Áp dụng hình thái học và sinh học phân tử trong định loại sán lá gan lớn tại một số tỉnh miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HỒNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THU HƢƠNG PGS TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khóa luận cao học này, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ cá nhân, tổ chức Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy/cô Phịng Sau đại học Bộ mơn Di truyền học - khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN Ban giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Khoa Dịch tễ Sốt rét tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Nguyễn Thu Hƣơng - hai ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Trịnh Đình Đạt, PGS TS Lê Thanh Hịa, TS Nguyễn Thị Hƣơng Bình, TS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, TS Trƣơng Văn Hạnh, TS Lê Xuân Hợi anh/chị em Khoa Ký sinh trùng, Khoa Sinh học phân tử, Khoa Dịch tễ sốt rét giúp đỡ tơi q trình thực đề tài nhƣ đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn lớp cao học K21 Sinh học, bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ, động viên chia sẻ vui buồn với suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Hoàng Yến i LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm sán gan lớn ngƣời v 1.1.1 1.1.2 1.2 Đặc điểm sinh học sán gan lớn 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 Chu kỳ phát triển sán gan lớn 1.4 Các vật chủ sán gan lớn 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.5 Các yếu tố nguy bệnh sán gan l 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.6 Đặc điểm bệnh sán gan lớn 1.6.1 Đặc điểm lâm sàng 1.6.2 Đặc điểm cận lâm sàng 1.7 Tính đa dạng di truyền Fasciola spp 1.7.1 1.7.2 1.8 1.8.1 1.8.2 Các phƣơng pháp xác định loài sán ga 1.9 Thuốc điều trị sán gan lớn Việt Nam 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị chung 25 2.3 Hóa chất 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28 2.4.2 Cỡ mẫu phân tích 29 2.4.3 Phƣơng pháp xác định kích thƣớc số hình thái .29 2.4.4 Các phƣơng pháp định loài kỹ thuật sinh học phân tử 31 2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu 33 2.6 Đạo đức nghiên cứu 33 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Kết hình thái sán gan lớn địa điểm nghiên cứu 34 3.1.1 Kích thƣớc sán gan lớn động vật 34 3.1.2 Các số trứng SLGL thu đƣợc động vật (vật kính 40x) 42 3.2 Kết định loại phƣơng pháp sinh học phân tử 44 3.2.1 Kết nhân đoạn gen ITS-2 kỹ thuật PCR .44 3.2.2 Kết PCR - RFLP 45 3.2.3 Kết so sánh sai khác, tỷ lệ tƣơng đồng trình tự ITS-2 .49 3.2.4 Kết mối tƣơng quan phả hệ 58 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC iii CHỮ VIẾT TẮT ADN : Axit deoxyribonucleic ARN : Axit ribonucleic Atp8 : Gen mã hóa adenosine triphosphatase BL : Body length (chiều dài thể) bp : Base pair (cặp bazơ) BR : Body roundness (chu vi thể) BW : Body width (chiều rộng thể) Buffer : Dung dịch đệm CL : Cone length (Chiều dài đầu sán) CS : Cộng CW : Cone width (chiều rộng đầu sán) COX : Cytochrome oxidase COB : Cytochrome oxidase b CT : Côn trùng dATP : Deoxy adenosine triphosphate dCTP : Deoxy cytosine triphosphate dGTP : Deoxy guanidine triphosphate dTTP : Deoxy thymidine triphosphate dNTP : Deoxy nucleotide triphosphate FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức lƣơng thực nông nghiệp Liên Hiệp quốc) GOT : Glutamic oxaloacetic transaminase GPT : Glutamic pyruvic transaminase ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen) KST : Ký sinh trùng Marker : Thang đo trọng lƣợng phân tử NAD : Nicotinamide dehydrogenase subunit iv NA OS PBS : Nghệ An PCR : Oral sucker (giác miệng) : Phosphate buffered saline (dung dịch đệm) RFLP : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) Primer : Restriction fragment length polymorphism (đa SLG hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) SLGL : Mồi TL : Sán gan : Sán gan lớn TW : Taking both testes together length (độ dài tinh TBE hoàn) VCTG : Testicular space width (độ rộng tinh hoàn) VS : Tris Boric acid VS-P : Vật chủ trung gian Vit-P : Ventral sucker (giác bụng) : Khoảng cách giác miệng điểm cuối thân WHO : Khoảng cách từ cuối tuyến hoàng thể đến cuối thân : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm SLGL trâu/bò huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam [13] Bảng 2.1 Kết dự đoán sản phẩm ADN kỹ thuật PCR PCR - RFLP 33 Bảng 3.1 Kích thƣớc chiều dài chiều rộng sán gan lớn 34 Bảng 3.2 Tỷ lệ chiều dài chiều rộng sán gan lớn 35 Bảng 3.3 Chu vi giác bụng giác miệng 36 Bảng 3.4 Kích thƣớc chiều rộng cổ chiều dài đầu sán 37 Bảng 3.5 Kích thƣớc khoảng rộng dài tinh hoàn 37 Bảng 3.6 Kích thƣớc đoạn từ giác bụng đến cuối thân đoạn từ giao điểm tuyến hoàng thể đến cuối thân 38 Bảng 3.7 Sự phù hợp loài sán theo số BL/BW VS-P 39 Bảng 3.8 Các số kích thƣớc trứng thu động vật 42 Bảng 3.9 Tỷ lệ chiều dài chiều rộng trứng sán gan lớn thu động vật 43 Bảng 3.10 Vị trí biến đổi nucleotide vùng gen ITS-2 mẫu sán [11] 56 Bảng 3.11 Sự sai khác mức độ tƣơng đồng nucleotide mẫu SLGL điểm nghiên cứu với F gigantica Niger 57 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thể sán gan lớn trƣởng thành Hình 1.2 Cấu tạo quan sán gan lớn Hình 1.3 Hình thể trứng sán gan lớn Hình 1.4 Chu kỳ phát triển sán gan lớn 11 Hình 1.5 Tổn thƣơng gan sán gan lớn siêu âm 15 Hình 1.6 Mơ hình cấu trúc ribosome ADN gen nhân [17] .20 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28 Hình 2.2 Các số sán gan lớn trƣởng thành [51] 30 Hình 3.1 So sánh tỷ lệ BL/BW sán gan lớn tỉnh miền Bắc 35 Hình 3.2 So sánh tỷ lệ VS-P sán gan lớn tỉnh miền Bắc .38 Hình 3.3 So sánh phù hợp lồi sán theo tỷ lệ (%) BL/BW VS-P 39 Hình 3.4 Một số hình ảnh sán gan lớn 41 Hình 3.5 Hình thể kích thƣớc mẫu SLGL số điểm nghiên cứu 41 Hình 3.6 Một số hình ảnh trứng sán gan lớn Ảnh chụp vật kính 40x (hình a, b) vật kính 10x (hình c, d), thƣớc đo = 10 µm 42 Hình 3.7 So sánh tỷ lệ chiều dài/chiều rộng trứng SLGL thu động vật 43 Hình 3.8 Kết nhân gen mẫu SLGL phản ứng PCR 45 Hình 3.9 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F gigantica 45 Hình 3.10 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng BGS1 46 Hình 3.11 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F hepatica (mẫu THT2) 46 Hình 3.12 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng THT2 47 Hình 3.13 Sản phẩm PCR-RFLP mẫu sán cho kết F gigantica/F hepatica (mẫu NA6) 48 Hình 3.14 Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 mẫu trứng NA6 48 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F hepatica Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 50 Hình 3.16 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F gigantica Niger (JN828955.