Nghiên cứu tạo hoạt chất mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa của hoạt chất trên động vật thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG MAI LINH NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOẠT CHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG MAI LINH NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOẠT CHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm lòng biết ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Tun, Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu hướng dẫn, tạo điều kiện trang thiết bị, hóa chất để tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy cho hội thực luận văn phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận văn thực kinh phí đề tài cấp Bộ quốc phòng “Nghiên cứu bào chế viên nang chứa phytosome mangostin chiết xuất từ vỏ măng cụt dùng cho đội làm việc điều kiện độc hại” Thiếu tá, Ths Đoàn Thanh Huyền chủ nhiệm Tơi xin cảm ơn tập thể phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học bảo, giúp đỡ chia sẻ tận tình cho tơi kinh nghiệm chun mơn q trình làm thực nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn lịng biết ơn tới thầy cô Khoa sinh học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho trình học tập Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên tinh thần để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2018 Học viên Hoàng Mai Linh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hoạt chất α- mangostin 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Cấu trúc hóa học 1.1.3 Hoạt tính sinh họ 1.2 Phytosome 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Thành phần p 1.2.3 Phân loại, vai trò 1.2.4 Ưu nhược điểm p 1.2.5 Một số phương p 1.2.6 Một số phương pháp đánh giá tương tác hoạt chất phospholipid phytosome 1.3 Peroxidase 1.4 Peroxy hóa lipid 1.5 Giới thiệu số vi sinh vật gây bệnh ngƣời 1.5.1 Staphylococcus a 1.5.2 Candida albican 1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome 1.6.1 Trên giới 1.6.2 Ở Việt Nam CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu hóa chất ii 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất 2.2 Các thiết bị thí nghiệm Các thiết bị sử dụng thí nghiệm đƣợc liệt kê bảng 2.3 Động vật thí nghiệm 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Tách chiết ti 2.4.2 Sắc ký cột (Col 2.4.3 Sắc ký mỏn 2.4.4 Phương pháp sắ 2.4.5 Phương pháp 2.4.6 Phương pháp đánh giá khả tạo phức hoạt chất phospholipid 2.4.7 Xác định hoạt t 2.4.8 Xác định hoạt đ 2.4.9 Xác định làm lư 2.4.10 Xác định hàm lượng protein 2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự 2.4.12 Xử lý số liệu CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 3.2 Điều chế mangostin phytosome 3.3 Đánh giá tƣơng tác hoạt chất phospholipid phytosome 3.3.1 Phân tích phổ h 3.3.2 Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 3.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phytosome mangostin 3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa động vật thực nghiệm 3.5.1 Ảnh hưởng mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase gan 43 iii 3.5.2 Ảnh hưởng mangostin phytosome lên hàm lượng MDA gan chuột 45 3.5.2 Ảnh hưởng mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH gan chuột 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Chromono Hình 1.2 Cấu trúc khung xương phân tử xanthone Hình 1.3 Cấu trúc hóa học α- mangostin Hình 1.4 Cấu tạo phytosome Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo phosphatidylcholin 10 Hình 1.6 Cấu trúc nhân hem peroxidase 13 Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus 14 Hình 1.8 Hình dạng nấm Candida albicans 15 Hình 2.1 Quy trình tinh α-mangostin từ vỏ măng cụt Garcinia mangostana L 23 Hình 2.2 Sơ đồ bào chế mangostin phytosome 27 Hình 2.3 Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce 30 Hình 2.4 Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn 31 Hình 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 33 Hình 3.2 Ảnh chạy sắc kí mỏng sản phẩm tinh α-mangostin 34 Hình 3.3 Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể 36 Hình 3.4 Phổ HPLC hoạt chất α- mangostin 36 Hình 3.5 Quá trình bào chế