Mục đích của luận án nhằm Hoàn chỉnh và xây dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ. Đánh giá nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tiền sản giật tình trạng bệnh lý thai nghén gây ra, rối loạn nghiêm trọng thường biểu sau tuần thứ 20 thai kỳ, xác định có tăng huyết áp, protein niệu kèm theo phù kèm theo triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng khác [1],[2],[3] Tiền sản giật xảy tất nước giới, nước phát triển phát triển, tỷ lệ mắc tiền sản giật thai phụ khoảng - 8% Tiền sản giật tác động nhiều đến mẹ thai nhi, hậu gây biến chứng nặng cho mẹ: sản giật, rau bong non, rối loạn đông máu, suy gan, suy thận,…., tiền sản giật nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho mẹ; thai nhi gây hậu quả: thai chậm phát triển, suy thai, … Hiện nay, với tiến khoa học kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử khơng ngừng ứng dụng rộng rãi lĩnh vực y học Việc phát DNA phôi thai tự lưu hành tuần hoàn thai phụ mở hướng chẩn đốn trước sinh kỹ thuật không xâm lấn [4] Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương, huyết thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai, tăng cao bất thường liên quan đến biến chứng thai kỳ (tiền sản giật, đẻ non, thai lệch bội nhiễm sắc thể 21, ) thải trừ nhanh chóng sau sinh [5],[6] Nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ tăng cao có ý nghĩa lần từ tuần thai thứ 17 lần thứ vào thời điểm tuần trước có triệu chứng lâm sàng tiền sản giật [7] Điều gợi ý khả ứng dụng kỹ thuật định lượng DNA phôi thai tự để sàng lọc phát sớm thai phụ có nguy tiền sản giật Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA thai từ tuần thứ thai kỳ sở kỹ thuật áp dụng vào chẩn đốn trước sinh khơng xâm lấn cách xác hiệu việc theo dõi, dự đoán nguy mẹ thai nhi trình thai nghén [8],[9],[10] Ở Việt Nam, chẩn đoán tiền sản giật dựa vào triệu chứng bệnh: huyết áp cao, protein niệu, bên cạnh việc theo dõi phát tiền sản giật dựa vào triệu chứng bệnh nhân phát tự đến khám: phù, nhức đầu,… Các xét nghiệm sàng lọc định lượng dấu ấn αFP, HCG, uE3 tính đặc hiệu, chẩn đốn theo dõi dọc khơng cao [11] Với mục đích nghiên cứu vai trị DNA phơi thai tự tiền sản giật để giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm dấu ấn sinh học dự báo sớm, theo dõi tiên lượng tiền sản giật nhằm nâng cao chất lượng sống, tiến hành nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật" với mục tiêu sau: Hoàn chỉnh xây dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ Đánh giá nồng độ DNA phơi thai tự huyết tương thai phụ bình thường thai phụ tiền sản giật Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ DNA PHÔI THAI TỰ DO LƯU HÀNH TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ 1.1.1 Nguồn gốc DNA phôi thai tự Mặc dù DNA phôi thai huyết tương thai phụ biết đến với nhiều ứng dụng tiềm chế sinh học lại nhiều điều chưa sáng tỏ Có khả nguồn gốc DNA phơi thai tuần hồn tế bào thai có nhân máu mẹ [12] Nghiên cứu Sekizawa CS (2000) thấy có lượng lớn tế bào thai có nhân chết theo chương trình giải phóng DNA phơi thai vào huyết tương thai phụ [13] Đó lý mà số lượng tế bào thai nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ bị tiền sản giật có nguy sinh lệch bội tăng cao bất thường [14],[15],[16] Theo Lo CS (1999), DNA phôi thai tự giải phóng thời kỳ khác không theo cách từ nguồn gốc [14] Có nhiều giả thuyết nguồn gốc mơ học DNA phơi thai tuần hồn thai phụ, có khả năng: từ tế bào thai có nhân lưu hành vịng tuần hồn mẹ, từ rau thai trao đổi trực tiếp phân tử DNA 1.1.1.1 Nguồn gốc DNA phôi thai tự từ tế bào thai có nhân lưu hành tuần hoàn mẹ Theo Rudin CS (1997) hàng ngày có phân chia 1011–1012 tế bào lượng tương đương để trì cân mơ, có khoảng 1–10g DNA bị thải trừ ngày có mặt huyết tương [17] Còn Bianchi CS (1997) tiến hành kỹ thuật PCR định lượng dựa tế bào nguyên vẹn máu thai phụ phát khoảng tế bào thai có nhân/1ml máu tồn phần thai phụ mang thai bình thường Từ đó, tác giả cho tế bào thai có nhân tuần hồn thai phụ nguồn gốc mơ học thích hợp DNA phơi thai tự [12] Căn vào nghiên cứu Fournie CS (1993) Sekizawa CS (2000), Bianchi CS (2004) cho DNA phôi thai tự giải phóng vào máu mẹ tác động hệ thống miễn dịch mẹ tế bào thai chết theo chương trình [13],[18],[19] Các tế bào acid nucleic thai tuần hoàn thai phụ tăng biến chứng thai nghén tiền sản giật thai lệch bội, điều cho phép nghĩ chúng tồn mối liên quan Để tìm hiểu mối liên quan tế bào hồng cầu có nhân thai với nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ, Zhong CS (2002) sử dụng máu toàn phần thai phụ mang thai nam (gồm: nhóm bình thường nhóm có nguy tiền sản giật, đẻ non), tiến hành đồng thời phương pháp: lai chỗ huỳnh quang để đếm số tế bào thai kỹ thuật PCR xác định nồng độ DNA phôi thai tự [20] Kết cho thấy khơng có mối liên quan tế bào thai DNA phôi thai tự trường hợp Điều gợi ý rằng, tế bào hồng cầu có nhân thai khơng phải nguồn gốc DNA phôi thai tự máu thai phụ có nguy đẻ non, nhóm lượng DNA phôi thai tự tăng cách có ý nghĩa mà khơng có tăng tương ứng tế bào hồng cầu có nhân thai Angert CS (2003) giả sử sau lấy máu vào ống nghiệm, tế bào thai chết theo chương trình tan rã hết ống nghiệm giải phóng DNA chúng; tế bào thai bị tan rã sau tiếp xúc với hệ thống miễn dịch mẹ dẫn đến giải phóng DNA phơi thai nhiều hơn; sau tiến hành nghiên cứu mẫu huyết tương thai phụ lấy lần vào thời điểm khác tháng đầu tháng cuối định lượng DNA nhiễm sắc thể (NST) Y - dấu ấn thai DNA β-globin - dấu ấn DNA thai mẹ thời điểm vòng 24 Kết thời điểm vòng 24 giai đoạn thai kỳ khơng có tăng DNA phơi thai ống nghiệm [21] Như vậy, tế bào huyết học thai ống nghiệm nguồn gốc quan trọng DNA phôi thai tự 1.1.1.2 Nguồn gốc DNA phôi thai tự từ rau thai Rau thai nguồn gốc hợp lý DNA phơi thai kích thước tế bào hoạt động phong phú Rất nhiều nghiên cứu thấy có mối liên hệ nồng độ DNA phôi thai tự lưu hành tuần hoàn mẹ với tuổi thai [13],[22],[23] Sekizawa CS (2003) nghiên cứu 15 thai phụ (hình thức đẻ mổ lấy thai) có tuổi thai gồm thai phụ tiền sản giật 10 thai phụ bình thường, tác giả phân tích cặp mẫu huyết tương mẹ huyết tương (lấy từ máu dây rốn con), sử dụng dấu ấn khác NST 13, 18 21 để phân biệt DNA phôi thai tự với DNA mẹ Kết cho thấy nồng độ trung bình DNA phơi thai huyết tương dây rốn (trung vị 0.9%, khoảng 0.2 - 8.4%) thấp đáng kể so với DNA huyết tương mẹ (14.3%, 2.3 - 64%) với p = 0,007; từ đó, tác giả khẳng định DNA phơi thai tự lưu hành tuần hồn thai phụ có nguồn gốc từ rau thai [24] Với mục đích để chứng minh giả thuyết DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ có nguồn gốc chủ yếu từ rau thai, nghiên cứu năm 2007 tiến hành hai nhóm: nhóm gồm 15 thai phụ bình thường tuần thứ 11 thai kỳ (11 thai phụ mang thai nam 04 thai phụ mang thai nữ) nhóm gồm thai phụ tuần thứ thai kỳ chẩn đoán mang thai khơng phơi (có túi thai khơng có phơi thai), thực tế, nồng độ DNA phôi thai tự có xu hướng cao tập trung nhóm thai phụ mang thai khơng phơi, có lẽ thai phụ trình tế bào rau thai chết theo chương trình tăng cao Kết ủng hộ giả thuyết rau thai nguồn DNA phơi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ [8] 1.1.1.3 Nguồn gốc từ trao đổi trực tiếp phân tử DNA phôi thai tự mẹ thai Nghiên cứu nhiều tác giả khác cho thấy phát DNA phôi thai tự số dịch thể khác mẹ bao gồm dịch ối, nước tiểu, dịch não tủy [25],[26],[27] Và nồng độ DNA phôi thai tự dịch ối cao gấp 100 - 200 lần so với huyết tương thai phụ [28] Với số lượng lớn DNA phơi thai tự dịch ối liệu có làm gia tăng nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ, nhiên, nghiên cứu cho thấy khơng có tương quan nồng độ DNA phôi thai tự dịch ối DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ Zhong CS (2006) nghiên cứu mối tương quan nồng độ DNA phôi thai tự dịch ối huyết tương thai phụ mang thai dị tật kỹ thuật Realtime PCR, kết cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự nước ối trung bình 3978 copy/ml nước ối huyết tương 96,6 copy/ml huyết tương thai phụ, nhiên, khơng có tương quan đáng kể nồng độ DNA phôi thai tự dịch ối huyết tương thai phụ Như vậy, màng ối khơng góp phần vào diện DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ [27] Một nghiên cứu định lượng nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương, dịch ối khoang màng ối thai phụ tuần thứ - 9, kết nồng độ DNA phôi thai tự dịch ối cao nhất, khoang màng ối thấp huyết tương thai phụ thấp [29] Một số tác giả cho kích thước DNA phơi thai tự tuần hoàn thai phụ 100 - 300bp, tương đương khoảng 30 - 90kDa, khẳng định DNA phôi thai tự dịch ối trao đổi trực tiếp với tuần hoàn thai phụ Như vậy, có mặt DNA phơi thai tự dịch ối tuần hồn q trình trao đổi trực tiếp từ thai vào dịch ối từ thai vào tuần hoàn mẹ Điều cho phép nghĩ đến trao đổi trực tiếp phân tử DNA phôi thai tự qua rau thai qua dịch ối Có thể cho phần lớn DNA phơi thai tự tuần hồn thai phụ có nguồn gốc từ rau thai, ngoại lệ có nguồn gốc từ tế bào thai có nhân tuần hồn thai phụ có khả từ thai thơng qua trao đổi trực tiếp 1.1.2 Kích thước DNA phơi thai tự Để phân biệt DNA phôi thai tự hay DNA có nguồn gốc từ thai phụ lưu hành tuần hoàn thai phụ, nhiều nghiên cứu tiến hành Năm 2004, Chan KC CS nghiên cứu để xác định phân bố kích thước DNA lưu hành huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe với cặp mồi gen leptin (gồm mồi xuôi mồi ngược với kích thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng 105bp, 145bp, 201bp, 280bp, 356bp, 449bp, 576bp, 697bp, 798bp), đồng thời với cặp mồi gen SRY xác định phân bố kích thước DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ (gồm mồi xuôi mồi ngược với kích thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng là: 107bp, 137bp, 193bp, 313bp, 392bp, 524bp) Kết cho thấy: 57% DNA người mẹ có kích thước > 201bp; hầu hết kích thước DNA phơi thai tự ngắn ≤ 193bp, 20% kích thước > 193bp, 0% kích thước > 313bp ngắn DNA có nguồn gốc từ mẹ [30] Theo nghiên cứu Li Y CS, sử dụng cặp mồi gen SRY kích thước DNA phơi thai tự < 300bp cịn DNA có nguồn gốc từ mẹ có kích thước phân tử >1kb [31] Nghiên cứu Fan HC CS (2010), sử dụng cặp mồi gen SRY xác định kích thước DNA phơi thai tự khoảng 130 150bp, không dài 250bp [32] 1.1.3 Thời gian bán hủy t/2 DNA phôi thai tự DNA phôi thai tự chiếm khoảng 11 - 13% tổng số DNA lưu hành tuần hoàn thai phụ Thời gian xuất DNA phôi thai tự lưu hành tuần hoàn thai phụ thời điểm thai - tuần nồng độ DNA phôi thai tự tăng dần theo tuổi thai [33] Tốc độ thay DNA phơi thai tuần hồn tác giả nghiên cứu thải trừ DNA phôi thai tuần hoàn sau sinh Năm 1999, Lo CS nghiên cứu thai phụ mang thai nam, thấy thời gian bán hủy t/2 DNA phôi thai tự khoảng 16,3 phút (từ 4–30 phút) [14] Nghiên cứu Smid CS (2003), nồng độ DNA thai sau sinh thấp không phát DNA thai sau sinh ngày [34] Nghiên cứu gần Tsui CS (2012) phát DNA thai nước tiểu thai phụ kỹ thuật MPS (massively parallel sequencing) thải trừ hết sau sinh ngày [35] Năm 2013, Stephanie CS thấy tốc độ giải phóng DNA phơi thai tự vào tuần hoàn thai phụ sau sinh xảy giai đoạn với chế động học khác nhau: giai đoạn ban đầu nhanh với thời gian bán hủy t/2 khoảng 1h, giai đoạn chậm với thời gian bán hủy t/2 khoảng 13h, nhiên sau sinh 1-2 ngày không phát DNA phôi thai tự [36] Do đó, với giả thuyết khơng có thay đổi đột ngột thải trừ DNA phơi thai tự lưu hành tuần hồn mẹ trình chuyển đẻ, tác giả tính tốn để trì tình trạng ổn định, DNA phơi thai tự giải phóng tiếp tục vào tuần hoàn mẹ với tốc độ trung bình 2,24–104 copy/phút Với tốc độ giải phóng thải trừ nhanh chóng, số lượng DNA phơi thai cung cấp tranh toàn cảnh chi tiết theo thời gian sản xuất thải trừ DNA phơi thai tự do, có ích cho giám sát thai nghén 1.1.4 Tình hình nghiên cứu DNA phơi thai tự nước ngồi Việt Nam 1.1.4.1 Ở nước a, DNA phôi thai tự tiền sản giật Hai năm sau phát có DNA phơi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ, Lo CS tiến hành nghiên cứu 20 thai phụ tiền sản giật (TSG), sử dụng kỹ thuật Realtime PCR định lượng nồng độ DNA phôi thai tự chứng minh nồng độ DNA phôi thai tự nhóm thai phụ TSG tăng gấp lần so với nhóm thai phụ bình thường có tuổi thai tương ứng [14] Kết tương tự nghiên cứu số tác giả khác Leung CS (2001) nghiên cứu 18 thai phụ có tuần thai trung bình 17 tuần (dao động từ 11 - 22 tuần) định lượng nồng độ DNA phôi thai trước có triệu chứng TSG 42 copy/ml (dao động 36 – 2375 copy/ml) nhóm chứng (33 thai phụ) nồng độ DNA phơi thai tương ứng 22 copy/ml (dao động từ 4,2 - 300 copy/ml) Zhong CS (2002) thấy có gia tăng nồng độ DNA phôi thai huyết tương thai phụ TSG [16],[20] Một nghiên cứu tiến hành với cỡ mẫu lớn bao gồm 120 thai phụ bình thường 120 thai phụ TSG, tác giả thấy nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ TSG tăng cao gấp 2-5 lần so với nhóm thai phụ bình thường có tuổi thai tương ứng, đồng thời thai phụ tiến triển thành TSG nồng độ DNA phôi thai tự tăng đột ngột vào thời điểm tuần 17 tuần 28, khoảng tuần trước có triệu chứng TSG [37] Năm 2004, Bianchi CS phát thấy nồng độ DNA phôi thai tự mẫu huyết tương tăng lên cách có ý nghĩa lần từ tuần thai thứ 17 lần thứ hai vào thời điểm tuần trước có triệu chứng lâm sàng TSG Tác giả đưa giả thuyết rằng: nồng độ DNA tăng lần hoại tử rau thai tế bào chết theo chương trình, cịn nồng độ DNA tăng lần thứ hai 10 triệu chứng TSG làm rối loạn chức mẹ kéo theo rối loạn tiết DNA phôi thai [19] Zhong CS (2004) định lượng nồng độ DNA phơi thai trước có triệu chứng TSG 423 copy/ml (dao động 97 - 1642 copy/ml), nhóm chứng: 129 copy/ml (dao động từ 31 - 318 copy/ml) [38] Trước đó, Lo CS (1999) chứng minh: bên cạnh nồng độ DNA phôi thai tự tăng cao kèm theo tăng lưu hành tế bào thai có nhân huyết tương thai phụ TSG [14] Nghiên cứu năm 2005, định lượng nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ bình thường thai phụ TSG kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi gen DYS14 thay cặp mồi gen SRY nghiên cứu trước lại thấy nồng độ DNA phơi thai huyết tương nhóm thai phụ TSG tăng cao gấp 10 lần so với nhóm thai phụ bình thường [39] Ban đầu, tác giả cho nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ tăng cao kết hợp rau thai bất thường dẫn tới làm gia tăng nồng độ DNA phôi thai tự chức gan thận bị suy giảm dẫn tới làm giảm độ thải DNA phôi thai tự tuần hoàn [7],[40] Một nghiên cứu khác chứng minh nồng độ DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương nhóm thai phụ TSG cao nhóm thai phụ bình thường tuần 17 - 20 thai kỳ, nhiên, khác biệt không đáng kể nồng độ DNA phôi thai tự hai nhóm tuần từ 25 - 28 thai kỳ khơng có khác biệt tuần từ 13 - 16 thai kỳ [37] Theo nghiên cứu Sifakis CS (2009), thai phụ có nồng độ DNA phơi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ tăng tuần 11- 13 thai kỳ tiến triển thành TSG nặng giai đoạn sau thai kỳ, nhiên, thai phụ tiến triển thành TSG nhẹ nồng độ DNA phôi thai tự tương đương với nhóm thai phụ bình thường [9] Seval M.M CS (2015) dùng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phơi thai tự 16 thai phụ có thai từ ... thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật" với mục tiêu sau: Hoàn chỉnh x? ?y dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phôi thai tự lưu hành huyết. .. huyết tương thai phụ Đánh giá nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ bình thường thai phụ tiền sản giật 3 Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ DNA PHÔI THAI TỰ DO LƯU HÀNH TRONG HUYẾT TƯƠNG... 2.3.4.6 X? ?y dựng đường chuẩn Realtime PCR định lượng DNA phôi thai tự Trước tiến hành định lượng DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR, tiến hành kỹ thuật Realtime PCR với