nhuộm Hematoxylin – Eosin tiêu nhuộm Masson Nhóm: Sự xếp lớp tế bào nội mô liên tục (+/++/+++) Mật độ phân bố nguyên bào sợi đồng (+/++/+++) Có phù nề mơ kẽ (+/-) Sợi collagen liên tục, mềm mại (+/-) ... ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM 39 3.1.1 Kết lấy mẫu nghiên cứu 40 3.1.2 Kết thực qui trình xử lý bảo quản van tim .42 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VAN. .. tim sau bảo quản giúp đơn vị, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim thực nghiệm? ?? với hai mục tiêu: Đánh giá hiệu xử lý van tim khía cạnh vi sinh để ứng dụng làm... sử dụng van đồng loài bảo quản lạnh sâu toàn giới [62] Năm 2011, Kelvin G.M cộng nghiên cứu thực nghiệm bảo quản 15 van tim cừu kỹ thuật bảo quản lạnh khơng hình thành tinh thể đá Các van tim