Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN - BÙI MINH THÁI NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ HÀ NỘI – 2011 ́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN - Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chun ngành: Hóa Phân Tích Mã số: LṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Ri HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU ………………………………………………………………… Chƣơng - TỔNG QUAN ……………………………………………… 1.1 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 1.1.1 Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 1.1.2 Tính chất vật lý hố học Sulfamit, Metronidazole ………… 1.1.3 Tính chất dược lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole 1.1.5 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 1.2 Phƣơng pháp xác định……………………………………………… 1.2.1 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Sas phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………… 1.2.2 Một số cơng trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ……… Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 2.1.Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu………………… 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu ………………………………… 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu …………………………………………… 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phương pháp HPLC …… 2.2.2.Phân tích định lượng HPLC ………………………… 2.3 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết pha rắn ….………… 2.4 Hóa chất và dụng cụ…………………………………………… 21 2.4.1 Hoá chất ………………………………………………… 21 2.4.2 Dụng cụ ……………………………………………………… 22 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… 23 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………… 23 3.1.1 Chọn bước sóng detector …………………………………… 23 3.1.2 Thăm dò khả tách Sulfamit cột RP-C18 ……… 26 3.2 Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 28 3.3 Tối ƣu hóa pha động ………………………………………………… 28 3.3.1 Nồng độ đệm axetat pha động ……………………………… 28 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………… 30 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 33 3.3.4 Tốc độ pha động 35 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 38 3.4.1 Khảo sát lập đường chuẩn khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 38 3.4.2 Giới hạn phát (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) 42 3.4.3 Độ đúng, độ lặp lại phép đo ………………………………… 44 3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý và kết phân tích ………………… 48 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 48 3.5.2 Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… 51 KẾT LUẬN ……………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………… 25 Bảng 3.2: Thời gian lưu thứ tự pic chất phân tích……………… 27 Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…………… 29 Bảng 3.4: Hệ số dung tích giá trị pH khác nhau………………………… 31 Bảng 3.5: 34 Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN pha động…………… 33- Bảng 3.6: Diện tích pic chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36 Bảng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích……… 38-39 Bảng 3.8: Bảng giá trị Ftính chất phân tích 42 Bảng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43 Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 Bảng 3.11: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác 50 Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích……………… 51 Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tơm rảo…………………… 52 Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm rảo………………… 53 Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tôm chân trắng…………… 54 Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm chân trắng……………… 54 Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm sú…………………… 55 Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tơm lớt…………………… 56 Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm lớt……………………… 57 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hố axít folic thành nucle protein………………… Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ……………………………… 19 Hình 3.1: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại khả kiến Sas…………… 24 23- Hình 3.2: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector……………… 25 Hình 3.3: Thời gian lưu sulfamit…………………………………… 26-27 Hình 3.4: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…… 29 Hình 3.5: Píc sắc ký giá trị nồng độ đệm khác 29-30 Hình 3.6: Sự phụ thuộc K’ vào pH pha động 31 Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN pha động 34 Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký tỉ lệ thành phần pha động khác 34-35 Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 36 Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác pha động 37 Hình 3.12: Đường chuẩn chất phân tích khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm… 39-40 Hình 3.13: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 270nm… 40 Hình 3.14: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 320nm… 41 Hình 3.15: Sắc đồ chất phân tích với nồng độ 0,01ppm…………………43 Hình 3.16: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm … 45 Hình 3.17: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm …… 47 Hình 