Xác Định Độc Tố Gây Liệt Cơ (PSP) Trong Nhuyễn Thể Hai Mảnh Vỏ Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN CAO TUẤN MINH XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN CAO TUẤN MINH XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths.PHẠM VĂN HÙNG Ths.HUỲNH THỊ NGỌC LIÊN 2010 LỜI CẢM TẠ Trong suốt q trình học tập trường ngồi nỗ lực thân, em nhận giúp đỡ nhiều người Em xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Dinh dưỡng & Chế biến Thủy Sản - khoa Thủy Sản Trường Đại học Cần Thơ tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích đầy ý nghĩa suốt trình học tập, rèn luyện nghiên cứu trường Em xin bày tỏ cảm ơn sâu sắc đến thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng (NAFIQAD 6), chị Huỳnh Thị Ngọc Liên trưởng phịng Kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản tận tình hướng dẫn giúp đỡ em tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn anh Sơn anh chị phòng Kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nơng Lâm Thủy sản vùng nhiệt tình giúp đỡ em nhiều suốt q trình thực luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn lớp chế biến thủy sản K32 gia đình gắn bó chia sẻ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cần Thơ, tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực Cao Tuấn Minh i TÓM TẮT Đề tài “Xác định độc tố gây liệt (PSP) nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ” thực từ tháng 01/2010 đến tháng 05/2010 Mục tiêu đề tài xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt (PSP) nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng siêu áp ghép hai lần khối phổ (UPLC-MS/MS) Nội dung đề tài tối ưu hóa điều kiện thiết bị UPLC-MS/MS thành phần pha động, điện đầu cone, lượng va chạm….Xác định giới hạn phát (LOD), tính tuyến tính, độ lặp lại, độ tái lặp độ thu hồi phương pháp Kết nghiên cứu cho thấy: điều kiện UPLC-MS/MS tối ưu để kết phân tích xác Giới hạn phát thiết bị UPLCMS/MS: STX ng/g, NEO ng/g, GTX1,3 10 ng/g, GTX2,4 10 ng/g Giới hạn phát phương pháp: STX 10 ng/g, NEO 10 ng/g, GTX1,4 40 ng/g, GTX2,3 40 ng/g Đường chuẩn độc tố có giá trị R2 lớn 0,99, khoảng nồng độ chọn để xây dựng đường chuẩn phù hợp Độ thu hồi trung bình đạt lớn 90% Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L STX 0,511; NEO 0,339; GTX1,4 0,461; GTX2,3 0,442 Tỉ lệ đáp ứng mẫu chuẩn pha dung dịch mẫu MMS sai lệch không 10% cho thấy mẫu khơng ảnh hưởng đến chất phân tích Các thơng số đánh giá q trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp đáp ứng yêu cầu theo quy định AOAC Vì việc xác định hàm lượng độc tố PSP nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ hồn tồn thích hợp để ứng dụng phòng kiểm nghiệm Do thời gian có hạn nên đề tài nghiên cứu khảo sát điều kiện UPLC-MS/MS thông số để xác định giá trị sử dụng phương pháp Nếu có điều kiện nghiên cứu cần khảo sát độc tố khác nhóm PSP xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thiết bị HPLC để so sánh với thiết bị UPLC-MS/MS ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Thời gian thực CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tìm hiểu độc tố gây liệt (PSP) 2.1.1 PSP gì? 2.1.2 Phân loại học công thức cấu tạo độc tố PSP 2.2 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ độc tố PSP 2.2.