ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Sỹ Tiếp ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGỒI MƠI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Sỹ Tiếp ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Trịnh Thành Trung TS Phạm Đức Ngọc Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài luận văn, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Thành Trung, Ths Bùi Nguyễn Hải Linh toàn cán Viện Vi Sinh Vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội (IMBT) tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài luận văn tốt nghiệp Đồng thời, muốn gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Đức Ngọc quý thầy cô môn Vi sinh vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội động viên hỗ trợ tơi nhiều qua trình thực Ngồi ra, tơi muốn cảm ơn người bạn, người sát cánh bên lúc khó khăn giúp tơi vượt qua để hồn thành luận văn cách tốt Với lòng biết ơn sâu sắc, biết ơn ghi nhớ giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Hoàng Sỹ Tiếp MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chương 1- TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu bệnh melioidosis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Dịch tễ học 1.1.3 Con đường lây nhiễm 1.1.4 Đặc điểm lâm sàng 10 1.1.5 Chuẩn đoán 12 1.1.6 Điều trị lâm sàng 14 1.2 Chi Burkholderia 15 1.2.1 Giới thiệu chi Burkholderia 15 1.2.2 Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei 18 CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu 23 2.1.1 Mẫu bên ngồi mơi trường 23 2.1.2 Chủng vi sinh vật 23 2.2 Hóa chất, thiết bị 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Thiết bị 24 2.2.3 Môi trường nuôi cấy sử dụng 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Điều tra ca bệnh lâm sàng 25 2.3.2 Thu thập mẫu đất môi trường 25 2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN từ mẫu đất 26 2.3.4 Phương pháp phát vi khuẩn B pseudomallei realtime PCR 26 2.3.5 Phương pháp nuôi cấy để phát vi khuẩn B pseudomallei từ mẫu đất 27 2.3.6 Multilocus sequence typing (MLST) 27 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Điều tra ca bệnh melioidosis lâm sàng Bắc Miền Trung Việt Nam tháng 06 - 12/2015 30 3.1.1 Số lượng ca bệnh thông tin nhân học 31 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng điều trị 33 3.1.3 Phân bố nơi cư trú bệnh nhân 36 3.2 Điều tra phân bố vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngồi mơi trường 36 3.2.1 Bản đồ phân bố vi khuẩn phát kỹ thuật realtime PCR .36 3.2.2 Bản đồ phân bố vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy .42 3.3 Phân tích dịch tễ học phân tử 43 3.3.1 Phân tích Multilocus sequence typing (MLST) 43 3.3.2 Mối quan hệ kiểu gen chủng B pseudomallei Bắc Miền Trung Việt Nam khu vực khác giới 45 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sự phân bố vi khuẩn B pseudomallei vị trí ca bệnh melioidosis theo liệu thu từ 1910 - 2014 Hình 1.2 Hình thức nhiễm bệnh thơng qua tiếp xúc với nguồn đất nước chứa B pseudomallei Hình 1.3 Tổn thương quan vi khuẩn B pseudomallei gây Hình 1.4 Phản ứng dương tính với oxidase chủng vi khuẩn Burkholderia pseudomallei Hình 1.5 Đặc tính sinh học vi khuẩn B pseudomallei Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Burkholderia pseudomallei BG 02 sau ngày nuôi cấy 37°C môi trường Ashdown Agar Hình 1.7 Cây phân loại dựa trình tự rARN 16S lồi thuộc chi Burkholderia Hình 1.8 Hình thái tế bào vi khuẩn B pseudomallei Hình 1.9 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Burkholderia pseudomallei mơi trường Ashdown Agar Hình 1.10 Sự xâm nhập sinh trưởng Burkholderia pseudomallei nội bào 21 Hình 2.1 Bản đồ vị trí mẫu đất thu thập tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt 23 Nam vào tháng 09 năm 2016 Hình 3.1 Biểu đồ thể số lượng ca bệnh xét nghiệm chuẩn đoán nhiễm bệnh melioidosis bệnh viện tham gia khảo sát từ 06 – 12/2015 Hình 3.2 Biểu đồ nghề nghiệp bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis Bắc Miền Trung Việt Nam Hình 3.3 Biểu đồ độ tuổi bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis Bắc Miền Trung Việt Nam Hình 3.4 Biểu đồ thể số lượng ca bệnh xuất tháng khoảng từ - 12/2015 Hình 3.5 Bản đồ phân bố ca bệnh melioidosis tỉnh Bắc Miền Trung Việt Nam theo báo cáo bệnh viện tham gia q trình khảo sát dựa thơng