Nghiên cứu sử dụng nấm lecanicillium kí sinh côn trùng đề kiểm soát rệp hại rau

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CƠN TRÙNG ĐỂ KIỂM SỐT RỆP HẠI RAU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CƠN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Tình hình rệp hại 1.2 Thuốc diệt trùng hóa học 1.2.1 Tình hình sản xuất 1.2.2 Ưu nhược điểm 1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 1.3.1 Phân loại 1.3.2 Ưu nhược điểm 1.3.3 Tình hình nghiên cứu 1.3.4 Khả kiểm sốt rệ 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng 1.5 Ảnh hưởng môi trường lên sinh bào tử nấm Lecanicillium 1.5.1 Nguồn carbon 1.5.2 Nguồn nitơ 1.5.3 Nhiệt độ môi trường 1.5.4 Độ ẩm khơng khí đ 1.5.5 Một số yếu tố khác Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Chủng giống plasm 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Dung dịch đệm 2.1.4 Môi trường nuôi cấy Trường Đại học KHTN ii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 2.1.5 2.2 Thiết bị Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sàng lọc ch 2.2.2 Các phương 2.2.3 Xác định chủng nấm 485 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao 3.2 3.3 Định tên chủng nấm 485 Ảnh hưởng c L lecanii 485 3.3.1 Ảnh hưởng 3.3.2 Ảnh hưởng 3.3.3 Ảnh hưởng 3.3.4 Ảnh hưởng 3.3.5 Ảnh hưởng 3.3.6 Ảnh hưởng 3.3.7 Ảnh hưởng 3.3.8 Ảnh hưởng 3.3.9 Ảnh hưởng 3.3.10 Ảnh hưởng 3.3.11 Ảnh hưởng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trường Đại học KHTN iii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thiệt hại số trồng rệp Vương quốc Anh Bảng 2.1 Các dung dịch đệm 24 Bảng 2.2 Các thiết bị 25 Trường Đại học KHTN iv Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp Hình 1.2 Rệp hại trồng Hình 1.3 Vịng đời rệp Hình 2.1 Lá cải có rệp sau phun dịch bào tử nấm 26 Hình 3.1 Kết phun bào tử nấm lên rệp cải 32 Hình 3.2 Độc lực diệt rệp chủng Lecanicillium spp 33 Hình 3.3 Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA 34 Hình 3.4 Trình tự gene 28S rRNA chủng 485 (A) phân loại (B) .35 Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn chất 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô mơi trường 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ dày chất 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng độ ẩm chất 39 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 44 Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 45 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 46 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men 47 Trường Đại học KHTN v Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP -Deoxynucleoside -triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume w/v weight/volume w/w weight/weight Trường Đại học KHTN vi Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỞ ĐẦU Rệp (Aphidoidae) nhóm trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố rộng rãi vùng ôn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Chúng kí sinh 11000 lồi thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng bông, cải, cải dầu, loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39] Rệp không phá hoại trực tiếp cách chích hút nhựa mà truyền virus gây bệnh cho Hàng năm, rệp với côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng trồng toàn giới [22] Do tính chất nguy hại rệp, việc sử dụng biện pháp phòng trừ rệp cần thiết Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến sử dụng thuốc diệt trùng hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng hiệu tác dụng nhanh, thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm nhanh bị kháng côn trùng sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Với ưu điểm vượt trội độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người, thuốc diệt côn trùng sinh học coi lựa chọn có tiềm lớn xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium chi nấm có khả kí sinh tự nhiên rệp nhiều lồi trùng khác Từ năm 1960, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm sản xuất thương mại hóa Tuy nhiên, kết đạt nghiên cứu sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học hạn chế Năm 2000, giá trị thương mại thuốc diệt côn trùng sinh học sử dụng toàn giới chiếm 1,8% tổng giá trị loại thuốc diệt trùng Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium cần thiết Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế Phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện KH CN Việt Nam năm 2010-2013 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn làm chủ quản, thực đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh trùng để kiểm sốt rệp hại rau" Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học Rệp (Aphidoidae) họ lớn thuộc lớp côn trùng, động vật không xương sống, thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép cặp râu, thể bao bọc khung kitin, chiều dài từ đến 10 mm (hình 1.1) Khoảng 3700 lồi rệp biết đến giới [39] chân chân Vòi chích hút chân Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp Rệp nhóm trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố tập trung vùng ôn đới [51], rệp phân bố phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt với độ đa dạng thấp Khoảng 250 loài rệp côn trùng phá hoại