Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Okadaic axit và Domoic axit trong phần ăn được của M. lyrata bằng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ BIỂN OKADAIC AXIT (THUỘC NHÓM DSP) VÀ DOMOIC AXIT (THUỘC NHĨM ASP) TRONG PHẦN ĂN ĐUỢC CỦA LỒI NGHÊU TRẮNG (MERETRIX LYRATA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC- MS/MS Nguyễn Hữu Phát*, Lê Anh Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các lồi nhuyễn thể tích lũy độc tố gây hại cho sinh vật, độc tố gọi độc tố sinh học biển (marine toxins) Trên giới có nhóm độc tố nhuyễn thể bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA) Mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Okadaic axit Domoic axit phần ăn M lyrata hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng hệ thống LC-MS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 để phân tích Kết quả: Giới hạn định lượng Domoic axit 0,07 mg/kg với hiệu suất thu hồi từ 83-84% giới hạn định lượng Okadaic axit 0,08 mg/kg với hiệu suất thu hồi từ 93-103% Kết luận: Phương pháp có độ nhạy phù hợp với MRL EU cơng bố, có độ ổn định độ đáp ứng với thông số theo yêu cầu trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Từ khóa: domoic axit, okadaic axit, meretrix lyrata ABSTRACT VALIDATION OF A LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE ANALYSIS OF OKADAIC AXIT (DSP GROUP) AND DOMOIC AXIT (ASP GROUP) IN EDIBLE PART OF WHITE CLAM (MERETRIX LYRATA) Nguyen Huu Phat, Le Anh Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 438 – 445 Background: Filter-feeding shellfish species such as mussels, oysters and clams can be contaminated with various types of lipophilic marine toxins The most important marine phycotoxins are shellfish toxins and ciguatoxins Until now, five groups of shellfish toxins have been distinguished, namely: paralytic shellfish toxins causing paralytic shellfish poisoning (PSP); diarrheic shellfish toxins causing diarrheic shellfish poisoning (DSP); amnesic shellfish toxins causing amnesic shellfish poisoning (ASP); neurotoxic shellfish toxins causing neurotoxic shellfish poisoning (NSP); and azaspiracid shellfish toxins causing azaspiracid shellfish poisoning (AZP) Objectives: To validate method for the analysis of Okadaic acid (DSP group) and Domoic acid (ASP group) in edible part of Meretrix lyrata Methods: Chemical method is based on liquid chromatography (LC) coupled with (tandem) mass spectrometry (MS/MS) *Viện Y tế Cơng cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Hữu Phát 438 ĐT: 0969 241 883 Email: huuphatk@gmail.com Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Results: The method performed very well with respect to accuracy, intraday precision (repeatability), interday precision (within-laboratory reproducibility), linearity, detection limit, specificity and ruggedness The accuracy ranged from 83% to 84%, and the quantitation limit was 0.07 mg/kg for domoic acid The accuracy ranged from 93% to 103%, and the quantitation limit was 0.08 mg/kg for okadaic acid Conclusions: The LC-MS/MS method for the determination of Okadaic acid and Domoic acid has been successfully validated Results of the validation process confirmed its fitness for purpose as a quantitative method Based on these values for precision and recovery, it was concluded that the method is suitable for official control purposes to quantitatively determine Okadaic acid and Domoic acid Key words: domoic acid, okadaic acid, meretrix lyrata ĐẶT VẤN ĐỀ 242 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Trong hệ sinh thái biển, phần lớn lồi vi tảo đóng vai trị quan trọng chuỗi thức ăn, chúng nguồn dinh dưỡng chủ yếu nhiều loài động vật phù du, ấu trùng, tơm cua, số lồi thân mềm ăn lọc, cá Tuy nhiên, phần nhỏ chúng, có chứa độc tố gây hại cho sinh vật khác gọi