tin địa bệnh nhân Hình 3.6 Hình ảnh mơi trường chọn lọc Ashdown Agar cấy trải dịch làm giàu lần với môi trường Galimand Broth biến đổi Hình 3.7 Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính điểm lấy mẫu theo phương pháp phát kỹ thuật realtime PCR Hình 3.8 Bản đồ phân bố vi khuẩn B pseudomallei đất dựa kết realtime PCR tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam Hình 3.9 Bản đồ phân bố vi khuẩn B pseudomallei đất nông nghiệp tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam dựa kết ni cấy Hình 3.10 Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính điểm lấu mẫu theo phương pháp phát kỹ thuật ni cấy Hình 3.11 Tổ hợp dịng (Clonal Complex) B.pseudomallei tồn giới xác định goeBURST Hình 3.12 Sự phân bố ST có nguồn gốc từ Việt Nam (A, B, C, D) bên cạnh phân bố ST thuộc vùng khác Australia, Thái Lan DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Ước tính số ca bệnh melioidosis năm 2015 Bảng 2.1 Trình tự mồi kích thước mảnh gen khuếch đại Bảng 3.1 Thông tin lâm sàng ca bệnh Bắc Miền Trung Việt Nam Bảng 3.2 Giá trị Ct mẫu đất dương tính giai đoạn làm giàu Bảng 3.3 Kết phân tích Multilocus sequence typing (MLST) 28 34 37 44 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Bcc: Burkholderia cepacia complex CF: Cystic fibrosis (Chứng xơ nang) CDC: U.S Centers for Disease Control and Prevention MALDI-TOF MS: Matrix - assisted laser desorption/ionization of time - of - flight mass spectrometry MHA: Mueller Hinton Agar CLSI: The Clinical & Laboratory Standards Institute TSB: Tryptone Soya Broth MRI: Magnetic Resonnace Imaging TTSS1: The type three secretion system ADN: Acid deoxyribonucleic ARN:Acid ribonucleic TBSS - C50: Threonine-basal salt solution plus colistin at 50 mg/liter ST: Sequence Type MLST: Multilocus Sequence Typing features of melioidosis in northern Vietnam”, Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102(1), pp 30-36 20 Sprague L D., Neubauer H., (2004), “Melioidosis in Animals: A Review on Epizootiology, Diagnosis and Clinical Presentation”, Journal of Veterinary Medical Science, 51, pp 305 – 320 21 Stone J K., DeShazer D., Brett P J., Burtnick M N., (2014), “Melioidosis: Molecular Aspects of Pathogenesis”, Expert Review of Anti-infective Therapy, 12(12), pp 1487-1499 22 Trung T T., Hetzer A., Topfstedt E., Göhler A., Limmathurotsakul D., Wuthiekanun V., Peacock S J., Steinmetz I, (2011), “Improved culture -based detection and quantification of Burkholderia pseudomallei from soil”, Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 105, pp 346-351 23 Trung T T., Hetzer A., Goăhler A., Topfstedt E., Wuthiekanun V., Limmathurotsakul D., Peacock S J., Steinmet I., (2011), “Highly Sensitive Direct Detection and Quantification of Burkholderia pseudomallei Bacteria in Environmental Soil Samples by Using Real-Time PCR”, Applied and Environmental Microbiology, 77(18), pp 6486-6494 24 Turner P et al, (2016), “A retrospective analysis of melioidosis in Cambodian children, 2009–2013”, BMC Infectious Diseases, 16, pp 688 25 Willcocks S J., Denman C C., Atkins H S., Wren B W., (2016), “Intracellular replication of the well-armed pathogen Burkholderia pseudomallei”, Current Opinion in Microbiology, 29, pp 94-103 26 Wiersinga W J., Currie B J., Peacock S J., (2012), “Melioidosis”, The New England journal of medicine, 367(11), pp 1035-1044 27 Woods D E., Sokol P A., (2006), “The Genus Burkholderia”, Prokaryotes, 5, pp 848-860 Website 28 http://www.internationales-buero.de/en/renomab.php 53 PHỤ LỤC Cơng trình nghiên cứu có liên quan đến luận văn T.T Trinh, T.S Hoang, D.A Tran, V.T Trinh, A Göhler, T.T Nguyen, S.N Hoang, R Krumkamp, L.T.N Nguyen, J May, P.M Doan, C.D Do, T.A Que, I Steinmetz (2017), “A Simple Laboratory Algorithm for Diagnosis of Melioidosis in Resource-Constrained Areas: A Study from North Central Vietnam”, Clinical Microbiology and Infection Phiếu điều tra bệnh nhân nhiễm bệnh Whitmore 54 Clinical Microbiology and Infection xxx (2017) 1.e1e1.e4 Contents lists available at ScienceDirect Clinical Microbiology and Infection j o u r n a l h o m e p a g e : w w w c l i n i c a l m i c r o b i o lo g y a n d i n f e c t i o n c o m Research note A simple laboratory algorithm for diagnosis of melioidosis in resourceconstrained areas: a study from north-central Vietnam T.T Trinh 1, * 7, 7, 10 R Krumkamp , L.T.N Nguyen , J May , P.M Doan , C.D Do 4, 11 Steinmetz 1) Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi, Viet Nam 2) General Hospital of Nghe An Province, Viet Nam 3) General Hospital of Ha Tinh Province, Viet Nam 4) Friedrich Loeffler Institute for Medical Microbiology, Greifswald, Germany 5) General Hospital of Quang Binh Province, Viet Nam 6) General Hospital of Quang Tri Province, Viet Nam 7) Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany 8) German Centre for Infection Research (DZIF), Hamburg-Borstel-Lübeck, Germany 9) Hue Central Hospital, Hue, Viet Nam 10) Bach Mai Hospital, Hanoi, Viet Nam 11) Institute of Hygiene, Microbiology and Environmental Medicine, Medical University of Graz, Graz, Austria article , T.S Hoang , D.A Tran , V.T Trinh , A Gohler€ , T.T Nguyen , S.N Hoang , info Article history: Received 12 April 2017 Received in revised form 26 June 2017 Accepted 26 July 2017 Available online xxx Editor: G Greub Keywords: Burkholderia pseudomallei Diagnosis Epidemiology Melioidosis North-central Vietnam 10 , T.A Que , I abstract Objectives: Melioidosis may be endemic in many tropical developing countries, but diagnosis of the disease is currently unreliable in resource-limited areas We aimed to validate a simple and cheap lab-oratory algorithm for the identi fication of Burkholderia pseudomallei from clinical specimens in parts of Vietnam where the disease has not previously been reported Methods: In June 2015, we conducted training courses at five general hospitals in north-central provinces in order to raise awareness of the disease and to introduce a simple and cheap laboratory identification algorithm for B pseudomallei including the three-antibiotic disc test Results: Until the end of the year (7 months later), 94 suspected B pseudomallei strains resistant to gentamicin and colistin but sensitive to amoxicillin/clavulanic acid were detected in clinical specimens from 70 patients All strains were further confirmed as B pseudomallei by using a specific TTSS1 real-time PCR assay and recA sequencing analysis Among positive blood cultures, positive rates with B pseudomallei ranged from 3.4% (5/147) to 10.2% (32/312) in the various clinics A total of 82.8% (58/70) patients were bacteraemic, with a mortality of 50% (18/36) among patients with known outcome No death occurred in nonbacteraemic patients Conclusions: Our results demonstrate that the introduction of a simple and easy-to-perform laboratory algorithm for the identification of B pseudomallei from clinical samples, together with clinical awareness raising, can lead to the diagnosis of a significant number of melioidosis cases in resource-limited clinical laboratories which previously did not identify the pathogen T.T Trinh, Clin Microbiol Infect 2017;▪:1 © 2017 European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Published by Elsevier Ltd All rights reserved Introduction * Corresponding author T T Trinh, Department of Vietnam Type Culture Collection, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National Univer-sity, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Viet Nam E-mail address: tttrung@vnu.edu.vn (T.T Trinh) Melioidosis is a life-threatening infectious disease of the tropics and subtropics caused by the soil bacterium Burkholderia pseudo-mallei The overall case fatality rate for the disease can reach 40% even if drugs of choice are provided; the fatality rate can be up to 80% if diagnosis is not performed accurately and subsequent http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 1198-743X/© 2017 European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Published by Elsevier Ltd All rights reserved Please cite this article in press as: Trinh TT, et al., A simple laboratory algorithm for diagnosis of melioidosis in resource-constrained areas: a study from northcentral Vietnam, Clinical Microbiology and Infection (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 1.e2 T.T Trinh et al / Clinical Microbiology and Infection xxx (2017) 1.e1e1.e4 antibiotic treatment is not appropriate [1] Because of diverse clinical presentations, diagnosis of melioidosis has to rely on the identification of B pseudomallei in the laboratory, with