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 51 vii Hình 3.17 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F gigantica Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK .52 Hình 3.18 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F hepatica Tây Ban Nha (AM709649.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 53 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu NA6 (H6) với trình tự mẫu F hepatica Tây Ban Nha (AM709499.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK 54 Hình 3.20 Kết so sánh trình tự ITS-2 mẫu NA6 với trình tự mẫu F gigantica Niger (AM850108.1) (độ tƣơng đồng 99%) GENBANK .55 Hình 3.21 Sơ đồ hình biểu mối quan hệ phả hệ dựa trình tự đoạn gen thu đƣợc SLGL nghiên cứu với SLGL số nƣớc khu vực giới 58 viii 63 10 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, Lê Khánh Thuận (2004), “Xác định loài sán gan lớn từ trứng phân bệnh nhân phƣơng pháp phân tử hệ gen ty thể”, Tạp chí Phịng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, số 4/2004, tr 72-79 11 Nguyễn Văn Đề, Nguyễn Thị Khuê Lê Thanh Hịa (2011), "Tính lai chéo ngƣợc mẫu sán gan lớn Fasciola sp thu nhận bệnh nhân Nghệ An", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 76(5), tr 34-40 12 Võ Thị Hải Lê (2010), “Tình hình nhiễm sán gan lớn trâu, bị số điểm thuộc tỉnh Nghệ An”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XVII, số 5-2010, tr 30-33 13 Nguyễn Khắc Lực (2010), “Nghiên cứu số đặc điểm nhiễm sán gan lớn (Fasciola spp.) hiệu số biện pháp can thiệp huyện Đại Lộc – Quảng Nam”, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Hà Nội 14 Phạm Văn Lực (2006), “Bệnh sán gan trâu bò (Fasciolaliasis) yếu tố nguy lây nhiễm sang ngƣời tỉnh Đăk Lăk”, Tạp chí y học thực hành, số năm 2006, tr 41-43 15 Trần Vinh Hiển, Phan Anh Tuấn, Đặng Tất Thế, Nguyễn Khắc Lực (2008), “Tỷ lệ nhiễm SLGL Fasciola sp hai xã Chƣ pả H’ Bơng tỉnh Gia Lai”, Tạp chí Y dược học quân sự, (2), tr 75-78 16 Lê Thanh Hòa (2007), “Xác định lai ngoại loài F hepatica F gigantica quần thể sán gan lớn Việt Nam sở phân tích sinh học phân tử”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 11, phụ số 2/2007, tr 89-97 17 Lê Thanh Hòa (2007), Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học di truyền quần thể ký sinh trùng Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, 11(PB2):9-14 18 Nguyễn Thế Hùng, Lê Thanh Hịa Giang Hồng Hà (2008), "Kết định loại sán gan lớn thu thập lò mổ Hà Nội bằn phƣơng pháp PCR", Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV (số 3), tr 50-55 19 Lê Quang Hƣng, Hồ Việt Mỹ, Võ Hƣng, Nguyễn Văn Quốc, Đặng Tất Thế, Cao Văn Viên, Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung (2003), “Nghiên cứu định loại đặc điểm dịch tễ học SLGL Bình Định”, Báo cáo Hội nghị 64 phòng chống bệnh sán người WHO FAO tổ chức Hà Nội, ngày 26-28/11/2002 20 Nguyễn Thu Hƣơng (2012), “Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ học sán gan lớn hiệu điều trị Triclabendazole Quảng Ngãi, năm 20092011”, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Viện, Hà Nội 2012 21 Lê Bách Quang (2008), Ký sinh trùng trùng y học (Giáo trình giảng dạy đại học) Nhà xuất Quân đội nhân dân, tr 233-236 22 Nguyễn Thị Giang Thanh, Triệu Nguyên Trung Lê Thanh Hịa (2010), "Nghiên cứu thẩm định lồi sán gan lớn (Fasciola spp.) gây bệnh dê Việt Nam thị phân tử", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (1), 2010, tr 21 - 27 23 Lê Thị Tuyết (2009), “Kết xét nghiệm trứng sán gan lớn (Fasciola spp.) phân ngƣời trâu/bò số xã huyện Xuân Trƣờng, tỉnh Nam Định”, Tạp chí y học thực hành, 12/2009 24 Nguyễn Văn Văn (2012), “Nghiên cứu thực trạng sán gan lớn ngƣời hiệu số biện pháp can thiệp cộng đồng dân cƣ tỉnh Quảng Nam (2009 - 2011)” Luận án tiến sỹ, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 25 Anderson, N., Luong, T.T., Vo, N.G., Bui, K.L., Smooker, P.M., Spithill, T.W (1999), “The sensitivity and specifictity of two methods for detecting Fasciola infection in cattle” Vet Parasitol 83, pp 15-24 26 Boore JL (1999), “Animal mitochondrial genomes” Nucleic Acids Res, 27(8):1767-1178 27 Boray J.C (1982), CRC Handbook Series in Zoonoses Section C: Parasitic Zoonoses, Fascioliasis, pp 71-88 28 Brian Kendall S and Parfitt J.W (1953), "Life-history of Fasciola gigantica Cobbold 1856", Nature Journal 171, pp 1164 - 1165 29 Dalton J.P (1999), Fascioliasis, CABI Publishing, Walling ford, UK 30 Dang TT, Nawa Y (2005), Fasciola and Fascioliasis in Vietnam Asian Parasitol 1: 57-60 65 31 Esteban JG, Bargues MD, Mas-Coma S (1998), Geographical distribution, diagnosis and treatment of human fascioliasis a review Res Rev Parasitol (58)13-48 32 Farag, H.F (1998), A short note on praziquantel in human fascioliasis, J Tropical Medicine and Hygein, 89, pp 79 33 Fritzscha G., Schjegel M., Stadler PF (2006), Alignments of mitochondrial genome arrangements: applications to metazoan phylogeny J Theor Biol 21;240(4):511-520 34 Gil G.F., Cervero J.M., Torres P.R., Jussdado Ruiz-Capillas J.J (2006), “Hepatobiliary fasciolasis without eosinophilia”, Rev Clin Esp; 206 (9), pp 464 35 Ghavami MB., Rahimi P., Haniloo A., Mosavinasab SN (2009), “Genotypic and Phenotypic Analysis of Fasciola Isolates”, Iranian J Parasitol, Vol 4, No 3, 2009, pp 61-70 36 Guarro J, GenéJ, Stchigel AM (1999), Review Developments in fungal taxonomy Clin Microbiol Rev 12(3):454-500 37 Gulsen M.T, M.C., Savas M., Koruk A., Kadayifci F., Demirci (2006), “Fascioliasis: a report of five cases presenting with common bile duct obstruction”, The Netherlands journal of Medicine, 64 (1), pp 17-19 38 Holland, W.G., Luong, T.T., Nguyen, L.A., Do, T.T (2000), “The epidemiology of nematode and fluke infections in cattle in the Red Rive Delta in Viet Nam”, Veterinary Parasitology, 93, pp 141-147 39 Hu M., Gasser RB (2006), Mitochondrial genomes of parasitic nematodes progress and perspectives Trends Parasitol 22(2):78-84 40 Hussein A.A, Refaat M.A Khalifa (2010), "Phenotypic description and prevalence of Fasciola species in Qena Governorate, Egypt with special reference to a new strain of Fasciola hepatica", Journal of King Saud University (Science), 22, pp 1-8 41 Itagaki, T., Sakaguchi, K., Terasaki, K., Sasaki, O., Yosshihara, S., Van Dung, T (2009), “Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in Vietnam and their molecular characterization base on nuclear and mitochondrial DNA”, Parasitol Int.58, pp 81-85 66 42 Le T.H., Blair, D., Agatsuma, T., Humair, P.F., Campbell, N.J., Iwagami, M., Littlewood, D.T., Peacock, B., Johnston, D.A., Bartley, J., Rollinson, D., Herniou, E.A., Zarlenga, D.S and McManus, D.P (2000b), Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms, Mol Biol Evol 17(7)1123-1125 43 Le TH, Blair D and McManus DP (2002), Mitochondrial genomes of parasitic flatworms Trends in Parasitology, 18:206-213 44 Le TH, De NV, Agatsuma T, Nguyen TGT, Nguyen QD, McManus DP, Blair D (2008), “Human fascioliasis and the presence of hybrid/introgressed forms of Fasciola in Vietnam”, Int J Parasitol, 38, pp 725-730 45 Le TH, De NV, Agatsuma T, Blair D, Vercruysse J, Dorny P, Nguyen TGT, and McManus DP (2007), Molecular confirmation that Fasciola gigantica can undertake aberrant migrations in human hosts Journal of Clinical Microbiology, 45(2):648-650 46 Lin Ai (2011), “Genetic characterization, species differentiation and detection of Fasciola spp By molecular approaches”, Parasites & Vectors, 2011, (101): 1-6 47 Mahami-Oskouei M (2011), "Molecular identification and differentiation of Fasciola isolates using PCR – RFLP method based on Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5.8S rDNA, ITS2)", Iranian J Parasitol, Vol 6, No.3, 2011, pp 35-42 48 Mas-Coma S (1998), in: Angelico M (Ed), “Human fascioliasis in Europe and Latin America, Balaaban Publishers”, Rehovot, Israel, pp 1-17 49 Mas-Coma S (2004), “Human Fascioliasis: Epidemiological patterns in human endemic areas of south America, Africa and Asia”, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 35 (1), pp 1-11 50 Mas-Coma S (2005), “Epidemiology of fascioliasis in human endemic areas”, J Helminthol, 79, pp 207-216 51 Mas-Coma S., Valero M.A, Bargues MD (2009), Fasciola, lymnaeids and human fascioliasis with a global overview on disease transmission, epidemiology, evolutionary genectics, molecular epidemiology and control Adv Parasitol 69:41-146 67 52 Mas-Coma S (2005), “Fascioliasis and other plant-borne trematode zoonoses”, Int J Parasitol, 35, pp 1255-1278 53 Mas-Coma S., Angles R., Esteban J.G, Bargues M.D., Buchon P., Franken M., and Strauss W (1999), “The Northern Bolivian Altiplano: a region highly endemic for human fascioliasis”, Trop Med Int Health, 4, pp 454-467 54 Mas-Coma S and Bargues MD (1997), "Human liver flukes ", A review Res Rev Parasitol, 57, pp 145-218 55 Mas-Coma S., Bargues MD., Esteban JG (1999), “Human fasciolosis in Dalton”, JP Fasciolosis Wallingford, Oxon, UK: CABI Pub pp 411-434 56 McManus DP, Dalton JP (2006), “Vaccines against the zoonotic trematodes Schistosoma Japonicum, Fasciolasis hepatica and Fasciolasis gigantica”, Parasitology, 133 (1), pp 43-61 57 J.A Munguisa-Xoschihua, F Ibarra-Velarde, A Ducoing-Watty, N Montenegro-Cristino and H Quiroz-Romero (2006), “Prevalence of Fasciola hepatica (ELISA and fecal analysis) in ruminants from a semidesert area in the northwest of Mexico”, Parasitology Research, 101 (1), pp 127-130, DOI: 10.1007/s00436-006-0438-y Original Paper (online) 58 Nguyen TGT, De NV, Vercruysse J, Dorny P, Le TH (2009), Genotypic characterization and species identification of Fasciola spp with implications regarding the isolates infecting goats in Vietnam Exp Parasitol 123: 354-361 59 Periago M.V (2006), "Phenotypic comparison of allopatric populations of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica from European and African bovines using a computer image analysis system (CIAS)", Parasitol Res (2006) 99, pp 368-378 60 Periago M.V (2008), "First phenotypic description of Fasciola hepatica/ Fasciola gigantica intermediate forms from the human endemic area of the Nile Delta, Egypt", Infection, Genetics and Evolution, 8, pp 51-58 61 Se – Eun Choe, Thuy Thi – Dieu Nguyen, Tae – Gyu Kang, Chang – Hee Kweon, Seung – Won Kang (2011), “Genetic analysis of Fasciola isolates from cattle in Korea based on second internal transcribed spacer (ITS-2) 68 sequence of nuclear ribosomal DNA”, Parasitol Res, DOI 10.1007/s00436011-2323-6 62 Szymanski, M., M.Z Barciszewska, J Barciszewski, and V.A Erdmann (2000), 5S ribosomal RNA database Y2K Nucleic Acids Res 28, 166-167 63 Thomas H Cribb (2000), Chapter 16 The Digenea, Interrelationships of the Platyhelminthes, R A Bray D T J Littlewood, ed, CRC Press 64 Urquhard GM (1996), "Veterinary Parasitology", Blackwell Science, Oxford 65 Valero MA (1999), "Comparison of adult live flukes from highland and lowland populations of Bolivian and Spainish sheep", J Helminthol, 73, pp 341-345 66 Valero M.A Periago M.V., Panova M., Mas-Coma S (2006), "Phenotypic comparison of allopatric populations of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica from European and African bovines using a computer image analysis system (CIAS)", Parasitol Res (2006) 99, pp 368-378 67 Valero MA, Perez-Crespo I, Periago MV, Khoubbane M, Mas-Coma S (2009), Fluke egg characteristics for the diagnosis of human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F gigantica Acta Trop 111(2):150-159 68 Van de peer Y., Chapelle S., De Wachter R (1996), A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA Nucleic Acids Res 24(17): 3381-3391 69 WHO (1994), Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasite World Health Organization, Geneva 70 WHO (1995), Control of foodborne trematode infections Report of a WHO Study Group WHO technical Report Series, No 849: annex 71 WHO (2006), “Report of the WHO Informal Meeting on use of triclabendazole in fascioliasis control”, WHO headquarters, Geneva, Switzerland, 17-18 October 2006 72 Zarowiecki MZ, Huyse T, Littlewood DT (2007), Making the most of mitochondrial genomes markers for phylogeny, molecular ecology and barcodes in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea) Int J Parasitol 37(12):1401-18 69 PHỤ LỤC Phụ lục 1: So sánh tỷ lệ BL/BW nghiên cứu với BL/BW số nƣớc Loài sán F hepatica Fasciola sp F gigantica F hepatica F gigantica F hepatica F hepatica Fasciola sp Phụ lục 2: So sánh số VS-P nghiên cứu với VS-P số nƣớc Loài sán F hepatica Fasciola sp F gigantica F hepatica F gigantica F hepatica F hepatica Fasciola sp Phụ lục 3: Bảng kết chạy PCR – RFLP mẫu sán trứng sán gan lớn TT Hà Nội Nghệ An Nam Định Thanh Hóa Bắc Giang Hà Nội Nghệ An Nam Định Thanh Hóa 10 Bắc Giang 11 Hà Nội 12 Thanh Hóa 13 Nghệ An Phụ lục 4: So sánh số chiều dài, chiều rộng tỷ số dài/rộng nghiên cứu so với số nƣớc (Valero et al, 2009) Loài sán Fasciola sp F hepatica F hepatica F hepatica F hepatica Fasciola sp Fasciola sp F hepatica Fasciola sp F hepatica F gigantica Fasciola sp F gigantica F gigantica Fasciola sp Fasciola sp ... đề tài: ? ?Áp dụng hình thái học sinh học phân tử định loại sán gan lớn số tỉnh miền Bắc – Việt Nam? ?? nhằm mục tiêu: Xác định đƣợc loài sán gan lớn sử dụng thị hình thái học thị phân tử ITS-2 Chƣơng...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT... tạo quan sán gan lớn Hình 1.3 Hình thể trứng sán gan lớn Hình 1.4 Chu kỳ phát triển sán gan lớn 11 Hình 1.5 Tổn thƣơng gan sán gan lớn siêu âm 15 Hình 1.6 Mơ hình cấu