Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml.

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Đào Nguyệt Sương Huyền NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUI TRÌNH TỎNG HỢP NGUYÊN LIỆU MESNA VÀ ỨNG DỤNG BÀO CHẾ THUỐC TIÊM Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIÉN s ĩ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiếm nghiệm thuốc Trung Ương Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đình Luyện PGS.TS Nguyễn Văn Hân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: Phòng Hội thảo - Trường Đại học Dược Hà Nội Vào hồi phút ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt 13C-NMR ^ -N M R BP dd DĐVN đvC ESI-MS HPLC KLPT ICH IR Rf RSD SKLM t°nc t°pư ÍR TLTK Vmax USP Chú thích Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-ỉ Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (.Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Dược điển Anh (The British Pharmacopoeia) Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Dung dịch Dược điển Việt Nam Đơn vị carbon Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass spectrometry) Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) Khối lượng phân tử Hội nghị hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) Phô hông ngoại (Infrared Spectroscopy) Hệ số lưu giữ (Retention factor) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation) Sắc ký lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ phản ứng Thời gian lưu Tài liệu tham khảo Số sóng cực đại (em'1) Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) M Ở ĐẦU Tính cấp thiết luận án Theo thống kê tổ chức Y tế giới tỉ lệ ca tử vong ung thư 70% Các oxazaphosphorin ifosfamicỊ, cyclophosphamid có tác dụng hiệu nhiều loại ung thư khác Tuy nhiên nhóm có độc tính cao tủy xương, thận bàng quang Mesna (natri 2suỉfanyỉethansuỉfonaf) định bắt buộc trình trị liệu, tương tác với chất chuyển hóa (bao gồm acrolein) thuốc kháng ung thư, làm giảm độc đối vói đường tiết niệu Ưu điểm lán sử dụng mesna vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính bàng quang acrolein (hạn chế tác dụng không mong muốn CYP IFM) vừa không ảnh hưởng đến tác dụng thuốc ung thư dùng đồng thời Cấu tạo mesna có hai nhóm chức thiol sulíbnat, nối cầu ethylen Tuy cấu trúc đơn giản, dược chất lại dễ bị oxy hóa, đặc biệt mơi trường giàu khí oxy Do cần có biện pháp để tổng hợp, tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn chống oxy hóa dược chất bào chế Sản xuất nguyên liệu làm thuốc Việt Nam cịn thiếu nhiều ngun nhân, cần đề cập tói qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế tạp chất chưa đạt yêu cầu giá thành nguyên liệu cao Mesna nằm danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam lần thứ VI vói dạng bào chế viên nén 400 mg, 600 mg dung dịch tiêm 100 mg/ml Là dược chất sử dụng nhiều điều trị chưa nghiên cứu sản xuất nưóc Do vậy, vấn đề nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp cơng bố giới tìm kiếm phương pháp mói tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu bào chế thành phẩm nước việc làm cần thiết Từ thực tế đó, luận án tiến hành nhằm xây dựng phương pháp tổng hợp mói, cải tiến qui trình tổng hợp cũ để thu nguyên liệu ứng dụng bào chế thuốc tiêm Các mục tiêu luận án sau: ỉ Thiết kế phương pháp tổng hợp mesna 2 Xây dựng quỉ trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ Đánh giá độc tính cấp, độ ổn định nguyên ỉiệu mesna Xây dựng công thức bào che đề xuất tiêu chuẩn sờ dung dịch tiêm mesna ỉ 00 mg/mỉ Những đóng góp luận án - Đã thiết kế, xây dựng 02 phương pháp mói tổng hợp mesna qua trung gian muối Bunte monoalkyltrithiocarbonat Ket thực nghiệm bưóc đầu xác định số tính chất lý hóa cung cấp liệu phổ (1R, MS, NMR) chất trung gian quan trọng 6, 7, 7a - Đã xây dựng qui tình tổng hợp tinh chế mesna qui mơ 200 g/mẻ phương pháp mói qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat với hiệu suất 52,1% tính từ natri 2-cloroethansulfonat Trong cơng bố qui trình tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015 qui mô 200 g/mẻ sử dụng ethanol 96%, nhiệt độ 55 °c - Lần Việt Nam thử nghiệm độ ổn định nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat Khả oxy hóa ngun liệu mesna khơng khí, sở cho trình bảo quản, sử dụng nguyên liệu bào chế - Lần Việt Nam cơng bố liệu độc tính cấp mesna tổng hợp theo phương pháp mói (qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat) phù hợp với liệu độc tính mesna cơng bố giới Mesna tổng hợp được, không phân loại độc theo đường uống độc tính trung bình theo đường tiêm tĩnh mạch Ket cho phép sử dụng nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp mói để nghiên cứu bào chế - Lần Việt Nam xây dựng thẩm định phương pháp định lượng mesna dung dịch tiêm HPLC sử dụng cột c 18 (250 X 4,6 mm; 10 ỊLim), detector u V, bước sóng phát 215 nm Phương pháp định lượng đơn giản, phù hợp với thiết bị có - Lần Việt Nam xây dựng công thức bào chế dd tiêm mesna 100 mg/ml từ nguyên liệu mesna (được tổng hợp theo phương pháp mói), sử dụng chất chống oxy hóa dinatriedetat (0,25 mg/ml), dd natri hydroxyd IM điều chỉnh pH 7,2-7,6 Cấu trú c luận án Luận án gồm 167 trang, 71 bảng, 11 hình 60 sơ đồ Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (35 trang); Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu (13 trang); Thực nghiệm K ết (64 trang); Bàn luận (40 trang); K ết luận đề xuất (2 trang); Danh mục cơng trình cồng bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 134 tài liệu tham khảo (10 trang) 72 phụ lục Chương I TÔNG QUAN Tống quan tính chất lý hóa mesna Cấu trúc hóa học Hg^ \ ^ s°3Na Công thức phân tử: C2H 5Na S2, Khối lượng phân tử: 164,17 đvC Thành phần: c 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; o 29,24%; s 39,06% Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat Mesna bột kết tinh trắng vàng nhạt, dễ hút ẩm Tan tự nước, không tan cyclohexan Phương pháp định lượng theo BP 2015: chuẩn độ thể tích (chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm làm khan) Mesna hợp chất có chứa nhóm thiol nên dễ bị oxy hóa hợp chất peroxid, halogen, ion kim loại, oxid kim loại, oxy Nó có vai trị nucleophyl Đặc điểm dược lý Mesna có tác dụng tiêu chất nhầy giống ÀT-acetyl-L-cystein dùng làm thuốc long đờm Nhóm thiol tự mesna kết hợp trực tiếp với liên kết đôi acrolein với chất chuyển hóa 4hydroxyoxazaphosphorin (như 4-hydroxycyclophosphamid 4hydroxyifosfamid) để tạo thành hợp chất khơng độc hại ngăn cản hình thành acrolein Ngồi ra, mesna cịn tăng đào thải cystein, chất phản ứng hóa học với acrolein góp phần bảo vệ đường tiết niệu Chỉ định: Mesna định để dự phòng tác dụng độc hại đối vói đường tiết niệu dùng hóa trị liệu ifosfamid cyclophosphamid Neu dùng ifosfamid cỵclophosphamid liều 10 mg/kg phải dùng kèm mesna - Nghiên cứu động vật thực nghiệm cho thấy chưa có chứng tác dụng gây đột biến, ung thư, quái thai mesna Tống quan phương pháp tống hợp mesna Sơ đồ 1.6 Các phương pháp tống hợp mesna cơng bố Hiện có 03 phương pháp để tổng hợp mesna: qua trung gian muối thiouroni, thioester muối xanthat (sơ đồ 1.6) Ngoài trình tổng hợp dimesna, mesna tạo chất trung gian, sử dụng tác nhân NaSH H S, phương pháp khơng đề cập đến hiệu suất q trình tinh chế mesna Đe tài tổng quan phương pháp tổng hợp nhóm thiol, nhấn mạnh đến số phương pháp qua trung gian muối Bunte alkyl trithiocarbonat phương pháp tổng hợp nhóm thiol cơng bố Tổng quan bào chế mesna Đã tổng quan số nghiên cứu liên quan đến dạng bào chế mesna, số biện pháp chống oxy hóa dung dịch dược chất có chứa nhóm thiol Đe tài tổng quan số nghiên cứu liên quan đến độ ổn định dd tiêm mesna Chương NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thuốc thử Các nguyên liệu, hóa chất loại đạt tiêu chuẩn DĐVN, BP, USP tinh khiết phân tích Các dung mơi sử dụng cho phân tích đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Chất chuẩn mesna hàm lượng 98% 2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm Sử dụng thiết bị tổng hợp phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Cơng nghệ dược phẩm quốc gia, Phịng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3 Nội dung nghiên cứu Tổng hợp hóa học: Khảo sát qui trình tổng hợp mesna qui mơ phịng thí nghiệm theo 04 đường, qua chất trung gian muối thiouroni (con đường I), thioester (con đường II), muối Bunte (con đường III), alkyl trithiocarbonat fcon đường IV) Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn phản ứng tốt Lựa chọn dung môi để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015 Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp để xây dựng qui trình tổng hợp mesna qui mơ 200 g/mẻ Đánh giá độc tính ngun liệu mesna tổng hợp theo phương pháp Theo dõi độ ổn định nguyên liệu mesna Bào chế dung dịch tiêm mesna: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng mesna, đề xuất tiêu chuẩn chất lượng dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml Nghiên cứu xây dựng công thức lựa chọn phương pháp bào chế dd tiêm mesna 100 mg/ml Nghiên cứu độ ổn định dự đoán tuổi thọ dung dịch tiêm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tong hợp xác định cấu trúc mesna Tổng hợp hóa học thực Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội phản ứng hữu cơ bản: alkyl hóa, acyl hóa, thủy phân, sắc ký cột trao đổi ion, số phương pháp tạo muối - Tinh chế chất trung gian sản phẩm cuối: kết tinh phân đoạn, lọc, cất, sắc ký cột, chiết rắn-lỏng - Xác định điểm kết thúc phản ứng sơ kiểm tra độ tinh khiết đo nhiệt độ nóng chảy SKLM mỏng Silicagel F254 Merck vói hệ dung mơi thích hợp Hệ A: «-BuOH : AcOH : H 2O = 9,0 : 2,0 : 2,5; Hệ B: nBuOH : AcOH : H20 = 5,0 : 2,5 : 2,5; Hệ C: «-BuOH : AcOH : H20 = 6,0 : 2,0 : 2,0; Hệ D: «-BuOH : AcOH : H20 = 9,0 : 6,0 : 6,0 Khẳng định cấu trúc sản phẩm mesna chất trung gian tổng hợp dựa liệu phổ IR, MS, NMR 11 MHz, D 2O), (ppm): 2,87-2,90 (2H, m, H-2); 3,18-3,21 (2H, m, H-l) 13CNMR (125 MHz, D20), (ppm): 54,37 (0-1); 18,43 (C-2) Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp mesna từ 2,8 g thioester íhiệu suất cao 75,9 %): t°pư: 50 °C; Tỉ lệ mol NH3: thioester : 1; Thể tích nước 19 ml Hiệu suất tổng hợp mesna qua trung gian thioester tính từ chất 53,9± 2,25%, hàm lượng mesna 88,3 ± 1,46% 3.1.4 Tong hợp mesna qua trung gian muối Bunte Tổng hợp natri £-(2-sulfonatoethyl)sulfurothioat (muối Bunte 6) từ 2, sử dụng natri thiosulfat pentahydrat, hiệu suất 78,8%, t°nc: 230,5-233,0 °c (phân hủy), R/ = 0,28 (hệ B) IR (KBr), -Umax (cm'1): 2987 2926 (C-H no); 1188, 1134 1039 (SO3 -) ESI-MS (MeOH), m/z: 221,1 [M-2Na+H]‘ (CTPT C2H 4Na S3Oổ5 M = 266,22 đvC) ‘H-NMR (500 MHz, D20), (ppm): 2§ (ppm): 2,81-2,89 (2H, m, H-2); 3,03-3,08 (2H, m, H-l) 13CNM R (125 MHz, D20), (ppm): s (ppm): 30,02 (C-2); 52,49 (C-l) Các thông số tối ưu cho phản ứng tổng hợp muối Bunte từ 1,0 g chất (hiệu suất cao 82,1 ± 0,36%): Tỉ lệ mol chất : Na2 S2 ĩỈ = : 1,1; Tỉ lệ nước : ethanol = : ; t°pư: hồi lưu; Dung mơi tinh chế: methanol : nưóc (50 : 1) Cl g N iijS ^ ^ -" ^ S O jN a NaOjS natri 2-doroethansulfonat ^ ^ S O jN a natri 5^2-mlfomtoe*hyl)*ulfuToibioat (2) Mtsn» (9) » ,N aO H pH ~ 6,6 HjO/H* HS'-^ 'S 3H 2-merwptoethan5nlfo£iic (8) Tổng hợp mesna từ 6, sử dụng HCl thủy phân, dung dịch NaOH điều chỉnh pH 6,6, tinh chế ethanol 96%, hiệu suất 32,4%, t°nc: 264,1 267,0 °c, R /= 0,61 (hệ B) IR (KBr), ũmax (cm4): 2972 2924 (C-H no); 2571 (S-H); 1130 1049 (SCV) ESI-MS (MeOH), m/z: 141,2 [M-Na](CTPT C2H5N a03S2, M = 164,17 đvC) ‘H-NM R (500 MHz, D20), (ppm): 2,84-2,87 (2H, m, H-2); 3,15-3,18 (2H, m, H-l) 15C-INlMDR (125 MHz, DMSO-d6) (ppm): 19,79 (C-2); 55,21 (C-l) Các thông số sau khảo 12 sát phản ứng tổng hợp mesna từ 1,0 g chất (hiệu suất cao 35,7%): 25ml dung mơil,4-dioxan : nưóc (1,5 : 1), acid HC1 đặc thủy phân 70 °c Hiệu suất tổng hợp mesna từ 2: 29,3± 0,88%, hàm lượng 88,1 ±0,47% 3.1.5 Tồng hợp mesna qua ừung gian alkyl trithiocarbonat C1'—^SOjNa NijCS, nsttri 2-elaroe*awulfonat ỉa S.S>C^SX N ^ SQaJfa M oooalkyi tritìdocartKmât ỡ) etìiaimi]frrtiic (*) Tổng hợp natri 2-(dithiocarboxylatothio)ethansulfonat (7) từ 2, sử dụng dd natri trithiocarbonat 40%, hiệu suất 69,9% (tính theo 2), t°nc: 210,0 216.0 ° c (phân hủy), R/= 0,45 (hệ B) IR (KBr), vmax (em'1): 2972 2927 (C-H no); 1130 (C = S); 1197 1053 (SO3 -) ESI-MS (MeOH), m/z: 238,99 [M-Na]' (CTPT C3H4Na03S4, M = 262,30 đvC) ‘H-NM R (500 MHz, DMSO-đe), (ppm): 3,16-3,20 (2H, m, H -l); 2,68-2,71 (2H, m, H2) 13C-NMR (125 MHz, DMSO-70 %) làm giảm lượng nưóc phản ứng dẫn tới q trình thủy phân diễn khơng hồn tồn Điều bàn luận nghiên cứu động học acid phân muối Bunte tác giả L.Kice (1962) Do hiệu suất tổng hợp mesna theo phương pháp thấp 4.1.5 Phản ứng tống hợp mesna qua trung gian alkyl trithiocarbonat Các tài liệu nghiên cứu thủy phân alkyl trithiocarbonat thủy phân dẫn chất monoalkyl dialkyl trithiocarbonat để tạo thiol (-SH) Điều làm sở cho tổng hợp dẫn chất monoalkyl trithiocarbonat dialkyl trithiocarbonat 7a Hai chất chưa công bố TLTK Đe kiểm sốt việc hình thành chất hay 7a, điều chỉnh tỉ lệ mol natri trithiocarbonat so vói chất Tổng hợp mesna từ trình thủy phân monoalkyl trithiocarbonat môi trường H+ tạo aciđ 8, sau q trình điều chỉnh pH tạo natri 2~mercaptoethansulfonat Theo số TLTK, phản ứng xảy theo chế thủy phân Tuy nhiên thực phản ứng tổng hợp trung gian vói định hưóng tạo dạng dialkỵl trithiocarbonat không thu mesna Cơ chế đề xuất c c Greco D J Martin sau: -^ s n N a\ s ^ C ^ s / \ ^ S