3.18: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm …… 48 Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm 49 Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tơm 50 Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tơm rảo phân tích thêm chuẩn… 53 Hình 3.22: Sắc đồ Hình 3.23: Đường Hình 3.24: Sắc đồ Hình 3.25: Đường Hình 3.26: Sắc đồ Hình 3.27: Đường Hình 3.28: Sắc đồ Chất phân tích SGU mV 7.0 Detector A Ch1:270nm 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 1.0 0.0 2.0 Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo 3.5.2.2 Mẫu tôm chân trắng Khối lượng mẫu thịt tươi Khối lượng mẫu sau đông khô : 30,5g Lượng nước có mẫu Bảng 3.17: Kết phân t Chất phân tích SGU Ta có phương trình hồi quy: 90000 -0.20 -0.15 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu tơm chân trắng phân tích thêm chuẩn Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm chân trắng Chất phân tích SGU 3.5.2.3 Mẫu tơm Sú Khối lượng mẫu thịt tôm tươi Khối lượng mẫu sau đơng khơ: 37,4g Lượng nước có mẫu Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Chất phân tích SGU SMP Ta có phương trình hồi quy: Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tơm sú phân tích thêm chuẩn Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm sú Chất phân tích SGU SMP mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 4.0 1.0 3.0 1/3.308 0.0 2.0 2/4.476 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 0.0 4.0 1.0 2/4.877 2.0 1/3.358 3.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú 3.5.2.4 Mẫu tôm lớt 6.0 Khối lượng mẫu tôm tươi Khối lượng mẫu sau đơng khơ: 28,4g Lượng nước có mẫu Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: B Chất phân tích SGU Ta có phương trình hồi quy: 65000 Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tơm lớt phân tích thêm chuẩn Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tơm lớt Chất phân tích SGU mV mV Detector A Ch1:270nm 10.0 1/3.485 10.0 9.0 9.0 8.0 8.0 7.0 7.0 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 1.0 1.0 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm 0.0 Mẫu chưa thêm Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt Nhận xét: Với kết xác định cho thấy mẫu tôm xuất chất dư lượng kháng khuẩn SGU Với giới hạn dư lượng sulfamit thịt thủy sản cho phép 0,1ppm( theo thơng tư số:29/2010/TT-BNNPTNT) mẫu tơm mà chúng tơi phân tích vượt mức giới hạn Với mẫu tôm sú, tôm lớt dư lượng gấp lần lượng cho phép Không phát thấy MTD, SMX, SDO, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC – UV-Vis để tách, xác định đồng thời metronidazole số sulfamit (SGU, SMP, SDO, SMX) số loại tôm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký:  Cột tách RP - C18: 25 cm × 4,6 mm; 5m  Detector UV-VIS: kênh  = 270 nm;  =320nm.Rise time = 0,1 s; Range = 0,01 AUFS  Máy ghi: tốc độ giấy = mm/phút; ghi = 10 mV  Thành phần pha động: dung dịch đệm axetat (pH = 4,5) 10mM /aceto-nitril: 80/20 (v/v)  Tốc độ pha động: ml/phút Đã đánh giá phương pháp phân tích:  Khoảng tuyến tính sulfamit: 0,05 – 1,00ppm  Giới hạn phát hiện: 0,012 – 0,029 ppm  Giới hạn định lượng: 0,040 - 0,096 ppm  Hệ số biến thiên: 0,2% – 5% khoảng nồng độ 0,08- 0,8ppm Khảo sát mẫu thực  Chọn quy trình xử lý mẫu thích hợp, hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu tơm đạt từ 71 -90%  Xác định dư lượng SGU mẫu tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm rảo:0,12±0,02ppm, tôm sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP tôm sú 0,09 ± 0,01ppm  Không phát thấy MTD, SDO, SMX, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Từ kết thu được, thấy phương pháp HPLC – Detector UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho phân tích đồng thời metronidazole chất kháng khuẩn SGU, SMP, SDO SMX tôm Chúng hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC – UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định metronidazole hợp chất thuộc họ sulfamit thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, giúp bảo vệ sức khoẻ cho người TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Đình Bính, Phạm Luận, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Phương Thanh (2007), “Xác định dư lượng chất kháng khuẩn họ sulfamit thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(1B), tr 33 – 41 Nguyễn Thị Kim Dung (2004), Xác định sulfonamide thuốc phương pháp hấp thụ nguyên tử, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Huỳnh Kim Thoa, Nguyễn Văn Thục (2006), Hoá dược tập 2, Bộ mơn hố dược, Đại học Dược, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Linh (2006), Xác định gián tiếp hàm lượng sulfamethoxazole thuốc phép đo F-AAS, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007), Nghiên cứu tách xác định đồng thời số sulfamit thức ăn chăn nuôi thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi(2003), Hóa học phân tích- Phần 2(Các phương pháp phân tích cơng cụ), Đại học Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2005), Thống kê hoá phân tích, Đại học Quốc gia Hà Nội Tiêu chuẩn ngành (2004), Sulfonamit sản phẩm thuỷ sản-Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao, 28 TCN 196:2004 10 Vũ Cẩm Tú (2009), Xác định sulfamit mẫu Dược phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên Tiếng