Chiết xuất và phân lập thành phần saponin trong rễ thân cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) thu hái ở tây bắc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ THUỲ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN L ẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ THUỲ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC Khoá: QH.2013.Y Ngƣời hƣớng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG ThS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khố luận nhận đƣợc nhiều giúp đỡ từ thầy cơ, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên mơn Hố dƣợc Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời thầy hết lòng bảo, hƣớng dẫn động viên suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ biết ơn chân thành đế n thầy cô Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc gia Hà Nội, Ths Nguyễ n Thị Hoàng Anh, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập làm khố luận Và tơi xin cảm ơn chị Thuỷ- Khoa Dƣợc trƣờng Đại học y dƣợc Thái Nguyên, chị Huệ bạn Phƣợng, Chuyên, Phƣơng- Khoa Y Dƣợc trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội đồng hành suốt thời gian qua Lời cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên tơi giúp đỡ động viên học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Đặng Thị Thuỳ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng - Tổng quan 1.1.Tổng quan chung sâm vũ diệp 1.1.3 Đặc điểm thực vật, phận dùng 1.1.4 Phân bố sinh thái 1.1.5 Tác dụng dƣợc lý 1.1.7 Thành phần hoá học 1.2.Tổng quan phƣơng pháp sắc ký 1.2.1 Sắc ký cột 1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3.Tổng quan phƣơng pháp xác địn 1.3.1 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 1.3.2 Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS) Chƣơng - Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.Đối tƣợng nghiên c ứ u 2.2.Phƣơng tiện nghiên c ứu 2.2.1 Dung mơi, hố ch ấ t 2.2.2 Thiết bị, dụ 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp xử lý chiết mẫu 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập tinh chế hợp chất hoá học 2.3.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích định tính hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao Chƣơng 3- Kết thực nghiệm bàn luận 3.1.Chiết xuất tinh chế hợp chất sap 3.1.1 Chiết xuất phân lập 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc SKLM 3.2.Xác định cấu trúc saponin phân l 3.2.1 Hợp chất số 3.2.2 Hợp chất số 3.3 Phân tích định tính dấu vân tay hố học hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao 22 Chƣơng - Bàn luận 23 4.1 Về xử lý chiết mẫu phân lập chất tinh khiết 23 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 24 4.3 Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD HPLC 24 Chƣơng - Kết luận kiến nghị 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance DEPT DEPT IR Infrared HPLC High performance liquid chromatography 1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance MS Mass spectrum NMR Nuclear magnetic resonance Rf Retardation factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet VIS Visible DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Cấu trúc hố học 10 saponin tách đƣợc từ thân rễ SVD Hình Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sapa, Lào Cai 15/07/2016 Hình Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng Hình Sơ đồ phân lập sắc ký hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH Hình Sắc ký đồ chất số số phân lập đƣợc sau phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH Hình Cấu trúc hóa học Hình Cấu trúc hóa học Hình Sắc ký đồ HPLC (A), (B) cao butanol SVD DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng Các hợp chất saponin phân lập từ SVD 13 13 Bảng Số liệu phổ H C-NMR, DEPT hợp chất số Bảng Số liệu phổ H C-NMR hợp chất số ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam vùng đất nhiều loài thảo dƣợc quý đặc biệt loài thuộc chi sâm Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thuốc quý thuộc chi Sâm (Panax) đƣợc sử dụng thuốc truyền th ống có tiềm để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ loài khác chi Gần sâm vũ diệp đƣợc hoá bƣớc đầu đƣợc trồng thử nghiệm số địa phƣơng nhƣ Hà Giang Lào Cai [1; 13] Về mặt y học, thân rễ sâm vũ diệp đƣợc sử dụng làm thuốc bổ có mặt số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc Ở Việt Nam giới, tổng quan tài liệu th ấ y khơng có nhiều nghiên cứu thành phần hố học tác dụng sinh h ọ c dƣợc liệu sâm vũ diệp Vì vậy, việc nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hố học tác dụng sinh học để thu thập thêm chứng khoa h ọc nâng cao hiệu sử dụng loại dƣợc liệu quý hứa hẹn nhiều kết có giá trị khoa học thực tiễn Năm 2017 vừa qua, nhóm nghiên cứu Khoa Y Dƣợc Đại học Quốc Gia Hà Nội thực nghiên cứu bƣớc đầu thành phần hoá học thân rễ sâm vũ diệp thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn phân cực ethyl acetat [7; 8] Tiếp nối nghiên cứu thực đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng Tây Bắc” Kết đề tài góp phần xây dựng sở liệu thành phần hố học, từ làm tiền đề cho nghiên cứu sâu nhƣ định tính định