độc tố sinh học biển (marine toxins) Các chất độc tích lũy thể loài nhuyễn thể ăn tảo, khuếch đại theo chuỗi thức ăn gây ảnh huởng lớn đến sức khỏe loài đứng đỉnh chuỗi thức ăn, có người Trên giới có nhóm độc tố nhuyễn thể bao gồm: nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt - Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy - Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây trí nhớ - Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), nhóm độc tố nhuyễn thể gây độc hệ thần kinh - Neurologic Shellfish Poisoning (NSP) nhóm độc tố nhuyễn thể Azaspriaxit (AZA) Trong PSP, DSP ASP nhóm độc tố đưa vào quy định kiểm soát giới hạn tồn dư cho phép có sản phẩm nhuyễn thể dùng cho người Độc tố DSP thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ dạng dẫn xuất axit okadaic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1) dinophysistoxin-2 (DTX-2) chứa nhóm chức cacboxyl, chuyển sang dạng hợp chất phát huỳnh quang phản ứng este hoá với 9-anthryl-diazometan (ADAM) định lượng hệ thống HPLC dùng detector huỳnh quang Phương pháp giới thiệu TCVN 8341:2010(6) Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8340:2010(5) ban hành phương pháp xác định độc tố nhóm ASP nhuyễn thể hai mảnh vỏ Trong tiêu chuẩn này, độc tố ASP (domoic axit) chiết từ thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ dung dịch axit clohydric 0,1 M Xác định hàm lượng domoic axit HPLC dùng detector UV bước sóng Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Với bối cảnh độc chất tồn dư có thực phẩm liên tục xuất với tần suất dày đặc tồn nhiều dạng phức tạp khác phương pháp xác định dư lượng chất cấm sử dụng đầu dò khối phổ giúp giảm thiểu tối đa khả xuất dương tính giả xét nghiệm Do đó, nghiên cứu thực xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Okadaic axit Domoic axit phần ăn M lyrata hệ thống LCMS/MS AB Sciex Triple Quad 5500 Mục tiêu nghiên cứu Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) độc tố biển nhuyễn thể EU ban hành vào năm 2004(3) áp dụng cho độc tố PSP, ASP (tính theo domoic axit) Okadaic 800 µg/kg, 20 mg/kg 160 µg/kg Bên cạnh đó, giới hạn hàm lượng độc tố PSP, ASP DSP nhuyễn thể Việt Nam quy định “TCVN 8681:2011 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ đông lạnh”(7) với mức cho phép (mg/kg) 0,8; 20 “không phát hiện” Trong giới hạn nghiên cứu này, quy trình 439 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 phân tích xác định hai hợp chất Okadaic axit Domoic axit (đại diện cho nhóm DSP ASP) phần ăn loài Nghêu trắng (Meretrix lyrata) tập trung nghiên cứu ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Kể từ lần phát Nhật vào năm 1978, độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy (DSP) nhận diện nguy nguy hiểm cho sức khỏe người toàn giới Tất độc tố DSP hợp chất khơng phân cực, có khối lượng phân tử cao 500 dễ dàng chiết dung môi hữu Hầu hết độc tố DSP hợp chất polyether với cấu trúc đặc biệt chứa nhiều loại nhóm chức chúng có độc tố tính chất hóa học khác Okadaic axit (OA) dinophysistoxins (DTXs) xem hai hợp chất đại diện cho nhóm DSP nguyên nhân gây triệu chứng tiêu chảy(1) (Hình 1, Bảng 1) Domoic axit (DA) đồng phân tích lũy nhuyễn thể nguyên nhân gây ngộ độc với triệu chứng trí nhớ (ASP) cho người DA hợp chất amino axit vòng, tan tốt nước sản sinh tảo đỏ biển thuộc hai giống Chondria Pseudonitzschia Trường hợp ngộ độc ASP ghi nhận đầu tiền vào năm 1987 Prince Edward Island (Canada) Ba người chết gần 100 người nhập viện sau ăn vẹm vỏ xanh (Mytilus edulis) có chứa hàm lượng DA cao(4) (Hình 2) Hình 1: Cơng thức cấu tạo nhóm độc tố DSP Bảng 1: Cơng thức cấu tạo nhóm độc tố DSP Tên độc tố OA DTX-1 DTX-2 DTX-3 (dạng acylate DTXs) 440 R1 CH3 CH3 H R2 H CH3 H CH3 H R3 H H CH3 R4 H H H Axit béo Hình 2: Cơng thức cấu tạo nhóm độc tố ASP Nghêu trắng hay gọi Nghêu Bến Tre (Sowerby, 1851), có tên khoa học Meretrix lyrata, cịn có tên gọi khác Lyrate Asiatic, phân bố phía Tây Thái Bình Dương, từ Đài Loan đến Việt Nam Ở Việt Nam, nghêu thường phân bố nhiều vùng ven biển phía Nam, bao gồm tỉnh: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau Nghêu loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ, sống lớp trầm tích đáy vùng cửa sơng, có nguồn thức ăn loài vi tảo hạt rắn chứa chất hữu lơ lửng nước tích lũy bề mặt lớp trầm tích Một số lồi vi tảo có khả sản sinh độc tố biển tiềm ẩn khả gây nhiễm chất độc vào nghêu Bên cạnh đó, nghêu loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ sử dụng nhiều ẩm thực người dân Việt Nam, tồn nguy gây ngộ độc ăn phải nghêu có chứa độc tố biển Phương pháp nghiên cứu Quy trình vận hành thiết bị xử lý mẫu tối ưu từ thông số ban đầu Luckas et al (2015)(1,5) Mcnabb et al (2005)(2) Các bước tiến hành cụ thể sau: (1) Mẫu nghêu tách bỏ vỏ, thu lấy phần thịt ăn sau xay nhuyễn máy đồng mẫu cân g mẫu vào ống ly tâm 50 mL; Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 (2) Thêm 10 mL MeOH:H2O (50:50), đồng máy phút, đánh siêu âm phút; (3) Để nguội nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút 15 phút, chuyển dịch ly tâm vào bình định mức 20 mL; (4) Thực tương tự bước (iii) với mL MeOH:H2O (50:50); (5) Gộp dịch chiết lần vào bình định mức 20 mL, định mức đến vạch nước cất; (6) Lọc dịch chiết qua phin lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm; (7) Một phần dịch lọc đem phân tích xác định Domoic axit, phần đem thủy phân xác định Okadaic; (8) Hút 500 µL dịch chiết sau lọc vào vial, thêm 62,5 µL NaOH 2,5 M, vortex phút, ủ 75oC 40 phút; (9) Để nguội nhiệt độ phịng, thêm 62,5 µL HCl 2,5 M, vortex phút; (10) Dung dịch vial đem phân tích thiết bị LC-MS/MS để xác định OA Trước áp dụng phương pháp phân tích vào thực tế, cần phải tiến hành xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (hay thẩm định) nhằm đảm bảo độ tin cậy kết thu Các bước tiến hành tiêu chí đánh giá kết trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp thực theo hướng dẫn tài liệu “Thẩm định phương pháp phân tích Hóa học Vi sinh vật”(8), bao gồm thông số như: xác định số điểm IP; xây dựng đường chuẩn; xác định giới hạn phát – giới hạn định lượng phương pháp (LOD - LOQ); độ lặp lại; độ tái lặp độ Các bước thực xác nhận giá trị sử dụng phương pháp cụ thể sau: Khoảng tuyến tính Tiến hành đo dung dịch chuẩn chất Domoic axit Okadaic axit Khoảng tuyến tính lựa chọn cho thiết lập phương trình đường thẳng biểu diễn phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ có hệ số R2 ≥0,99 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học Giới hạn phát (MLOD) giới hạn định luợng (MLOQ) phương pháp Ước lượng LOD lý thuyết cách: (1) Phân tích mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần, LOD lý thuyết giá trị nồng độ mà có Signal/Noise ≥3; (2) Phân tích mẫu thêm nồng độ 5-7 lần LOD lý thuyết (nồng độ LOQ lý thuyết); (3) Tính giá trị trung bình XTB, độ lệch chuẩn SD từ kết phân tích, (4) MLOD tính theo cơng thức: MLOD =3×SD; (5) Đánh giá MLOD tính theo tỉ số R, với: R = XTB/(3xSD); (6) Nếu 4< R 13,0 10 90 8,1->13,0 10 90 Thông số khối phổ CUR – Tốc độ dịng khí N2 làm 20 psi 20 psi IS – Thế ion hóa 5500 V -5500 V CAD – Khí va đập Medium Medium o o TEM – Nhiệt độ hóa dung mơi 500 C 500 C GS1 – Khí phun sương 40 psi 40 psi GS2 – Khí thổi khơ 40 psi 40 psi 442 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/266.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) Max 2.3e5 cps 6.52 2.3e5 2.0e5 1.78 Inten 1.5e5 1.0e5 5.0e4 0.0 0.0 12.14 1.64 0.5 131 1.0 262 1.5 392 2.0 523 2.5 653 3.0 784 3.5 914 4.0 1044 4.5 1175 5.0 1305 5.5 1436 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 1566 1697 1827 1957 2088 2218 Time, XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/266.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) 9.0 2349 9.5 2479 10.0 2609 10.5 2740 11.0 2870 11.5 3001 12.0 3131 12.32 12.5 3262 Max 2.3e5 cps 6.52 2.3e5 2.0e5 1.78 Inten 1.5e5 1.0e5 5.0e4 0.0 0.0 12.14 1.64 0.5 131 1.0 262 1.5 392 2.0 523 2.5 653 3.0 784 3.5 914 4.0 1044 4.5 1175 5.0 1305 5.5 1436 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 1566 1697 1827 1957 2088 2218 Time, XIC of +MRM (2 pairs): 312.000/161.000 Da ID: Domoic acid from Sample 35 (C3-06) of Data20181104-Domoic.wiff (Turbo Spray) 9.0 2349 9.5 2479 10.0 2609 10.5 2740 11.0 2870 11.5 3001 12.0 3131 12.32 12.5 3262 Max 6.3e4 cps 8.66 Inten 6.0e4 4.0e4 6.52 2.0e4 0.5 131 1.0 262 1.5 392 2.0 523 7.48 6.45 2.15 0.0 0.0 2.5 653 3.0 784 3.5 914 4.0 1044 4.5 1175 5.0 1305 5.5 1436 6.0 6.5 7.0 1566 1697 1827 Time, 7.5 1957 10.22 7.99 8.0 2088 8.5 2218 9.0 2349 9.5 2479 10.0 2609 10.5 2740 11.0 2870 11.5 3001 12.0 3131 12.5 3262 Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Domoic axit XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/255.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo Intensity, cps 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Time, XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/255.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Max 2.3e4 cps 6.59 2.3e4 2.0e4 Intensity, cps Max 2.3e4 cps 6.59 2.3e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Time, XIC of -MRM (2 pairs): 803.500/113.000 Da ID: Okadaic acid from Sample 24 (OA-MRL-06) of Data20190312-Validation OA.wiff (Turbo 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Max 1.7e4 cps 1.10 Intensity, cps 1.5e4 1.0e4 10.71 5000.0 1.15 3.64 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 3.88 4.09 4.0 4.96 4.5 5.10 5.0 5.26 5.62 5.98 6.59 6.69 5.5 6.0 6.5 7.0 Time, 11.00 9.49 7.48 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 9.80 9.99 10.0 10.5 11.51 11.0 11.5 12.0 12.5 Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Okadaic axit thêm chuẩn nồng độ gần LOQ kết Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp cho hiệu suất thu hồi tốt Như vậy, phương Độ đặc hiệu/chọn lọc phương pháp pháp có độ chọn lọc cao cho hợp chất Các hợp chất Domoic axit, Okadaic axit Domoic axit, Okadaic axit định lượng khối phổ MS/MS có số điểm Khoảng tuyến tính đường chuẩn IP 4, phù hợp với yêu cầu cho độ đặc hiệu Phương trình đường chuẩn (dạng đường phương pháp Trong trình thực xác tuyến tính bậc I) Domoic axit nồng độ từ 10 định giá trị sử dụng phương pháp mẫu 100 µg/kg Okadaic axit nồng độ từ – 32 blank cho kết không phát Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 443 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 µg/kg cho hệ số R2 tốt (R2 >0,99), khoảng nồng độ làm việc Bên cạnh đó, kết đánh giá hiệu ứng cho thấy ảnh hưởng lên thăng/gián tín hiệu đo nằm mức 20% tất nồng độ Domoic axit Đối với Okadaic axit, mẫu có ảnh hưởng lớn đến tín hiệu đo, đường chuẩn xây dựng theo phương pháp dựng chuẩn (Hình 5, Bảng 4) Hình 5: Phương trình đường chuẩn Domoic axit Okadaic axit 160, 320 µg/kg (Okadaic axit) cho thấy ba Bảng 4: Kết trình xác nhận giá trị sử nồng độ khảo sát có RSD% H% đáp ứng dụng phương pháp tiêu chí theo AOAC cho nồng độ Thông số Domoic axit Okadaic axit MLOQ (μg/kg) 70 80 Như vậy, phương pháp cho độ lặp lại hiệu MLOD (μg/kg) 23 26 suất thu hồi phù hợp với yêu cầu Độ không đảm bảo đo (%) 22,21 25,35 Độ tái lặp (%) 5,0 6,1 Nồng độ khảo sát (μg/kg) 70 140 500 80 160 320 Độ lặp lại (%) 3,7 3,1 3,4 4,6 4,8 2,3 Độ thu hồi (%) 84 83 83 93 103 98 Giới hạn phát phương pháp (MLOD) giới hạn định lượng (LOQ) Kết phân tích lặp lại 12 lần mẫu thêm chuẩn nồng độ 70, 80 µg/kg tương ứng với Domoic axit, Okadaic axit sử dụng cho việc xác định hệ số R Ở nồng độ thêm chuẩn cho giá trị 4< R