nguy hiểm nông, lâm nghiệp cần kiểm soát Tuy nhiên, đứng quan điểm động vật học, rệp nhóm động vật thích nghi tốt với mơi trường nhờ khả sinh sản vơ tính [67] Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng không màu (hình 1.2) Phương thức dinh dưỡng rệp chích hút nhựa miệng có cấu tạo kiểu chích hút Khi chất dinh dưỡng trở nên nghèo nàn mật độ rệp q đơng, số lồi rệp sinh có cánh để phát tán nơi khác Nhiều lồi rệp kí sinh loài nhất, số khác chẳng hạn Myzus Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt persicae (rệp đào) kí sinh hàng trăm lồi thuộc nhiều họ khác Khi chích hút, chúng truyền virus từ bệnh sang khỏe mạnh số trồng như: khoai tây, ngũ cốc, củ cải đường, cam, quýt [36] Những vết chích hút rệp trở thành nơi bị tổn thương dễ dàng bị nấm xâm nhập gây bệnh cho A B C D Hình 1.2 Rệp hại trồng Myzus persicae (A B), Aphis gossypii (C) Aphis illinoisensis (D) Ở rệp có hai kiểu sinh sản đơn tính hữu tính Nhiều lồi có thay đổi kiểu sinh sản đơn tính hữu tính phức tạp Sự thay đổi hai kiểu sinh sản để sinh trứng ấu trùng, thay đổi chủ thân gỗ chủ thân thảo Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với thay đổi chủ [51] Mặc dù số lồi rệp có đực cái, có quần thể Vào mùa đơng, nhiệt độ thấp trứng sinh ra, mùa xuân trứng nở thành rệp Dạng sinh sản phổ biến rệp đơn tính sinh con, rệp sinh có đặc điểm giống hệt rệp mẹ ngoại trừ kích thước Q trình sinh lặp lặp lại suốt mùa hè, sinh nhiều hệ, thời gian sống hệ từ 20 đến 40 ngày, từ rệp nở vào mùa xuân sinh hàng nghìn rệp Chẳng hạn, rệp bắp cải (Brevicoryne brassicae) sinh 41 lứa rệp mùa sinh sản Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học 56 Vũ Xuân Đạt Mussen E (1990), “California crop pollination”, Gleanings in Bee Culture, 118, pp 646-647 57 Nault L R (1997), “Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis”, Ann Entomol Soc Amer, 90, pp 521-541 58 Nene Y L., Reddy M V (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”, Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp 31-32 59 Nevo E., Coll M ( 2001), “Effect of nitrogen fertilization on Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae): variation in size, color, and reproduction”, J Econ Entomol, 94(1), pp 27-32 60 Ofuya T T (1997), “Control of cowpea aphid, Aphis craccivora Koch (Homoptera: Aphididae), in cowpea, Vigna unguiculata (L.) Walp.” Integr Pest Manag Rev, 2(4), pp 199-207 61 Patel S R., Awasthi A K., Tomar R K S (2004), “Assessment of yield losses in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl Eco Environ Res, 2(1), pp 1-15 62 Pham T A., Kim J J., Kim K (2010), “Optimization of solid-state fermentation for improved conidia production of Beauveria bassiana as a mycoinsecticide”, Mycobiology, 38(2), pp 137-143 63 Pimentel D (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing Pesticide Use: Environmental and Economic Benefits, John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp 1-11 64 Pimentel D (2005), “Enviromental and economic costs of the application of pesticides primarily in the United States”, Environ Dev Sustain, 7, pp 229-252 65 Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V., Giordana S., Horowitz A., D’amore M (1993), “Assessment of environmental and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide Trường Đại học KHTN 56 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Question: Environment, Economics and Ethics, Chapman & Hall, New York, pp 47-84 66 Pimentel D., Stachow U., Takacs D A., Brubaker H W., Dumas A R., Meaney J J., O’neil J A S., Onsi D E., Corzilius D B (1992), “Conserving biological diversity in pp 67 agricultural/forestry systems”, Bioscience, 42, 354-362 Piper R., Shanahan M (2007), Extraordinary Animals: An Encyclopedia of Curious and Unusual Animals, Greenwood Press, United States 68 Raimbault M (1998), “General and microbiological aspects of solid substrate fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp 1-15 69 Razaq M., Mehmood A., Aslam M., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S (2011), “Losses in yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica juncea L and Brassica carrinata A at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp 319-324 70 Richter E D (2002), “Acute human pesticide poisonings”, Encyclopedia of Pest Management, Dekker, New York, pp 3-6 71 Ridgway R L., Tinney J C., Macgregor J T., Starlert N J (1978), “Pesticide use in agriculture”, Environ Health Perspect, 27, pp 103-112 72 Riedell W E., Catangui M A., Beckendorf E A (2009), “Nitrogen, fixation, ureide, and nitrate accumulation responses to soybean aphid injury in Glycine max”, J Plant Nutr, 32(10), pp 1674-1686 73 Rombach M C (1989), “Production of Beauveria bassiana [Deuteromycotina: Hyphomycetes] sympoduloconidia in submerged culture”, Entomophaga, 34, pp 74 45-52 Shi Y., Xu X., Zhu Y (2009), “Optimization of Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation on sugarcane bagasse”, App Microbiol Biotechnol, 82, pp 921-927 Trường Đại học KHTN 57 Luận văn thạc sĩ Sinh học 75 Vũ Xuân Đạt Shingleton A W., Sisk G C., Stern D L (2003), “Diapause in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) is a slowing but not a cessation of development”, BMC Dev Biol, 3(7), pp 1-12 76 Singh C P., Sachan G C (1994), “Assessment of yield losses in yellow sarson due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt)”, J Oilseeds Res, 11(2), pp 179-184 77 Sylvester E S (1980), “Circulative and propagative virus transmission by aphids”, Ann Rev Entomol, 25, pp 257-286 78 Tatchell G M (1989), “An estimate of the potential economic losses to some crops due to aphids in Britain”, Crop Prot, 8, pp 25-29 79 Thackray D J., Diggle A J., Berlandier F A., Jones R A (2004), “Forecasting aphid outbreaks and epidemics of Cucumber mosaic virus in lupin crops in a Mediterranean-type environment”, Virus Res, 100(1), pp 6782 80 Vu V H., Hong S I., Kim K (2007), “Selection of entomopathogenic fungi for aphid control”, J Biosci Bioeng, 104(6), pp 498-505 81 Vu V H., Hong S I., Kim K (2008), “Production of aerial conidia of Lecanicillium lecanii 41185 by solid-state fermentation for use as mycoinsecticide”, Mycobiology, 36(3), pp 183-189 82 Weiner B P., Worth R M (1972), “Insecticides: household use and respiratory impairment”, Adverse Effects of Common Environmental Pollutants, MSS Information Corporation, New York, pp 149-151 83 Xia J (1997), Biological control of cotton aphid (Aphis gossypii Glover) in cotton (inter) cropping systems in China: a simulation study, S.L Xia, Florida 84 Xu X., Yu Y., Shi Y (2011), “Evaluation of inert and organic carriers for Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation”, Biotechnol Lett, 33, pp 763-768 85 Zare R., Gams W (2001), “A revision of Verticillium sect Prostrata III Generic classification”, Nova Hedwigia, 72, pp 329-337 Trường Đại học KHTN 58 Luận văn thạc sĩ Sinh học 86 Vũ Xuân Đạt Zhang M., Tang Q., Chen Z., Liu J., Cui H., Q S., Xia Y., Altosaar I (2009), “Genetic transformation of Bt gene into sorghum (Sorghum bicolor L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 25(3), pp 418-423 87 Zhou P., Zhao Y., Li J., Wu G., Zhang L., Liu Q., Fan S., Yang X., Li X., Wu Y (2011), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study”, Environ Int, Epub ahead of print, available at http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412011001632 Trường Đại học KHTN 59 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt PHỤ LỤC Bảng 4.1 Độc lực diệt rệp cải chủng nấm Lecanicillium spp Thời gian sau phun (ngày) Đối chứng L18 L43 L85 85k 485 8514 L1185 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nguồn chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Gạo Bột gạo Cám gạo Bột ngô Bột lõi ngô + bột gạo (1:1, w/w) Bột lõi ngô + bột ngô (1:1, w/w) Bột bã mía + bột gạo (1:1, w/w) Bột bã mía + bột ngơ (1:1, w/w) Ghi chú: F = 18,57; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 60 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô môi trường lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TTBột lõi ngô: bột ngô (w/w) Ghi chú: F = 25,06; P < 0,001 Bảng 4.4 Ảnh hưởng độ dày chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Độ dày TT chất (mm) 10 Ghi chú: F = 11,50; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 61 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.5 Ảnh hưởng độ ẩm lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 14,96; P < 0,001 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 117,78; P < 0,001 Bảng 4.7 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nguồn nitơ Số lượng bào tử/g chất (x109) Ghi chú: F = 69,36; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 62 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 139,79; P < 0,001 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 16,40; P < 0,001 Bảng 4.10 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 1,96; P > 0,1 Trường Đại học KHTN 63 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.11 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 12,12; P < 0,01 Bảng 4.12 Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Ghi chú: F = 3,54; P < 0,05 Thời gian lên men (ngày) Gi Trường Đại học KHTN 64 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Vu Van Hanh, Le Thi Thuy Duong, Nguyen Huu Quan, Vu Xuan Dat, Quyen Dinh Thi, Kim Keun (2011), Improvement of Virulence of Entomopathogenic fungus Lecanicillium sp L43 towords Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi, Vu Xuan Dat, Nguyen Huu Quan, Kim Keun (2011), Virulence of Entomopathogenic Fungus Lecanicillium sp Le85 towards Cotton Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Trường Đại học KHTN 65 ... ngày phun [32] Nấm kí sinh khơng nghiên cứu để diệt côn trùng gây hại trồng, mà nghiên cứu để diệt trùng kí sinh truyền bệnh cho người vật nuôi Angelo cộng (2010) nghiên cứu khả kiểm soát rận Rhipicephalus... có tác dụng lên rệp mà cịn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét Mặc dù tiềm kiểm soát côn trùng gây hại trồng nấm Lecanicillium lớn, việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium. .. cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium cần thiết 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh trùng Để sản xuất chế phẩm diệt trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh trùng