lƣợng nhƣ nghiên cứu tác dụng sinh học loài sâm Mục tiêu đề tài bao gồm: Chiết xuất phân lập hợp chất saponin phân đoạn n-butanol thân rễ sâm vũ diệp Xác định cấu trúc hoá học saponin phân lập đƣợc Xây d ựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp sắc ký lỏng hiệu cao Đề tài phần đề tài cấp Nhà nƣớc thuộc Chƣơng trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạ o sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et K.M.)”, mã số: KHCN-TB.07C/13-18 Chƣơng - Tổng quan 1.1 Tổng quan chung sâm vũ diệp 1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh Sâm vũ diệp có tên khác vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thấ t, trúc tiết nhân sâm, tam thất xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên th ấ t, nữu tử thất, tam thất lông chim, hƣơng sơn tam thất (Trung Quốc) có tên khoa khoa học Panax bipinnatifidus Seem [1; 12] Một số tên đồng danh SVD: Aralia bipinnatifida (Seem.) C B Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng Wall var major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall spp Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12] 1.1.2 Vị trí phân loại [2] Trong hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Nhân sâm (Panax L.) 1.1.3 Đặc điểm thực vật, phận dùng Cây thân thảo sống nhiều năm Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20-30 cm, thƣờng đơn độc, mọc thẳng, r ỗng giữa, có vạch dọc, thƣờng lụi tàn vào mùa đông, mọc chồi thân từ tháng đến đầu tháng dƣơng lịch Lá kép chân vịt, gồm 2-3 mọc vịng Lá chét 5-7 (ít 3) thn, dài 2,5-14 cm, rộng 1,5-4 cm, gốc trịn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có cƣa, có lơng Cụm hoa tán đơn, mọc ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 2090 hoa; cuống hoa mảnh dài 1-1,5 cm Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn thân, cánh hoa, bầu 2-3 Quả mọng, hình cầu dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, chín màu đỏ, có chấm đen to đầu, chứa 1-2 hạt Hạt hình cầu gần 25 Tung NH, Quang TH et al (2011), "Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420 26 Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636 27 Yang W Z, Hub Y., Wu W Y., et al (2014), “Saponins in the genus Panax L (Araliaceae): A systemic review of their chemical diversity”, Phytochemistry, 106, pp 7-24 28 Yoshikawa M, Murakami T et al (1996), "Bioactive saponins and glycosides VII On the hypoglycemic principles from the root cortex of Aralia elata Seem.: Structure related hypoglycemic activity of oleanolic acid oligoglycoside", Chem Pharm Bull, 44(10), pp 1923-1927 PHỤ LỤC Phụ lục - Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục - Phổ hợp chất số (Stipuleanosid R2 ) Phụ lục 2.1 Phổ ESI-MS [M-H]- chất số 1 Phụ lục 2.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (MeOD, 500 MHz) chất số Phụ lục 2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Phụ lục 2.4 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR – DEPT chất số 13 C-NMR (MeOD, 125 MHz) chất số Phụ lục - Phổ hợp chất số (araloside A methyl ester) + Phụ lục 3.1 Phổ ESI-MS [M+Na] chất số Phụ lục 3.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400 MHz) chất số Phụ lục 3.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz) chất số Phụ lục Hình ảnh sắc ký lớp mỏng trình phân lập hai hợp chất Phụ lục - Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục - Phổ hợp chất số (Stipuleanosid R2 ) Công thức: C53H84O23 Công thức phân tử Phụ lục 2.1 Phổ ESI-MS [M-H]- chất số 1 Phụ lục 2.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (MeOD, 500MHz) chất số Phụ lục 2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR – DEPT chất số 13 Phụ lục 2.4 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân C-NMR (MeOD, 125 MHz) chất số Phụ lục - Phổ hợp chất số (araloside A methyl ester) Công thức: C48H76O18 Công thức phân tử + Phụ lục 3.1 Phổ ESI-MS [M+Na] chất số Phụ lục 3.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR (CD3OD, 400MHz) chất số 13 Phụ lục 3.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân C-NMR (CD3OD, 100 MHz) chất số 4391 2706 0445 7075 3919 9270 6394 3639 7799 2821 9083 5055 8266 9336 3041 2673 2475 1081 5280 0714 9155.40 2942 1389 6905 0856 3820 7278 7854 1806 2464 4029 6334 6910 7486 1603 2179 2755 3332 7942 8600 2470 3046 7656 1279 8030 3546 9929 3227 7728 4643 4583 2821 4923 5296 4149 6866 0488 2064 3639 5873 1235 2706 4275 C:\WINNMR\COMMON\DATAM\data\Tung\PBF223_13c.als aut o 1970 1822 8524 4341 20 0 10 PP M 15 Phụ lục 4: số hình ảnh sắc ký lớp mỏng trình chiết xuất phân lập ... QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ THU? ?? CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... sâm Mục tiêu đề tài bao gồm: Chiết xuất phân lập hợp chất saponin phân đoạn n-butanol thân rễ sâm vũ diệp Xác định cấu trúc hoá học saponin phân lập đƣợc Xây d ựng dấu vân tay sắc ký sâm vũ diệp. .. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem. ) thu? ??c quý thu? ??c chi Sâm (Panax) đƣợc sử dụng thu? ??c truyền th ống có tiềm để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe nhƣ loài khác chi Gần sâm vũ diệp