mangostin phytosome 39 Hình 3.6 Phổ hồng ngoại mẫu α- mangostin 40 Hình 3.7 Hấp thụ huỳnh quang phức mangostin phytosome 41 Hình 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn α-mangostin mangostin phytosome nấm Candida albicans (A) vi khuẩn Staphylococcus aureus (B) 42 Hình 3.9 Hoạt độ peroxidase gan chuột tác dụng mangostin phytosome 44 Hình 3.10 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan tác dụng mangostin phytosome 46 Hình 3.11 Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH gan tác dụng mangostin phytosome 48 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng thí nghiệm 20 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 20 Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21 Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 21 Bảng 2.5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất 22 Bảng 3.1 Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô 35 Bảng 3.2 Số liệu phân tích phổ HPLC mẫu α- mangostin tinh 37 Bảng 3.3 Hiệu suất trình điều chế mangostin phytosome 38 Bảng 3.4 Hoạt độ peroxidase gan chuột 44 Bảng 3.5 Hàm lượng MDA gan chuột tác dụng phytosome mangostin 46 Bảng 3.6 Hàm lượng nhóm -SH gan chuột tác dụng phytosome mangostin 48 vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân DMSO Dimethyl sulfoxide DSC Phân tích nhiệt vi sai ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EP Ether petroleum EtOAC Ethyl acetate EtOH Ethanol FTIR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi HPLC High-performance liquid chromatography HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin) LB Luria broth LDL Low density lipoprotein MDA Malondialdehyde MeOH Methanol MIC Minimum inhibitory concentration OD PC Optical density PDI Chỉ số phân bố KTTP Rf Retention factor SD Standard deviation SDA Sabouraud dextrose agar SDS Sodium dodecyl sulfate -SH Nhóm sulfhydryl SEM Kính hiển vi điện tử quét SKD Sinh khả dụng SOD Superoxide dismutase Phosphatidylcholin vii TB Trung bình TBA Thiobarbituric acid TL Trọng lượng TLC Thin layer chromatography TMB 3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine TN Thí nghiệm TT Thể trọng XRD Nhiễu xạ tia X (XRay diffraction) viii 35 Mahabusarakam, W., Proudfoot, J., Taylor, W., Croft, K (2000), "Inhibition of lipoprotein oxidation by prenylated xanthones derived from mangostin", Free Radic Res, 33(5): pp 643-659 36 Misra, H., Dwivedi, B.K., Mehta, D., Mehta, B.K., Jain, D.C (2009), “Development and validation of high performance thin-layer chromatographic method for determination pericarp of of mangosteen alpha-mangostin in plant mangostana (Garcinia fruit L.) using ultraviolet visible detection”, Records of Natural Products, (4): pp 178-186 37 Nakatani, K., Atsumi, M., Arakawa, T., Oosawa, K., Shimura, S., Nakahata, N., Ohizumi, Y (2002) “ Inhibition of histamine release and protaglandin E2 synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant” Biol Pharm Bull, 25 (9): pp, 1137-1141 38 Patel Amit, Tanwar Y.S, Suman Rakesh, Patel poojan (2013),“Phytosome: Phytolipid Drug Dilivery System for Improving Bioavailability of Herbal Drug”, Journal of Pharmaceutical Science and Bioscientific Research, 3(2), pp 51-57 39 Pimchan, “Synergy 40 and mechanism T., of action Maensiri, of α‐mangostin D., Eumkeb, G (2017), and ceftazidime against ceftazidime‐resistant baumannii” Applied Microbiology 65 (4) Acinetobacter Pereira-Lachataignerais Panizza J., Pons R., P (2006), "Study and formation of vesicle systems with low polydispersity index by ultrasound method", Chem Phys Lipids, 140(1-2), pp 88-97.41 Pothitirat, W., Chomnawang, T.M., Gritsanapan, W (2009), “ Antiacne inducing bacteria activity and alpha-mangostin content of Garcinia mangostana fruit rind extracts from different provenience”, Songklanakarin J Sci Technol, 31 (1): pp 41-47 42 Sakagami, Y., Iinuma, M., Piyasena, K.G., Dharmaratne, H.R (2005)“Antibacterial activity of alpha-mangostin against vancomysin resistant Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics”, Phytomedicine, 12 (3): pp 203-208 43 Szymonik-Lesiuk, S., Czechowska, G., Stryjecka- Zimmer, M., Slomka, M., Madro, A., Celinski, K., Wielosz, M (2003), "Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication", J Hepatobiliary Pancreat Surg, 10(4): pp 309-315 44 Shibata, M A., Iinuma, M., Morimoto, J., Kurose, H., Akamatsu, K., Okuno, Y., Akao, Y., Otsuki, Y (2011), pericarp “ Alpha- of the Mangostin mangosteen extracted (Garcinia from the mangostana Linn) reduces tumor growth and lymph node metastatic mammary cancer carying a p53 mutation”, BMC Med, 9: pp 69 45 Sineewan, P., Mullika, C., Kittipot, S., Benjawan, D., Glyn, H., Griangsak, E (2016), “Synergism and the mechanism of action of the combination of αmangostin isolated from Garcinia mangostana L and oxacillin against an oxacillin-resistant Staphylococcussaprophyticus”, BMC Microbiology, 16: pp 195 46 Solmaz Rasaie, Saeed Ghanbarzadeh, Maryam Mohammadi, Hamed Hamishehkar, Quercetin: (2014), A “Nano Promising fortification of Phytosomes of Formulation Food for Products with Antioxidants”,Pharmaceutical sciences, 20, pp 96101 Sivaranjani, 47 M., Prakash, M., Gowrishankar, S., Rathna, J., Pandian, S.K., Ravi, A.V (2017), “In vitro activity of alpha-mangostin in killing and eradicating biofilms” Applied Microbiology and Biotechnology, 101 (8): pp 2249-3359 48 Sun, D., Antioxidant system and its effect on K562 leukemia cell line in photodynamic (Shanghai), 41 (12): pp 309-315 49 Semalty, A., Semalty M., Singh D., Rawat M S M (2010), phospholipid complexes of naringenin for effective drug delivery”, J Incl Phenom ap 50 253-260 Werayut, P., Gritsanapan, W (2008), "Quantitative analysis of total mangostins in Garcinia mangostana fruit rind", J Health Res, 22(4): pp 161-166 51 Wang, F., Ma, H., Liu, Z., Huang, W., Xu, X., Zhang, X (2017), “ α - Mangostin inhibits DMBA/TPAinduced skin cancer through inhibiting inflammation and promoting autophagy and apoptosis by regulating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in mice”, Biomedicine & Pharmacotherapy, 92: pp 672–680 Willets, K.A, Van Duyne, R.P (2007), “Localized 52 surface plasmon resonance spectroscopy and sensing” 53 Williams, K., P., Beilin, oxidative Ongsakul, L M., (1995), modification Proudfoot, “Mangostin of J., Croft, inhibits human low the density lipoprotein”, Free Radic Res, 23 (2): pp 175-184 54 Yuichi, Y., Nobuhiro Yoshiaki, N., Mikimoto Yoshiki N (2014), H., Chemokine (CXC Motif) Ligand 12 K., Koji N., “Function of in Periodontal Ligament Fibroblasts”, Plos One, (5) 55 Zhang, J., Chen, Q., Wang, S., Li, T., Xiao, Z., Lan, W., Huang, G., Cai, X (2017), “α-Mangostin, A Natural Xanthone, Accumulation in Induces Human Apoptosis Rheumatoid and ROS Fibroblast-Like Synoviocyte MH7A Cells”, Current Molecular Medicine (2017), 17 (5): pp 375-380 Website 56 Pubchem C9H6O2 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/c accessed: 08/04/201857 Pubchem │ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetaminoph en#section=Pharmacology-and-Biochemistry, 02/04/2018 58 Pubchem C24H26O6 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Mangostin#s ection=Information-Sources accessed: 02/04/2018 59 Fineartamerica Bacteria https://fineartamerica.com/featured/1-serrat marcescens-bacteria-sem-scimat.html 02/04/2018 60 Pubchem C13H8O2 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/xanthone#se ction=Top, accessed: 08/04/2018 PHỤ LỤC Hình P1 Hình ảnh chuột trước xử lý hóa chất nhóm chuột Hình P2 Hình ảnh chuột sau xử lý hóa chất (14 ngày) Bảng P1 Số liệu quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS mangostin phytosome mangostin Mangostin phytosome Wavelength nm 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 ... thực tế trên, tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu tạo hoạt chất mangostin phytosome đánh giá khả chống oxi hóa hoạt chất động vật thực nghiệm? ?? với mục tiêu sau: (1) Nghiên cứu tách chiết hoạt chất. .. HOÀNG MAI LINH NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOẠT CHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14... tách chiết hoạt chất mangostin sạch; (2) Nghiên cứu công nghệ tạo hoạt chất mangostin phytosome; (3) Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hoạt chất mangostin phytosome động vật thực nghiệm CHƢƠNG TỔNG