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.2.2 Mối liên hệ PSP thủy triều đỏ/tảo nở hoa (red tide) 2.2.3 Độc tố PSP nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.2.4 Giới hạn cho phép PSP nhuyễn thể hai mảnh vỏ 2.2.5 Một số trường hợp ngộ độc PSP Việt Nam giới 2.3 Các phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt (PSP) 2.3.1 Xác định PSP phương pháp thử sinh hoá chuột 2.3.2 Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 2.3.4 Phương pháp ELISA 2.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) 2.4 Sắc kí lỏng hai lần khối phổ LC-MS/MS 10 2.4.1 Giới thiệu sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ 10 2.4.2 Nguyên tắc hoạt động LC-MS/MS 10 2.4.3 Loại hợp chất phù hợp phân tích sắc ký lỏng .13 2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chất cột 13 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 iii 3.1 Vật liệu, thiết bị sử dụng qui trình phân tích 15 3.1.1 Địa điểm 15 3.1.2 Nguyên vật liệu .15 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 15 3.1.4 Hóa chất, chất chuẩn 15 3.1.5 Qui trình phân tích PSP LC-MS/MS .17 3.2 Xác định thông số tối ưu: .19 3.2.1 Xác định điều kiện thiết bị UPLC 19 3.2.2 Xác định phân mảnh độc tố .20 3.2.3 Xác định điều kiện đầu dò MS 20 3.2.4 Xác định giới hạn phát thiết bị (ILOD) 22 3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn: .22 3.2.6 Xác định giới hạn phát phương pháp (MLOD) .22 3.2.7 Đánh giá ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích 22 3.2.8 Độ lặp lại, độ tái lặp độ thu hồi phương pháp .23 3.3 Phương pháp tính tốn 23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Xác định thông số tối ưu: .26 4.1.1 Điều kiện thiết bị UPLC 26 4.1.2 Điều kiện đầu dò MS .26 4.1.3 Các phân mảnh ion độc tố .27 4.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 27 4.2.1 Xác định giới hạn phát thiết bị (ILOD) 27 4.2.2 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn 28 4.2.3 Xác định giới hạn phát phương pháp (MLOD) 31 4.2.4 Ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích 33 4.2.5 Độ lặp lại độ tái lặp độ thu hồi phương pháp 33 4.3 Tổng hợp kết 35 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 5.1 Kết luận .36 5.2 Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 PHỤ LỤC .38 iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Cấu tạo, trọng lượng phân tử độc tính PSP Bảng 3.1: Bảng pha nồng độ dãy chuẩn 17 Bảng 3.2: Các giá trị đề nghị nhà sản xuất cho nguồn ESI (+) .21 Bảng 3.3: Các giá trị đề nghị nhà sản xuất cho phận Analyser 21 Bảng 3.4: Một số mảnh ion dự kiến 22 Bảng 3.5: Độ lệch tương đối tỉ lệ ion chuẩn mẫu 22 Bảng 4.1: Các phân mảnh độc tố STX, NEO, GTX 1,4, GTX 2,3 27 Bảng 4.2: Kết khảo sát giá trị ILOD 28 Bảng 4.3: Nồng độ độ đáp ứng STX 28 Bảng 4.4: Nồng độ độ đáp ứng NEO 29 Bảng 4.5: Nồng độ độ đáp ứng GTX1,4 .30 Bảng 4.6: Nồng độ độ đáp ứng GTX 2,3 30 Bảng 4.7: Tổng hợp kết khảo sát độ tuyến tính .31 Bảng 4.8: Kết xác định giới hạn phát phương pháp 32 Bảng 4.9: Kết ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích 33 Bảng 4.10: Kết tính tốn độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi 34 Bảng 4.11: Tổng hợp kết .35 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Cơng thức cấu tạo độc tố PSP Hình 2.2: Hệ thống LC-MS/MS 10 Hình 2.3: Pha tĩnh cột sắc ký pha đảo 11 Hình 2.4: Pha tĩnh cột sắc ký pha thuận 12 Hình 2.5: Sơ đồ cấu tạo đầu dị Quadrupole 13 Hình 2.6 khả tách cột C8 C18 14 Hình 2.7 Ảnh hưởng pH dung môi đến khả tách chất 14 Hình 2.8 Ảnh hưởng độ phân cực dung mơi q trình sắc ký 14 Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn STX 29 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn NEO 29 Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn GTX 1,4 30 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn GTX 2,3 31 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Những chữ viết tắt sau sử dụng đề tài luận văn: ACN Acetonitrile AOAC Association of Analytial Communities (Hiệp hội nhà phân tích) ASP Amnesic Shellfish Poisoning (độc tố gây trí nhớ) DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning (độc tố gây tiêu chảy) EU European Union (liên minh Châu Âu) ELISA Enzyme-Link ImmunoSorbent Assay (phương pháp miễn dịch) GC Gas Chromatograph (phương pháp sắc ký khí) GTX Gonyautoxin HMV Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ HPLC High pressure Liquid chromatography (phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao) ILOD Instrumental limit of detection (giới hạn phát thiết bị) LC-MS/MS Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer (sắc ký lỏng ghép lần khối phổ) LOD Limit of detection (giới hạn phát hiện) MLOD Method limit of detection (giới hạn phát phương pháp) Nafiqad Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng NEO Neosaxitoxin NPLC Normal Phase Liquid Chromatography (cột sắc ký lỏng pha thuận) PSP Paralytic Shellfish Poisoning (độc tố gây liệt cơ) RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography (cột sắc ký lỏng pha đảo) STX Saxitoxin UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng) vii CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong nhiều năm qua ngành thủy sản có đóng góp đáng kể vào tổng thu nhập quốc dân, sản phẩm thủy sản mặt hàng xuất chủ lực nước ta (theo số liệu Cục Hải quan tính đến hết tháng 10-2009, xuất thủy sản đạt 995,5 tấn, trị giá 3.487,5 triệu USD) Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ (HMV) đóng góp đáng kể sản lượng kim ngạch, nghêu đối tượng có sản lượng thu lại kim ngạch cao điều thể qua việc giá nghêu thị trường ngày tăng, từ 800 đồng/kg vào năm 1994, xấp xỉ 20.000 đồng/kg Chính thế, nghề ni nghêu ngày phát triển nhiều địa phương ven biển nước ta Các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ với đặc tính sinh học loài ăn lọc trực tiếp loài vi tảo có lồi vi tảo độc, chúng có khả tích lũy độc tố vi tảo (độc tố gây trí nhớ (ASP) độc tố gây tiêu chảy (DSP) độc tố gây liệt (PSP)) thể với thời gian dài không gây hiệu ứng độc với thân chúng Nhưng độc tố tích lũy lại mối nguy hại lớn cho người sinh vật khác tiêu thụ hai mảnh vỏ bị nhiễm độc tố Hiện nay, có nhiều phương pháp để xác định độc tố PSP nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp thử sinh hóa chuột, phương pháp miễn dịch (ELISA), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS) Tuy nhiên, phương pháp LC-MS/MS phương pháp nhiều phòng kiểm nghiệm giới áp dụng, đặc biệt hệ thống phòng kiểm nghiệm Liên Minh Châu Âu phương pháp phân tích có khả định danh phân loại xác thành phần độc tố nhóm PSP chúng bị nhiễm vào thực phẩm Châu Âu thị trường nhập lớn ngành thủy sản Việt Nam Theo quy định Ủy ban liên minh Châu Âu, để nước khối EU phép xuất thủy sản vào EU yếu tố quan trọng hệ thống phịng kiểm nghiệm tham gia vào cơng tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nước xuất khẩu, phải tương đương với phòng Kiểm nghiệm EU với địi hỏi nghiêm ngặt kỹ thuật phân tích Chính việc nghiên cứu đề tài “Xác định độc tố gây RSD = SD _ × 100% (3-3) x Trong đó: SD: độ lệch chuẩn xác định theo cơng thức (3-2) _ x : nồng độ trung bình lần phân tích, xác định theo cơng thức (3-1) Độ lệch chuẩn nội phòng (SW/L): n S W /L = ∑ [(n − 1) × SD i i i =1 ] (3-4) n ∑ (n − 1) i i =1 Trong đó: ni: số lần phân tích lặp lại nồng độ thứ i SDi : độ lệch chuẩn nồng độ thứ i, tính theo công thức (3-2) Độ thu hồi phương pháp (%T) %T = y x 100 x (3-5) Trong đó: y nồng độ mẫu phân tích x nồng độ mẫu ban đầu Công thức quy đổi nồng độ độc tố PSP STX equ./kg Ct = C STXequ m i * ve vi * m s (3-6) = C t * f tox (3-7) 24 Trong đó: Ct : Nồng độ độc tố quy đổi (ng/g µg/kg) (toxin concentration in ng/g or µg/kg) mi :nồng độ độc tố chất tiêm vào (ng) (amount of toxin per injection in ng) ms : trọng lượng mẫu (g) (weight of sample in g) ve : Khối lượng chiết (ml) (volume of extraction in ml) vi : Khối lụơng tiêm vào (ml) (volume of injection in ml) C STXequ : nồng độ độc tố quy đổi (ng STX equ./g µg STX equ./kg) (toxin concentration in ng STX equ./g µg STX equ./kg ) f tox : hệ số độc tố ( toxicity factor) 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định thơng số tối ưu: Thực tối ưu hóa điều kiện UPLC-MS/MS theo hướng dẫn phần 3.2 chương ta thu kết sau: 4.1.1 Điều kiện thiết bị UPLC Chương trình pha động: - Tốc độ dòng: 0,400 ml/phút - % Pha động A (Acetonitrile): 30% - % Pha động B (0,1% formic acid nước): 70% - Nhiệt độ cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: 10 µL - Thời gian phân tích: 5phút 4.1.2 Điều kiện đầu dò MS 4.1.2.1 Source (ES+) Kiểu ion hoá: ESI (+) Ðiện mao quản (Capillary) 3.00 (kV) Ðiện đầu Cone (Cone) 14,00 (V) Điện tách (Extractor) 3.00 (V) RF Lens 0,2 (V) Nhiệt độ nguồn (Source Temperature) 120 (°C) Nhiệt độ khử dung mơi (Desolvation Temperature) 400 (°C) Tốc độ khí qua khối nón (Cone Gas Flow) 40 (L/Hr) Tốc độ dịng khí khử dung mơi (Desolvation Gas Flow) 500 (L/Hr) 4.1.2.2 Buồng phân tích (Analyser) LM Resolution 13.0 HM Resolution 13,0 Ion Energy 0,5 Entrance 26 Collision 18 Exit LM Resolution 13,0 HM Resolution 13,0 Ion Energy 2,5 Multiplier (V) 651 Syringe Pump Flow (µL/min) 30,0 Khí gây phân ly va chạm: Argon (mbar) 3,50e-3 4.1.3 Các phân mảnh ion độc tố Các độc tố STX, NEO, GTX 1,4, GTX 2,3 bị phân ly thành ion liên quan đến cấu trúc Tiến hành thay đổi điều kiện đầu dò khối phổ điện đầu cone, điện va chạm để mảnh ion thu có cường độ cao tỉ lệ ion hai ion ổn định Ta xác định thông số nêu Bảng 4.1 Bảng 4.1: Các phân mảnh độc tố STX, NEO, GTX 1,4, GTX 2,3 Độc tố Ion mẹ (m/z) Ion (m/z) Ðiện đầu cone 300,16 204,1 STX 282,17 300,16 316,16 220,01 NEO 316,16 298,2 298,07 396,12 GTX 1,4 396,12 316,16 412,11 314.2 GTX 2,3 412,11 332,2 (V) Điện va chạm (eV) 25 20 25 16 26 19 26 19 16 18 16 10 15 20 15 16 4.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp dựa theo tiêu chuẩn AOAC ta tiến hành đánh giá thông số sau: 4.2.1 Xác định giới hạn phát thiết bị (ILOD) Thực phân tích dãy chuẩn nồng độ khác STX, NEO, GTX 1,4 GTX 2,3 nhằm xác định giới hạn phát thiết bị Kết khảo sát trình bày Bảng 4.2 27 Bảng 4.2: Kết khảo sát giá trị ILOD Nồng độ (ng/g) Chuẩn 1,0 2,5 5,0 10,0 S/N STX 35,586 47,524 123,906 558,371 NEO 16,591 20,457 36,739 76,033 Không xác định Không xác định GTX1,4 GTX2,3 Không xác định Không xác định Không xác định Không xác định 19,582 23,768 Kết khảo sát giới hạn phát thiết bị, cho thấy nồng độ chuẩn ng/g (đối với STX, NEO) 10 ng/g (đối với STX, NEO) ) ion cho tín hiệu/nhiễu lớn Như vậy, Giá trị LOD thiết bị UPLCMS/MS dùng để thực đề tài là: STX ng/g NEO ng/g GTX1,3 10 ng/g GTX2,4 10 ng/g 4.2.2 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính phương pháp, thực chạy dãy chuẩn với nồng độ Sau ta xây dựng đường chuẩn dung dịch dựa nồng độ độ đáp ứng (response) Kết cụ thể sau: STX Sau tiến hành chạy dãy chuẩn với nồng độ STX ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml 80 ng/ml ta kết sau (Bảng 4.3): Bảng 4.3: Nồng độ độ đáp ứng STX STT Nồng độ chuẩn (ng/ml) 10,00 20,00 40,00 80,00 Độ đáp ứng 453,365 614,216 1446,683 2658,739 Tỉ số ion 1,001 0,977 0,964 1,040 Từ Bảng 4.3 xây dựng đường chuẩn STX dựa độ đáp ứng nồng độ đo được, thu kết theo đồ thị sau (Hình 4.1) 28 3000 y = 33,81x 2500 R = 0,9936 Độ đáp ứng 2000 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Nồng độ STX Hình 4.1 Đồ thị đường chuẩn STX NEO Sau tiến hành chạy dãy chuẩn với nồng độ NEO ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml 80 ng/ml ta kết sau (Bảng 4.4): Bảng 4.4: Nồng độ độ đáp ứng NEO STT Nồng độ chuẩn (ng/ml) Độ đáp ứng Tỉ số ion 10,00 20,00 40,00 80,00 419,383 612,920 1234,041 2446,161 1,178 1,238 1,213 1,154 Từ Bảng 4.4 xây dựng đường chuẩn NEO dựa độ đáp ứng nồng độ đo được, thu kết theo đồ thị sau (Hình 4.2) 3000 y = 30,766x Độ đáp ứng 2500 R = 0,9965 2000 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 Nồng độ NEO 60 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn NEO 29 70 80 90 GTX 1,4 Sau tiến hành chạy dãy chuẩn với nồng độ GTX1,4 ng/ml, 40 ng/ml, 60 ng/ml, 100 ng/ml 200 ng/ml ta kết sau (Bảng 4.5): Bảng 4.5: Nồng độ độ đáp ứng GTX1,4 STT Nồng độ chuẩn (ng/ml) Độ đáp ứng Tỉ số ion 40,00 60,00 100,00 200,00 133,543 175,694 288,105 562,963 1,703 1,713 1,939 1,838 Từ Bảng 4.5 xây dựng đường chuẩn GTX1,4 dựa độ đáp ứng nồng độ đo được, thu kết theo đồ thị sau (Hình 4.3) 600 y = 2,8494x Độ đáp ứng 500 R = 0,9974 400 300 200 100 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ GTX1,4 140 160 180 200 220 Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn GTX 1,4 GTX 2,3 Sau tiến hành chạy dãy chuẩn với nồng độ GTX2,3 ng/ml, 40 ng/ml, 60 ng/ml, 100 ng/ml 200 ng/ml ta kết sau (Bảng 4.6): Bảng 4.6: Nồng độ độ đáp ứng GTX 2,3 STT Nồng độ chuẩn (ng/ml) Độ đáp ứng Tỉ số ion 40,00 60,00 100,00 200,00 542,673 635,416 1154,132 2148,512 2,257 2,531 2,475 2,505 Từ Bảng 4.6 xây dựng đường chuẩn GTX2,3 dựa độ đáp ứng nồng độ đo được, thu kết theo đồ thị sau (Hình 4.4) 30 2500 y = 10,959x Độ đáp ứng 2000 R = 0,9937 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ GTX2,3 140 160 180 200 220 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn GTX 2,3 Thảo luận kết quả: Đường chuẩn độc tố STX, NEO, GTX1,4, GTX2,3 có giá trị R2 lớn 0,99, khoảng nồng độ chọn để xây dựng đường chuẩn phù hợp Bảng 4.7 tổng hợp kết khảo sát độ tuyến tính đường chuẩn Bảng 4.7: Tổng hợp kết khảo sát độ tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính (ng/ml) R2 STX 10 - 80 0,9936 NEO 10 - 80 0,9965 GTX1,4 40 - 200 0,9974 GTX2,3 40 - 200 0,9937 TT Độc tố 4.2.3 Xác định giới hạn phát phương pháp (MLOD) Thực phân tích mẫu nghêu trắng thêm chuẩn nồng độ 10 ng/g (STX,NEO) 40 ng/g (GTX1,4, GTX2,3) Các mẫu phân tích cho tín hiệu/nhiễu lớn độ lệch ion tương đối nằm giới hạn cho phép Quyết định 657/2002/EC (kết chi tiết xem Bảng 4.8) Do đó, giới hạn phát phương pháp độc tố sau STX 10 ng/g NEO 10 ng/g GTX1,4 40 ng/g GTX2,3 40 ng/g 31 Bảng 4.8: Kết xác định giới hạn phát phương pháp Kết (ng/g) S/N Tỉ số ion Độ lệch ion tương đối STX 9,82 351,747 108,82% 8,24% 7,88 386,374 100,46% 0,08% 8,33 404,612 99,57% 0,96% 9,37 429,207 100,18% 0,36% 7,07 312,506 105,16% 4,60% 7,97 357,54 109,26% 8,68% 10,72 296,707 107,19% 6,62% 9,14 372,792 99,07% 1,46% TT Nồng độ mẫu thêm chuẩn (ng/g) 10 Độ lệch cho phép ion tương đối theo Quyết định 657/2002/EC NEO 9.900 320.648 97.94% 17.04% 7,320 244,586 92,00% 9,93% 10,630 401,492 79,65% 4,83% 9,840 329,843 80,73% 3,53% 10,360 393,339 93,10% 11,25% 9,000 315,226 90,90% 8,63% 9,650 402,152 83,80% 0,13% 7,840 452,012 82,80% 1,06% 10 20% Độ lệch cho phép ion tương đối theo Quyết định 657/2002/EC 20% GTX1,4 30,730 115,948 50,86% 8,79% 24,870 138,920 63,38% 13,66% 37,510 171,922 47,48% 14,84% 39,410 236,172 55,30% 0,82% 40 36,160 169,625 52,01% 6,72% 39,860 222,309 45,72% 18,00% 40,090 177,689 57,98% 3,98% 38,540 152,191 55,49% 0,47% Độ lệch cho phép ion tương đối theo Quyết định 657/2002/EC 20% GTX2,3 32,340 653,069 33,96% 17,25% 20,730 270,249 35,18% 14,29% 35,750 527,776 42,55% 3,69% 45,020 709,157 37,08% 9,65% 40 34,990 504,083 37,89% 7,68% 39,630 646,506 43,92% 7,03% 45,370 686,984 43,89% 6,96% 42,43% 3,38% 25% 34,890 503,427 Độ lệch cho phép ion tương đối theo Quyết định 657/2002/EC 32 4.2.4 Ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích Thực đánh giá ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích theo phương pháp Matrix Matched Standard (MMS), kết thu sau (Bảng 4.9): Bảng 4.9: Kết ảnh hưởng mẫu đến chất cần phân tích Độ đáp ứng Độc tố STX Nồng độ Mẫu chuẩn pha TT (ng/g) dung dịch (A) Mẫu MMS (B) 10 668,233 669,515 692,939 660,721 655,860 642,592 10 483,557 472,647 494,189 481,309 464,070 471,191 40 145,220 144,469 138,494 145,121 132,163 136,291 40 380,358 397,460 390,463 366,626 383,828 387,463 Độ lệch mẫu A so với mẫu B (%) Giá trị độ lệch cao NEO Giá trị độ lệch cao GTX1,4 Giá trị độ lệch cao GTX2,3 Giá trị độ lệch cao 1,12% 2,04% 7,27% 7,27% 0,46% 1,81% 4,65% 4,65% 0,07% 8,52% 1,59% 8,52% 3,61% 3,43% 0,77% 3,61% Kết khảo sát cho thấy tỉ lệ đáp ứng mẫu chuẩn pha dung dịch mẫu MMS sai lệch không 10% Do đó, kết luận mẫu khơng ảnh hưởng đến chất phân tích 4.2.5 Độ lặp lại độ tái lặp độ thu hồi phương pháp Phân tích lặp lại ngày khác ngày mẫu thêm chuẩn (mẫu chuẩn bị theo mục 3.1.5) kết trình bày Bảng 4.10 33 Bảng 4.10: Kết tính tốn độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi Mẫu thí nghiệm Nồng độ mẫu thêm chuẩn (ng/g) 10 10 10 10 Trung bình n=4 Độ thu hồi Độ lệch chuẩn SD Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) Độ lệch chuẩn nội phịng SW/L Mẫu thí nghiệm Nồng độ mẫu thêm chuẩn (ng/g) 10 10 10 10 Trung bình n=4 Độ thu hồi Độ lệch chuẩn SD Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) Độ lệch chuẩn nội phịng SW/L Mẫu thí nghiệm Nồng độ mẫu thêm chuẩn (ng/g) 40 40 40 40 Trung bình n=4 Độ thu hồi Độ lệch chuẩn SD Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L Mẫu thí nghiệm Nồng độ mẫu thêm chuẩn (ng/g) 40 40 40 40 Trung bình n=4 Độ thu hồi Độ lệch chuẩn SD Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L STX Ngày Nồng độ mẫu thêm chuẩn đo (ng/g) 9,820 8,880 8,530 9,370 9,150 Ngày Nồng độ mẫu Độ thu thêm chuẩn đo hồi (%T) (ng/g) 98,20% 9,070 88,80% 8,970 85,30% 10,120 93,70% 9,140 91,50% 9,325 92,38% 0,564 0,535 6,165 5,733 0,511 NEO Ngày Ngày Nồng độ mẫu Nồng độ mẫu Độ thu thêm chuẩn đo thêm chuẩn đo hồi (%T) (ng/g) (ng/g) 9,900 99,00% 9,360 9,220 92,20% 9,000 9,930 99,30% 9,650 9,840 98,40% 8,940 9,723 97,23% 9,238 94,80% 0,337 0,332 3,467 3,591 0,339 GTX1,4 Ngày Ngày Nồng độ mẫu Nồng độ mẫu Độ thu thêm chuẩn đo thêm chuẩn đo hồi (%T) (ng/g) (ng/g) 37,730 94,33% 38,160 37,870 94,68% 39,860 37,510 93,78% 39,090 38,410 96,03% 38,540 37,880 94,70% 38,913 95,99% 0,383 0,738 1,011 1,897 0,461 GTX2,3 Ngày Ngày Nồng độ mẫu Nồng độ mẫu Độ thu thêm chuẩn đo thêm chuẩn đo hồi (%T) (ng/g) (ng/g) 36,340 90,85% 36,990 36,730 91,83% 37,630 35,750 89,38% 36,370 36,020 90,05% 37,890 36,210 90,53% 37,220 91,79% 0,422 0,681 1,166 1,830 0,442 34 Độ thu hồi (%T) 90,70% 89,70% 101,20% 91,40% 93,25% Độ thu hồi (%T) 93,60% 90,00% 96,50% 89,40% 92,38% Độ thu hồi (%T) 95,40% 99,65% 97,73% 96,35% 97,28% Độ thu hồi (%T) 92,48% 94,08% 90,93% 94,73% 93,05% Kết tính tốn cho thấy: Độ thu hồi trung bình STX 92,38%, NEO 94,80%, GTX1,4 95,99%, GTX2,3 91,79% Độ thu hồi trung bình đạt lớn 90% , Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L STX 0,511 ,NEO 0,339, GTX1,4 0,461, GTX2,3 0,442 4.3 Tổng hợp kết Các kết thu trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp tổng hợp trình bày Bảng 4.11 Bảng 4.11: Tổng hợp kết Thông số đánh giá STX NEO GTX1,4 GTX2,3 R2 0,9936 0,9965 0,9974 0,9937 Giới hạn phát thiết bị ILOD ng/g ng/g 10 ng/g 10 ng/g 10 ng/g 10 ng/g 40 ng/g 40 ng/g 7,27% 4,65% 8,52% 3,61% Giới hạn phát phương pháp MLOD Độ lệch cao mẫu pha dung dịch mẫu MMS Độ thu hồi 92,38% 94,80% 95,99% 91,79% Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L 0,511 35 0,339 0,461 0,442 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Trong khoảng thời gian thực tập quan, đề tài thu số kết định: Các điều kiện UPLC-MS/MS tối ưu để kết phân tích xác Giới hạn phát thiết bị UPLC-MS/MS: STX ng/g, NEO ng/g, GTX1,3 10 ng/g, GTX2,4 10 ng/g Đường chuẩn độc tố STX, NEO, GTX1,4, GTX2,3 có giá trị R lớn 0,99, khoảng nồng độ chọn để xây dựng đường chuẩn phù hợp Giới hạn phát phương pháp độc tố sau: STX 10 ng/g, NEO 10 ng/g, GTX1,4 40 ng/g, GTX2,3 40 ng/g Độ thu hồi trung bình STX 92,38%; NEO 94,80%; GTX1,4 95,99%; GTX2,3 91,79% Độ thu hồi trung bình đạt lớn 90% Độ lệch chuẩn nội phòng SW/L STX 0,511; NEO 0,339; GTX1,4 0,461; GTX2,3 0,442 Tỉ lệ đáp ứng mẫu chuẩn pha dung dịch mẫu MMS sai lệch không 10% cho thấy mẫu khơng ảnh hưởng đến chất phân tích Các thơng số : giới hạn phát hiện, tính tuyến tính, độ thu hồi, độ tái lặp, độ lặp lại đánh giá trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp đáp ứng yêu cầu theo quy định AOAC Vì việc xác định hàm lượng độc tố PSP nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ hồn tồn thích hợp để ứng dụng phòng kiểm nghiệm 5.2 Đề xuất Do thời gian có hạn nên đề tài nghiên cứu khảo sát điều kiện UPLC-MS/MS thông số để xác định giá trị sử dụng phương pháp Nếu có điều kiện nghiên cứu cần khảo sát nhiều độc tố khác nhóm PSP xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thiết bị HPLC để so sánh với thiết bị UPLC-MS/MS 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Minh Phú, Vương Thanh Tùng, Lê Bảo Ngọc – Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ Bài giảng Phân Tích Thực Phẩm Thủy Sản Nguyễn Ngọc Hân, 2008 Khảo sát thực trạng nhiễm dư lượng kháng sinh hóa chất nguyên liệu cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cần Thơ vùng lân cận Luận văn tốt nghiệp chuyên nghành Chế biến thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Trần Phương Ngọc Hân, 2008 Tìm hiểu phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản phòng kiểm nghiệm NAFIQAD 6- Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp chuyên nghành Chế biến thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Khai, 2008 Đánh giá điều kiện an toàn vệ sinh vùng thu hoạch sị lơng, sị lụa Kiên Giang Luận văn tốt nghiệp chuyên nghành Chế biến thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Phạm Văn Hùng, Melamine, 2008, Tham luận Đại hội nghị kiểm soát thức ăn thủy sản, 2008, Cần Thơ Đào Việt Hà, 2004 Hàm lượng số độc tố vi tảo nghêu meretrix lyrata vẹm xanh perna viridis số khu vực nuôi trọng điểm miền trung nam Việt Nam Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ, 2002 Neurologic illness associated with eating Florida pufferfish Một số tài liệu Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản Vùng cung cấp AOAC, 2007 Phụ lục C D 10 Katrin Erler, Karin Röder, Bernd Luckas, 2008 Determination of PSP toxins by HPLC and LC-MS/MS application 11 http://emedicine.medscape.com/article/818505-overview (truy cập ngày 10/12/2009) 12 http://www.rimf.org.vn/bantin/print.asp?news_id=141 (truy cập ngày 10/12/2009) 13 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Thuc-an-o-nha-hang-Trong-Com-co-doc-tocuc-1 nguy-hiem/45198715/248/ (truy cập ngày 10/12/2009) 14 http://congnghehoahoc.org/forum/showthread.php?t=2765 (truy cập ngày 10/12/2009) 15 http://congnghehoahoc.org/forum/showthread.php?t=2765 (truy cập ngày 10/12/2009) 37 PHỤ LỤC Phụ lục A : Hình ảnh số thiết bị sử dụng trình thực đề tài Hình: Máy li tâm Hình : Hệ thống khí Nitơ Hình: Thiết bị UPLC-MS/MS 38 ... ? ?Xác định độc tố gây liệt (PSP) nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ” cần thiết 1.2 Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xác định. .. Các phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây liệt (PSP) Hiện có nhiều phương pháp phân tích độc tố gây liệt như: phương pháp thử sinh hóa chuột, phương pháp miễn dịch (ELISA), phương pháp sắc ký. .. CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN CAO TUẤN MINH XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN