Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Trương Nam Hải TS Đỗ Thị Huyền Hà Nội - Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa tác giả cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Thảo LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải TS Đỗ Thị Huyền phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thu nhận, hướng dẫn tận tình, quan tâm tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án Luận án thực phòng Kỹ thuật di truyền Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ đề tài Nghị định thư với Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam kỹ thuật Metagenomics” Trong thời gian học tập nghiên cứu phịng Kỹ thuật di truyền, tơi nhận giúp đỡ bảo tận tình chuyên mơn tập thể cán nghiên cứu phịng Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giảng dạy bảo cho kiến thức chuyên môn kỹ cần thiết Để hồn thành luận án, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình đồng nghiệp công tác khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu đó! Với tất lịng biết ơn, tơi xin dành cho gia đình, bố mẹ, chồng con, người thân thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn tơi thời gian qua! Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU 14 Tính cấp thiết đề tài 18 Mục tiêu đề tài 20 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 Nội dung nghiên cứu 20 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 20 Đóng góp đề tài 20 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 21 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE 21 1.1.1 Cellulose 22 1.1.2 Hemicellulose 23 1.1.3 Lignin 24 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE 24 1.2.1 Cơ chế hoạt động cellulase thủy phân cellulose .24 1.2.2 Cấu trúc cellulase 26 1.2.2.1 Cấu trúc chung cellulase 26 1.2.2.2 Cellulosome thủy phân cellulose 27 1.3 CELLULASE CỦA VI KHUẨN 28 1.3.1 Sơ lược họ cellulase 28 1.3.2 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ 30 1.3.2.1 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ ưa ấm 30 1.3.2.2 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ ưa nhiệt 31 1.3.3 Ứng dụng cellulase 31 1.3.3.1 Ứng dụng cellulase công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế biến thực phẩm thức ăn 32 1.3.3.2 Ứng dụng cellulase dệt may 33 1.3.3.3 Ứng dụng cellulase chế biến bột giấy giấy .33 1.3.3.4 Ứng dụng cellulase sản xuất cồn sinh học 34 1.4 MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE 35 1.4.1 Sơ lược mối đa dạng mối Việt Nam 35 1.4.2 Hệ vi sinh vật ruột mối bậc thấp 36 1.4.3 Sự tiêu hóa lignocellulose mối 38 1.4.4 Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase sinh vật đường ruột mối bậc thấp 39 1.5 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS .41 1.5.1 Phương pháp tiếp cận tìm gen Metagenomics 42 1.5.2 Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen 43 1.5.3 Khai thác phân lập gen từ liệu trình tự DNA đa hệ gen 45 1.5.3.1 Phương pháp giải trình tự số hệ thống máy hệ 45 1.5.3.2 Tập hợp read thành contig 47 1.5.4 Ứng dụng Metagenomics 50 1.5.4.1 Ứng dụng Metagenomics khai thác gen đánh giá đa dạng vi sinh vật 50 1.5.4.2 Tiềm ứng dụng Metagenomics 53 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 55 2.1.1 Đối tượng vật liệu 55 2.1.2 Hóa chất thiết bị máy móc 56 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 58 2.2.1 Các phương pháp vi sinh 59 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 59 2.2.2.1 Tách chiết DNA hệ gen mối 59 2.2.2.2 Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối tách chiết DNA đa hệ gen chúng 59 2.2.2.3 Tinh DNA đa hệ gen phương pháp máng đơn (troughing) 60 2.2.2.4 Giải trình tự DNA đa hệ gen máy giải trình tự hệ HiSeq2000 Illumina 61 2.2.2.5 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E coli sốc nhiệt 62 2.2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli 63 2.2.2.7 Phương pháp cắt ghép nối gen 63 2.2.2.8 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit 64 2.2.2.9 Kỹ thuật PCR 64 2.2.2.10 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen egc 66 2.2.2.11 Điện di DNA gel agarose 66 2.2.2.12 Phương pháp biểu gen 66 2.2.2.13 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide-SDS 67 2.2.2.14 Điện di protein gel polyacrylamide không SDS 68 2.2.3 Các phương pháp hóa sinh protein 68 2.2.3.1 Phương pháp tinh chế protein sắc kí lực his-tag 68 2.2.3.2 Định lượng protein phương pháp Bradford 69 2.2.3.3 Định lượng đường khử phương pháp DNS 69 2.2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase 70 2.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase β-xylosidase 71 2.2.3.6 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ, pH, ion kim loại số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase 72 2.2.3.7 Xác định độ bền enzyme 72 2.2.3.8 Xác định thông số động học enzyme 72 2.2.4 Các phương pháp tin sinh học xử lý số liệu phần mềm sinh học 73 2.2.4.1 Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối 73 2.2.4.2 So sánh trình tự ORF liệu DNA đa hệ gen với CSDL NCBI 74 2.2.4.3 Thiết kế mồi phần mềm FastPCR 75 2.2.4.4 Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gen quan tâm phần mềm trực tuyến RestrictionMapper 75 2.2.4.5 Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin chương trình dịch mã ExPASy 75 2.2.4.6 Xây dựng phát sinh loài loài mối nghiên cứu với loài mối khác phần mềm Genedoc MEGA5 75 2.2.4.7 Dự đoán cấu trúc EGC phần mềm Phyre2 76 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ 77 3.1.1 Tách chiết DNA hệ gen mối 79 3.1.2 PCR khuếch đại đoạn DNA gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối 79 3.1.3 Phân tích sản phẩm PCR 76 3.2 TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN RUỘT MỐI C gestroi 86 3.2.1 Tách chiết tinh DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 86 3.2.2 Đọc phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 87 3.2.2.1 Tập hợp trình tự xác định gen 87 3.2.2.2 Đa dạng vi sinh vật ruột mối C gestroi 90 3.3 GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT MỐI C gestroi .96 3.3.1 Dự đoán chức gen DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 96 3.3.2 Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose 98 3.3.3 Lựa chọn ORF cellulase để biểu 100 3.4 TÁCH DÕNG GEN egc 104 3.4.1 Trình tự ORF GL0130684 105 3.4.2 Khuếch đại gen egc 105 3.4.3 Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng pJET1.2/blunt 106 3.4.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E coli DH10b 107 3.4.5 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế 108 3.4.6 Phân tích trình tự gen wegc phân lập từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 108 3.4.7 Khuếch đại gen egc khơng chứa tín hiệu tiết từ khn pJET-wegc 111 3.4.8 Thiết kế vector biểu gen egc 111 3.4.8.1 Ghép nối gen egc vào vector biểu 111 3.4.8.2 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc 113 3.5 BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E coli BL21(DE3) 114 3.5.1 Chọn dòng biểu gen egc tế bào E coli BL21(DE3) 114 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu gen egc tế bào E coli BL21(DE3) 116 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến hiệu cảm ứng 117 3.5.4 Điện di kiểm tra hoạt tính endoglucanase EGC 119 3.5.5 Tinh chế protein EGC cột sắc kí lực His-tag 120 3.5.6 Tính đặc hiệu chất EGC 124 3.5.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase EGC 126 3.5.8 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính EGC 127 3.5.9 Độ bền nhiệt EGC 128 3.5.10 Ảnh hưởng số ion kim loại hóa chất lên hoạt tính EGC 128 3.5.11 Đặc điểm động học EGC 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO 138 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt BglB BglF BglG BLAST bp BSA BWA CBD CD cDNA Cel12A Cel45A (EGV) Cel48A Cel5A Cel6A 229 GL0091291 230 GL0092426 231 GL0094183 232 GL0094836 233 GL0095956 234 GL0096807 235 GL0096889 236 GL0098639 237 GL0107561 238 GL0107996 239 GL0115386 240 GL0116273 241 GL0119019 242 GL0119032 243 GL0119661 244 GL0123936 245 GL0124511 246 GL0124809 247 GL0125293 248 GL0127047 249 GL0128670 192 250 GL0129877 251 GL0131070 252 GL0105118 253 GL0067692 254 GL0071847 255 GL0006163 256 GL0010047 257 GL0024269 258 GL0025309 259 GL0038846 260 GL0045454 261 GL0052442 262 GL0077130 263 GL0077351 264 GL0091471 265 GL0091598 266 GL0111694 267 GL0000188 268 GL0001647 269 GL0078548 270 GL0129240 271 GL0130373 272 GL0086178 273 GL0029222 274 GL0126118 275 GL0013032 276 GL0124161 277 GL0026343 278 GL0057988 279 GL0125533 193 280 GL0033071 281 GL0005295 282 GL0016616 283 GL0069142 284 GL0091439 285 GL0017040 286 GL0074695 287 GL0111138 288 GL0040861 289 GL0130684 290 GL0001673 291 GL0048564 292 GL0096142 293 GL0103547 294 GL0100330 295 GL0054843 296 GL0089085 297 GL0105391 298 GL0029085 299 GL0066724 300 GL0018286 301 GL0059546 302 GL0010783 303 GL0041367 304 GL0103808 305 GL0021006 306 GL0046788 307 GL0053543 308 GL0056332 309 GL0063511 310 GL0085423 194 311 GL0071734 312 GL0076105 313 GL0009916 314 GL0050528 315 GL0071975 316 GL0101018 BGL: β-glucosidase; Glu1,3-Bglu: glucan endo-1,3-beta glucosidase Số lượng gen 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 ABCD EFGH I J KLMNOPQRSTUVWZ Các lớp chức Phụ lục Các lớp chức gen dự đoán vi sinh vật sống ruột mối Coptotermes gestroi dưa sở liệu eggNOG A: ARN; B: nhiễm sắc thể; C: lượng; D: Chu kỳ tế bào; E: axit amin; F: nucleotide; G: carbohydrate; H: coenzyme; I: lipid;J: dịch mã; K: phiên mã; L: ADN; M: vỏ; N: vận động tế bào; O: protein turnover; P: vô cơ; Q: trao đổi chất thứ cấp; R: chức chung – general function; S: khơng biết chức năng; T: dẫn truyền tín hiệu; U: tiết; W: ngoại bào; Z: khung tế bào 195 Phụ lục Phụ lục 10 Số liệu read dùng để lắp ráp contig sử dụng tham số k-mer khác k-mer K41 K43 K45 K47 K49 Ghi chú: PE: read có hai đầu giống với trình tự tương ứng contig tập hợp SOAPdenovo; SE: read có đầu giống với trình tự tương ứng contig tập hợp SOAPdenovo 196 * 20 * 40 * -60 * -80 CBuiXuongT:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAACAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 CHungYenVN:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAACAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 CTanLinhVN:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAACAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 CthaiHaVN-:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAATAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 CVanQuanVN:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAATAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 CVongThiVN:TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAACAATTATAAATCAATATAACCAAAA:80 TTACGCTGTTATCCCTAAGGTAATTTAGTCTTACAATCAAAATAAATGGATCAAAATTATATAATCAATATAACCAAAAA * -100 -* -120 -* -140 -* -160 CBuiXuongT:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CHungYenVN:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CTanLinhVN:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CthaiHaVN-:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CVanQuanVN:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CVongThiVN:CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC:160 CTAAGAGGAGTTAAGTACATTCCTCCCATCACCCCAACAAAACAAAAAGCCCACTCACCAAAAATAAACAAACAACAAAC * -CBuiXuongT:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 CHungYenVN:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 CTanLinhVN:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAGCTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 CthaiHaVN-:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 CVanQuanVN:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 CVongThiVN:AAGTAAATAAACCAAATGTCAAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA:240 AAGTAAATAAACCAAATGTCAA CTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAAAACATCTAAGAATTTTAACTCAAAGACCAA * CBuiXuongT:ATTCAATAAAACATTCAACACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTAATGA:320 CHungYenVN:ATTCAATAAAACATTCAACACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTAATGA:320 CTanLinhVN:ATTCAATAAAACATTCAGCACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTAATGA:320 CthaiHaVN-:ATTCAATAAAACATTCAACACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTAATGA:320 CVanQuanVN:ATTCAATAAAACATTCAACACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTACCGA:320 CVongThiVN:ATTCAATAAAACATTCAACACTAAGACAGCCCGTGCCTCGTCAAGCCATTCATTCCAGATCACAATTAAAGAACTAATGA:320 ATTCAATAAAACATTCA * -CBuiXuongT:TTATGCTACCTTTGCACGGTCATAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 CHungYenVN:TTATGCTACCTTTGCACGGTCATAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 CTanLinhVN:TTATGCTACCTTTGCACGGTCATAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 CthaiHaVN-:TTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 CVanQuanVN:TTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 CVongThiVN:TTATGCTACCTTTGCACGGTCATAATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA:400 TTATGCTACCTTTGCACGGTCA-AATACCGCGGCCCTTCAACACCAAATGTCAGCGGGCAGGCCATACTTCAAAAACTAA * CBuiXuongT:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CHungYenVN:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CTanLinhVN:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CthaiHaVN-:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CVanQuanVN:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CVongThiVN:CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA:430 CAAGAAAAGATGTTTTTGATAAACAGGCGA Phụ lục 11 Mức độ tương đồng vùng trình tự 430 bp gen rRNA 16S ti thể mối Coptotermes thu thập từ địa điểm 197 CTanLinhVN CVanQuanVN CgestEU805727TW CgestFJ376672MY CgestHQ231234IT CgestJX128688CN CgestJX128689TW CgestKC887123CN CheimAY558908IN CheimGQ422885IN CcarvAY558909MY CcurvFJ376681MY CformAB626145JP CformEU805741TW CformEU805742US CformJN615270UK CformKC887106CN CinteAY558904TG CtravFJ915824MY CvastEF379971MY AAACAAACAAC-AA—-A-—AAATAAACCAAATGT-AAACTCTATAGGGTCTTCTCGTCCCACAAA * -CTanLinhVN CVanQuanVN CgestEU805727TW CgestFJ376672MY CgestHQ231234IT CgestJX128688CN CgestJX128689TW CgestKC887123CN CheimAY558908IN CheimGQ422885IN CcarvAY558909MY CcurvFJ376681MY CformAB626145JP CformEU805741TW CformEU805742US CformJN615270UK CformKC887106CN CinteAY558904TG CtravFJ915824MY CvastEF379971MY AACATcTAAGAATTTTAACTCAAA ACCAAATTCAATAAAAcATTCAaCA TAAGACAGC Phụ lục 12 Sự xếp trình tự 126 bp khuếch đại cặp mồi thứ hai từ mẫu mối Văn Quán, Tản Lĩnh trình tự tương ứng sở liệu NCBI phần mềm Genedoc Cgest, Cheim, Ccarv, Ccurv Cform, Cinte Ctrav, Cvast tên viết tắt tương ứng C gestroi, C heimi, C carvinatus, C curvignathus, C 198 formosanus, C intermedius, C travians, C vastator Tên mẫu so sánh gồm viết tắt tên loài, mã số gen ngân hàng gen hai chữ viết tắt quốc gia phát loài mang gen tương ứng Phần dấu chấm thể trình tự nucleotide giống đoạn gen; nucleotide thể sai khác nucleotide gen Vị trí cắt tín hiệu tiết ORF atgatgaacgtagcccgctggatggcgctggtgctgactctgctggtcaccgtacaggcg MMNVARWMALVLTLLVTVQA aacgccgcctgtcgctggccagcatgggatcagtttaaaaaggactatatcagcgacggt NAACRWPAWDQFKKDYISDG gggcgcgtcattgaccccagtgacgcgcgcaaaattaccacctcagaagggcaaagctat GRVIDPSDARKITTSEGQSY gccatgttcttcgcgctggtggcgaatgaccgtagcgcttttgccacgttgtatgactgg AMFFALVANDRSAFATLYDW acacaagacaatctcgcccagggtgatctgagcgcgaatctgcccgcctggctgtggggc TQDNLAQGDLSANLPAWLWG aaaaacgaagataaatgggcgatacttgacagcaactccgcctctgacgccgatctgtgg KNEDKWAILDSNSASDADLW atcgcctggtcgctgatggaagccgggcgcttatggaaggagccacgctacagcgacgcc IAWSLMEAGRLWKEPRYSDA gggaaagggctgctgtcgcggattgctaaagatgaagtggtcactgtgccggggcttggc GKGLLSRIAKDEVVTVPGLG tcgatgctgttgccggggaaagtcggttttgtcgacgacaaaagctggcgtttcaacccc SMLLPGKVGFVDDKSWRFNP agctatttcccgccgcaactgaccagttactttgcccgtcttggcgcgccgtggagcaca SYFPPQLTSYFARLGAPWST ttgcgggaaactaacctgcgcctgctgctggaaactgcgccaaaaggtttttcgccggac LRETNLRLLLETAPKGFSPD tgggtgcgctatgaaaaagacaaaggctggcagttaaagcaggataagacgctggttggc WVRYEKDKGWQLKQDKTLVG agctatgacgcgattcgcgtctatctgtgggcgggcatgctgcacgacagcgatccgcaa SYDAIRVYLWAGMLHDSDPQ aaagcgcgcctgctgaagcgctttaacccgatggcagtgcaaaccacccgtgaaggattg KARLLKRFNPMAVQTTREGL ccgccggagaaagttgatatcgcgaccggcaaggtcaccaataccggcccggtcgggttc PPEKVDIATGKVTNTGPVGF tcggcctcgctgctgcctttcttacaaaatcgcgatgcccaggctgttcagcgccagcgc SASLLPFLQNRDAQAVQRQR gtggcggataacttccctggcgcggacgcctattttaactatgtgctaaccctgtttgga VADNFPGADAYFNYVLTLFG caaggctgggatcaacaccgttttcgtttcaccgcccgcggtgaattactacctgactgg QGWDQHRFRFTARGELLPDW ggccaggaatgcgcaagttcacagtaa G Q E C A S S Q - Phụ lục 13 Trình tự nucleotide axit amin tương ứng ORF GL0130684 (gen egc) đọc máy HiSeq2000 Illumina 199 Vị trí cắt tín hiệu tiết Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 361 Query 421 Sbjct 421 Query 481 Sbjct 481 Query 541 Sbjct 541 Query 601 Sbjct 601 Query 661 Sbjct 661 Query 721 Sbjct 721 200 ATGATGA ||||||||| ATGATGA AACGCCG ||||||||| AACGCCG GGGCGCG ||||||||| GGGCGCG GCCATGT ||||||||| GCCATGT ACACAAG ||||||||| ACACAAG AAAAACG ||||||||| AAAAACG ATCGCCT ||||||||| ATCGCCT GGGAAAG ||||||||| GGGAAAG TCGATGC ||||||||| TCGATGC AGCTATT ||||||| AGCTATT TTGCGGG ||||||||| TTGCGGG TGGGTGC ||||||||| TGGGTGC AGCTATG ||||||||| AGCTATG Query 781 Sbjct 781 Query 841 Sbjct 841 Query 901 Sbjct 901 Query 961 Sbjct 961 Query 1021 Sbjct 1021 Query 1081 Sbjct 1081 Phụ lục 14 So sánh trình tự nucleotide ORF GL013068 gen wegc phân lập từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối Query: trình tự ORF GL013068; Sbjct: trình tự gen wegc 201 ... ? ?Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khu? ??n ruột mối kỹ thuật Metagenomics? ?? 19 Mục tiêu đề tài Phân lập, tách dịng biểu gen mã hóa cellulase từ DNA đa hệ gen vi khu? ??n...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHU? ??N RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN... VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHU? ??N RUỘT MỐI C gestroi 86 3.2.1 Tách chiết tinh DNA đa hệ gen vi khu? ??n ruột mối C gestroi 86 3.2.2 Đọc phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khu? ??n