a positive culture of B pseudomallei from clinical specimens as the reference standard [2] B pseudomallei is a Gram-negative, oxidase-positive bacillus resistant to gentamicin (although susceptible isolates occur [3]) and colistin, but susceptible to amoxicillin/clavulanic acid The currently recommended diagnosis includes biochemical tests such the API 20NE test and emphasizes the need for specific antibody-based agglutination or lateral flow assays for B pseudomallei confirmation [1] The in-house preparation and additional intro-duction of currently recommended selective media such as Ash-down agar and costly biochemical identification systems in the daily routine may comprise a major barrier for the detection of B pseudomallei in clinical specimens in many potential endemic areas Moreover, antibody-based tests are not widely available Recently it has been predicted that melioidosis can cause dis-ease in 165 000 people, with 89 000 deaths worldwide [4] In northeast Thailand, the disease is known to be a major cause of community-acquired septicaemia and is classified as the third most common cause of death from infectious diseases [5,6] Although north-central Vietnam is located in the same geographical belt of the tropics as northeast Thailand and is adjacent to Laos, where melioidosis cases have been increasingly detected [7], the disease has not yet been reported from this part of Vietnam Limited re-sources, lack of laboratory expertise and lack of clinical awareness are likely the main factors responsible for possible underreporting To overcome these problems, we introduced a simple laboratory algorithm for the identification of B pseudomallei accompanied by teaching clinical presentations of melioidosis in five clinical labo-ratories and hospitals in north-central Vietnam Methods From to 19 June 2015, lectures and hands-on training work-shops on melioidosis were conducted at four provincial general hospitals of Nghe An, Ha Tinh, Quang Binh and Quang Tri, as well as one central hospital in Hue city These hospitals serve an area of 40 327 km with a population of 6.6 million (Supplementary Table S1) The lectures were orientated towards possible clinical presentations of the disease in order to raise awareness amongst local clinicians Because studies from other endemic areas showed an increased number of melioidosis cases after heavy rainfall [8,9], the training was started before the rainy season In order to achieve maximum adherence to the protocol in those resource-limited settings, we focused on the introduction to laboratory staff of a simple and comprehensible laboratory algorithm for the pre-sumptive identification of B pseudomallei from clinical samples All samples were taken as part of routine clinical care and de-cisions Blood cultures were routinely subcultured on Columbia blood agar Pus, sputum, urine and body fluids were directly cultured on MacConkey agar, chocolate agar and chromogenic media After 48 hours' incubation at 37 C, single bacterial colonies with a metallic-sheen appearance were subjected to cytochrome oxidase testing and Gram staining Oxidase-positive, Gram-negative bacilli were then tested for susceptibility against antibiotic discs of gentamicin (10 mg), colistin (10 mg) and amoxicillin/clav-ulanic acid (20/10 mg) according to Clinical and Laboratory Stan-dards Institute recommendations Interpretation was based on zone diameter interpretive standards for Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae [10,11] Suspected B pseudomallei strains were defined as oxidase-positive, Gramnegative bacilli, resistant to gentamicin and colistin but sensitive to amoxicillin/clavulanic acid (zone diameter, 21e26 mm) For final identification, strains were transferred to the Institute of Microbiology and Biotechnology in Hanoi, where B pseudomalleiespecific TTSS1 real-time PCR assay [12] and recA sequence analysis using BUR1 and BUR2 primers [13] were performed The study was approved by the research ethics committee of Bach Mai Hospital (1004/QD-BM 2014), a large referral hospital in Hanoi and a subordinate unit of the Ministry of Health The study aimed to increase the quality of melioidosis diagnoses during routine clinical care and decisions through training measures Informed consent of patients was not required The participating hospitals signed agreements to take part in the study Results By using this laboratory algorithm from June to December 2015 (7 months), 94 suspected B pseudomallei strains were detected from the clinical specimens of 70 patients All strains were confirmed by TTSS1 real-time PCR and showed a recA gene sequence identical to that of B pseudomallei K96243 Seventy-six B pseudomallei strains (80.9%) were isolated from blood, six (6.4%) from pus, five (5.3%) from sputum, two (2.1%) from urine and five (5.3%) from other body fluids (n ¼ cerebrospinal fluid, n ¼ pleural fluid, n ¼ bronchial washes, n ¼ synovial fluid) Of 1097 positive blood cultures obtained during the study, 76 samples (6.9%) were positive for B pseudomallei Positivity rates ranged from 3.4% (5/147) to 10.2% (32/312) among communities (Supplementary Table S1) From the 70 melioidosis patients, most cases (n ¼ 48; 68.6%) were admitted during September, October and November, with a peak (n ¼ 23; 32.9%) in October (Supplementary Fig S1) Twenty-three patients (32.9%) were diagnosed at the provincial general hospital of Nghe An, 27 patients (38.6%) at Ha Tinh, six patients (8.6%) at Quang Binh, five patients (7.1%) at Quang Tri and nine patients (12.9%) at the central hospital of Hue city Assuming that the patients' residential address is most likely the place where infection was acquired, mapping the pa-tient's home addresses revealed 32 cases (45.7%) in Ha Tinh prov-ince (Fig 1) Fifty-eight patients (82.9%) had blood culture samples positive for B pseudomallei (Table 1) Of those, 29 patients (50.0%) had documented intravenous treatment with at least one of the currently recommended antibiotics for severe melioidosis, namely ceftazidime, meropenem or imipenem [14] In the remaining 29 (50%), treatment was either not adequate or treatment data were not available Outcome of 19.0% (11/58) patients was not recorded A total of 19.0% (11/58) of patients presenting with severe sepsis was transferred to other hospitals, with unknown outcome Of all blood cultureepositive patients with known outcome, 50.0% (18/ 36) of the patients died, and six deaths occurred within 48 hours after admission Fifty percent (18/36) of the patients with known outcome recovered Among patients with known outcome, 29% (5/ 17) died when receiving adequate treatment A total of 37.5% (3/8) patients died with inadequate treatment, and 90% (10/11) of pa-tients with unavailable treatment data died Of the 12 nonbacteraemic patients, 11 patients (91.7%) received ceftazidime, meropenem or amoxicillin/clavulanic acid All patients recovered (Table 1) Discussion Although the first case of melioidosis was described more than a century ago, the disease is likely to be underreported in many parts of the world Most clinical microbiology laboratories in potential endemic areas are resource limited We therefore simplified the diagnostic procedure by teaching typical morphology characteris-tics of B pseudomallei on different routine agar media and by introducing a simple bacterial identification including the three- Please cite this article in press as: Trinh TT, et al., A simple laboratory algorithm for diagnosis of melioidosis in resource-constrained areas: a study from northcentral Vietnam, Clinical Microbiology and Infection (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 T.T Trinh et al / Clinical Microbiology and Infection xxx (2017) 1.e1e1.e4 Fig Geographical distribution map based on home addresses of melioidosis patients diagnosed in north-central Vietnam, June to December 2015 Dots indicate homes of pa-tients Asterisks indicate locations of five general hospitals, with their names indicated Map constructed by MapInfo 7.8 (MapInfo, Troy, NY, USA) antibiotic disc test This approach proved to be highly specific in this context, because all 94 oxidase-positive, Gram-negative bacilli with gentamicin and colistin resistance but amoxicillin/clavulanic sensitivity were confirmed as B pseudomallei using molecular methods Following this simple laboratory algorithm, three general hospitals of Ha Tinh, Quang Binh and Quang Tri in which B pseudomallei had never before been identified were detected 38 (54.3%) of the 70 melioidosis cases within months The remaining 32 cases (45.7%) detected in the other two hospitals of Nghe An and Hue represent a considerable increase compared to the previous laboratory reports of fewer than five cases per year in each hospital Most affected patients were admitted during the time of seasonal rainfall, with a peak in October Clinical presentations, risk factors and the high mortality of melioidosis cases (18/36, 50.0%, of cases with known outcome) in this study are consistent with other endemic areas, where septicaemia with pneumonia are the most common clinical pre-sentation The same is true for diabetes [5], which was frequently observed in melioidosis patients (19/70) In our study group, 10% of patients with melioidosis were children, including cases of sup-purative parotitis, as reported from other endemic areas of South-east Asia [15] It has been predicted that B pseudomallei is likely to be present in the environment throughout Vietnam, and melioidosis is prob-ably highly endemic [4] To date most cases of melioidosis in Vietnam have been reported from the north and south of the country rather than the central region [9,16] To our knowledge, this is the first report of a series of melioidosis cases detected in north-central Vietnam Limitations of our study include the fact that the high proportion of patients with positive blood cultures is probably the result of the nonuse of selective media Such media would have possibly increased the detection of B pseudomallei from nonsterile Please cite this article in press as: Trinh TT, et al., A simple laboratory algorithm for diagnosis of melioidosis in resource-constrained areas: a study from northcentral Vietnam, Clinical Microbiology and Infection (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 1.e4 T.T Trinh et al / Clinical Microbiology and Infection xxx (2017) 1.e1e1.e4 Table Demographic data, clinical presentations, risk factors and outcomes in 70 melioi-dosis patients diagnosed in north-central Vietnam from June to December 2015 Characteristic Demographic information Age (years) Mean ± SD Range Children (aged 15 years) Male sex Rice occupation a Organ involvement Lungs Skin and soft tissue Genitourinary tract Bone and joint Lymph nodes Suppurative parotitis Central nervous system Middle ear Liver Kidney Prostatitis Known risk factors Diabetes Chronic lung disease Chronic renal disease Chronic liver disease Immunosuppressive drug use Alcoholism Malignancy Outcomes Recovery overall Recovery in cases with known outcome Death overall Death in cases with known outcome Unknown a Acknowledgement We thank N N Minh for his help in constructing the map of patient's homes Transparency declaration Supported in part by the Vietnamese Ministry of Science and Technology and the German Federal Ministry of Education and Research through the project RENOMAB (Research Network on Melioidosis and Burkholderia pseudomallei; reference 01DP13007) All authors report no conflicts of interest relevant to this article Appendix A Supplementary data Supplementary data related to this article can be found at http:// dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 References [1] Hoffmaster AR, AuCoin D, Baccam P, Baggett HC, Baird R, Bhengsri S, et al Melioidosis diagnostic workshop, 2013 Emerg Infect Dis 2015;21(2) [2] Kiratisin P, Santanirand P, Chantratita N, Kaewdaeng S Accuracy of com- mercial systems for identification of Burkholderia pseudomallei versus Burkholderia cepacia Diagn Microbiol Infect Dis 2007;59:277e81 [3] Podin Y, Sarovich DS, Price EP, Kaestli M, Mayo M, Hii K, et al Burkholderia pseudomallei isolates from Sarawak, Malaysian Borneo, are predominantly susceptible to aminoglycosides and macrolides Antimicrob Agents Chemother 2014;58:162e6 [4] Limmathurotsakul D, Golding N, Dance DA, Messina JP, Pigott DM, Moyes CL, et al Predicted global distribution of Burkholderia pseudomallei and burden of melioidosis Nat Microbiol 2016;1(1) [5] Limmathurotsakul D, Wongratanacheewin S, Teerawattanasook N, Wongsuvan G, Chaisuksant S, Chetchotisakd P, et al Increasing incidence of human melioidosis in Northeast Thailand Am J Trop Med Hyg 2010;82: 1113e7 Four patients had multiple organ involvement: one had prostatitis and renal abscess, and three others had pneumonia with skin abscess [6] samples such as sputum, throat and wound swabs, resulting in the detection of more localized infections Furthermore, follow-up studies of the melioidosis patients were not carried out after their hospital discharge or transfer, making it hard to determine the true mortality rate and the effectiveness of antibiotic treatment The introduction of selective media and antibody-based tests for rapid culture confirmation would probably further increase the detection rate and speed up the final diagnosis in our study region However, a comparison of the performance of various diagnostic algorithms was not our aim in this study The three-antibiotic disc test seems to be a valuable tool to start detecting melioidosis cases in resource-limited settings where the epidemiologic situation is unclear Better diagnostic methods and improved awareness are likely to substantially reduce mortality The introduction and evaluation of more sophisticated diagnostic algorithms can be based on the results obtained with the three-antibiotic disc test The implementation of this simple and cheap method to other potentially endemic and resource-limited areas might be helpful as a first step towards understanding the global distribution of melioidosis [7] Chaowagul W, White NJ, Dance DA, Wattanagoon Y, Naigowit P, Davis TM, et al Melioidosis: a major cause of community-acquired septicemia in northeastern Thailand J Infect Dis 1989;159:890e9 Rachlin A, Dittrich S, Phommasone K, Douangnouvong A, Phetsouvanh R, Newton PN, et al Investigation of recurrent melioidosis in Lao People's Democratic Republic by multilocus sequence typing Am J Trop Med Hyg 2016;94:1208e11 [8] Currie BJ, Jacups SP Intensity of rainfall and severity of melioidosis, Australia Emerg Infect Dis 2003;9:1538e42 [9] Phuong DM, Trung TT, Breitbach K, Tuan NQ, Nubel U, Flunker G, et al Clinical and microbiological features of melioidosis in northern Vietnam Trans R Soc Trop Med Hyg 2008;102(Suppl 1):S30e6 [10] Hodgson K, Engler C, Govan B, Ketheesan N, Norton R Comparison of routine bench and molecular diagnostic methods in identification of Burkholderia pseudomallei J Clin Microbiol 2009;47:1578e80 [11] Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing Twentieth informational supplement Approved standard M100eS24 Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014 [12] Trung TT, Hetzer A, Gohler A, Topfstedt E, Wuthiekanun V, Limmathurotsakul D, et al Highly sensitive direct detection and quanti fication of Burkholderia pseudomallei bacteria in environmental soil samples by using real-time PCR Appl Environ Microbiol 2011;77:6486e94 [13] Payne GW, Vandamme P, Morgan SH, Lipuma JJ, Coenye T, Weightman AJ, et al Development of a recA geneebased identification approach for the entire Burkholderia genus Appl Environ Microbiol 2005;71:3917e27 [14] Wiersinga WJ, Currie BJ, Peacock SJ Melioidosis N Engl J Med 2012;367: 1035e44 [15] Sanderson C, Currie BJ Melioidosis: a pediatric disease Pediatr Infect Dis J 2014;33:770e1 [16] Parry CM, Wuthiekanun V, Hoa NT, Diep TS, Thao LT, Loc PV, et al Melioidosis in southern Vietnam: clinical surveillance and environmental sampling Clin Infect Dis 1999;29:1323e6 Please cite this article in press as: Trinh TT, et al., A simple laboratory algorithm for diagnosis of melioidosis in resource-constrained areas: a study from northcentral Vietnam, Clinical Microbiology and Infection (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.cmi.2017.07.029 Mọi thông tin xin liên hệ: TS Trịnh Thành Trung Email: tttrung@vnu.edu.vn Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội PHIẾU ĐIỀU TRA THÔNG TIN BỆNH NHÂN NHIỄM BỆNH MELIOIDOSIS Bệnh viện: ………………………………………………………………………………….… Khoa: ……………………………………………………… Bệnh nhân có tiền sử bị bệnh Melioidosis A THÔNG TIN BỆNH NHÂN Mã bệnh án: ………………………………………………………………………………….………… Ngày nhập viện: …… …… /….……….……/20…………… Họ tên bệnh nhân: …………………………………………………….……………….…………… Giới tính: Năm sinh: ………………………………………… Chiều cao: ………….…………….…………… Cân nặng: ……… ……………………………………………… kg Nghề nghiệp: …………………………………………………….………………….…………………… 10 Thu nhập bình quân: …………… ……………………/tháng 11 Địa chỉ: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12 Họ tên vợ chồng (nếu có): …………… .…………….…………………………………13 Số điện thoại: ……………………………………………………… 14 Nghề nghiệp vợ chồng: ………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………… B.YẾU TỐ NGUY CƠ I Do hành vi Khơng(1) Có(2) Khơng(1) Khơng biết(9) Làm ruộng Bị sặc nước Phơi nhiễm với đất nước Có vết thương hở Ăn thức ăn có nhiễm bụi, đất Hút thuốc Uống nước chưa đun sôi Sử dụng đồ uống có cồn có (ghi rõ): Đi ngồi trời mưa II Do bệnh Bệnh tiểu đường (Thời điểm phát bệnh: Năm……………………….………) Phương pháp xét nghiệm Glucose lúc đói Test dung nạp Glucose HbA1c Bệnh tiểu đường kiểm soát tháng trước nhiễm Melioidosis Chỉ số glucose lúc đói …………………… …………… Chỉ số HbA1c nay…………………………………………… … Sử dụng thuốc chống tiểu đường Bia Có(2) Khơng biết(9) Insulin Thuốc uống điều trị tiểu đường khác Trang 1/4 Bệnh tim mạch (Ghi rõ thời điểm phát bệnh) Bệnh tim bẩm sinh thấp khớp (Năm……………………….………) Nhồi máu tim, bệnh động mạch vành (Năm……………………….………) Cao huyết áp (Năm……………………….………) Bệnh gan, thận (Ghi rõ thời điểm phát bệnh) Bệnh thận mạn tính (Năm……………………….………) Sỏi thận Protein nước tiểu Microhematurial Bệnh gan mạn tính (Năm……………………….………) Các bệnh khác (Ghi rõ thời điểm phát bệnh) Bệnh phổi (Năm……………………….………) Ung thư (Năm……………………….………) Các hội chứng chuyển hóa (Năm……………………….………) Các bệnh truyền nhiễm khác (Ghi rõ thời gian phát bệnh) HIV (Năm……………………….………) Lao (Năm……………………….………) III Do sử dụng thuốc Bệnh nhân thường xuyên sử dụng thuốc theo đơn Tên thuốc Bệnh nhân có sử dụng Steroid Sử dụng từ ngày ……… … /…… ……… /…………… đến ngày ……… … /…… ……… /…………… Liều dùng: ………………………/ngày Bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế miễn dịch cyclosporine (Liều dùng: ……………………….…………/ngày, từ ……… /…….……… /………… đến ngày ……….… /…… …… / ………… ) azathioprine (Liều dùng: ……………………….…………/ngày, từ ……… /…….……… /………… đến ngày ……….… /…… …… / ………… ) methotrexate (Liều dùng: ……………………….…….…/ngày, từ ……… /…….……… /………… đến ngày ……….… /…… …… / ………… ) chemotherapy (Liều dùng: …………………… ………/ngày, từ ……… /…….……… /………… đến ngày ……….… /…… …… / ………… ) Khác: Bệnh nhân thường xuyên tự sử dụng thuốc không theo đơn Tên thuốc: ………………………………………… … ……… Liều dùng:…………………….… …… /ngày Thời gian: ………… Tên thuốc: ………………………………………… … ……… Liều dùng:…………………….… …… /ngày Thời gian: ………… Tên thuốc: ………………………………………… … ……… Liều dùng:…………………….… …… /ngày Thời gian: ………… Trang 2/4 C DẤU HIỆU VÀ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG Nhiệt độ: ……… ,…….… C Sốt Đau đầu Khó thở Ho Viêm màng phổi 10 Phù 11 Khó tiểu D CHẨN ĐỐN VÀ XÉT NGHIỆM LÂM SÀNG Công thức máu WBC: ……… MCV: ……… WBC non (b Sinh hóa máu Na: …………… Creatinine: Protein: … Axit uric: … AP: …………… ESR: ………… HbA1C……… Có protein nước tiểu E KẾT QUẢ SIÊU ÂM VÀ X-QUANG Chụp X-quang phổi Bình thường Tràn dịch màng phổi Chụp X-quang ổ bụng Bình thường Siêu âm ổ bụng Bình thường Vị trí nhiễm trùng Áp xe gan Áp xe thận Áp xe tuyến tiền liệt Viêm loét, áp xe da Trang 3/4 F ĐIỀU TRỊ Kháng sinh sử dụng nhập viện …………………………………………………… …………………………………………………… …………………………………………………… Kháng sinh sử dụng sau chẩn đoán ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… Kháng sinh trì ………………………………………………… ………………………………………………… …………………………………………………… G KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ Ngày viện: … ……… /…… ………/……… …… Tình trạng viện Khỏi Di chứng H Thơng tin chủng B pseudomallei phân lập từ bệnh nhân Ngày phân lập: ……… ………/………… ………/………………… Kí hiệu chủng: …………………………………………………………… Nguồn gốc bệnh phẩm Máu Đờm Môi trường phân lập Thạch máu Thạch Chocolate Phương pháp định danh Máy Vitek I THEO DÕI Tái khám (ngày…………………/………………… /……………… ) Kết tái khám: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Ngày ………… tháng ……….… năm …………… Người làm phiếu ………………………………………………………… Trang 4/4 ... NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Sỹ Tiếp ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGỒI MƠI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG VI? ??T... sàng nghiên cứu phân bố vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngồi mơi trường Bắc Miền Trung Vi? ??t Nam? ?? với nội dung: - Ứng dụng kỹ thuật định danh vi khuẩn đơn giản để phát ca bệnh whitmore Bắc Miền. .. báo cáo bệnh vi? ??n phía Bắc bệnh vi? ??n phía Nam Do đó, tồn dịch tễ học ca bệnh phân bố vi khuẩn B pseudomallei miền Trung Vi? ??t Nam bỏ ngỏ Bên cạnh đó, xét nghiệm ni cấy B pseudomallei từ mẫu bệnh