Anh 11 A V Pereira, Q B Cass(2005), “High- performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column”, Journal of chromatography B, 826, pp 139- 146 12 Cheong, C.K., Hajeb, P.Jinap, S and Ismail-Fitry, M.R(2010), “Sulfonamides determination in chicken meat products from Malaysia’’, International Food Research Journal,17, pp 885-892 13 Craig D.C Salisbury, Jason C Sweet, Roger Munro(2004), “ Determination of sulfonamide residues in the Tissues of food animals using automated precolumn derivatization and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of AOAC international, 87( 5), pp.12641268 14 D.G Kennedy, R.J.McCracken, A.Cannavan, S.A.Hewitt (1998),“Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics on meat and milk” Journal of chromatography A, 812, pp.77-98 15 Gertraud Suhren and W Heeschen(1993) “Detection of eight sulphonamides and dapsone in milk by a liquid chromatographic method”, Analytica Chimica Acta, 275, pp 329-333 16 Hadir M Maher, Rasha M Youssef, Riad H Khalil and Sabry M ElBahr(2008), “ Simultaneous multiresidue determination of metronidazole and spiramycin in fish muscle using high performance liquid chromatography with UV detection ’’, Journal of Chromatography B, 876(2), pp.175-181 17 Han-Wen Sun, Feng-Chi Wang and Lian-Feng Ai(2007), “ Simultaneous determination of seven nitroimidazole residues in meat by using HPLC-UV detection with solid-phase extraction”, Journal of Chromatography B, 857(2), pp 296-300 18 Ivan Pecorelli, Rita Bibi, Laura Fioroni, Roberta Galarini (2004) ,“Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC”, Journal of chromatography A, 1032(1-2),pp 23-29 19 M Brandtner, W Hela, R Widek, R Suhuh (2003), “Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection”, Food Chemistry, 83, pp 601-608 20 Naser Tavakoli, Jaleh Varshosaz, Farid Dorkoosh and Mohammad R Zargarzadeh (2007), “Development and validation of a simple HPLC method for simultaneous in vitro determination of amoxicillin and metronidazole at single wavelength’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1), pp.325- 329 21 Naoto Furusawa(2000), “Simplified determining procedure for routine residue monitoring of sulphamethazine and sulphadimethoxine in milk” Journal of chromatography A, 898, pp.185 – 191 22 PVinas, C.Lopez Erroz,N.Campillo, M.Hernandez(1996), “ Determination of sulphonamides in foods by liquid chromatography with postcolumn fluorescence derivatization”, Journal of Chromatography A, 726(1-2), pp.125131 23 Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie Han(2007), “ Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization of 9-fluorenylmethyl chloroformate”, Journal of Separation Science ,30(16), pp 2647–2655 24 Richard Lindberg, Per-Åke Jarnheimer, Björn Olsen, Magnus Johansson and Mats Tysklind (2004), “Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards”, Chemosphere,57(10) ,pp.1479 -1488 25 Rodrigo H.M.M Granja, Alfredo M Montes Niño, Fernanda Rabone and Alessandro Gonzalez Salerno(2008), “A reliable high-performance liquid chromatograph with ultraviolet detection for the determination of sulfonamides in honey” , Analytica Chimica Acta , 613(1), pp 116-119 26 Ticiano Gomes Nascimento, Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macêdo(2005),’’ Simultaneous determination of ranitidine and metronidazole in human plasma using high performance liquid chromatography with diode array detection’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis , 37( 4), pp 777-783 27 Theresa A Gehring, Bill Griffinb, Rod Williams , Charles Geiseker ,Larry G Rushing , Paul H Siitonen(2006), “ Multiresidue determination of sulfonamides in edible catfish, shrimp and salmon tissues by high-performance liquid chromatography with postcolumn derivatization and fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 840,pp.132–138 28 W.M.A Niessen(1998), “Analysis of antibiotics by liquid chromatography – mass spectrometry” Journal of chromatography A, 812, pp 53 – 75 , 29 W Hela , M Brandtner, R Widek and R Schuh(2003), “ Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC–DAD for detection”, Food Chemistry,83(4), pp.601-608 30 Xiaojia Huang, Dongxing Yuan, Benli Huang (2007) ,“Simple and rapid determination of sulfonamides in milk using Ether- type column liquid chromatography”, Talanta ,72 ,pp.1298 -1301 31 Wang P, Li J, Zheng H.(2007), “ Simultaneous determination of seven sulfonamides and metronidazole and chloramphenicol in cosmetics by high performance liquid chromatography’’, Chineses journal of chromatography, 25(5), pp.743-746 32 Wikipedia, “the free encyclopedia (2005), sulfonamide (medicine)” Http://en.wikipedia.org/wiki/Sulfonamide (medicin) 33 Http://www.uptodate.com/contents/metronidazole-an-overview ... HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN - Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ Chun ngành: Hóa Phân Tích Mã số: LṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ NGƢỜI HƢỚNG... hoá điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp xử lý mẫu xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích số mẫu tơm 2.6 Phƣơng pháp nghiên. .. trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng