AN XOA - TÓM TẮT ĐỀ TÀI HOÀN CHỈNH

LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Một lần, chợ phiên vùng cao xã Phương Độ, thành phố Hà Giang, em thấy nhiều người dân địa phương bán thuốc nam chữa bệnh bệnh gút, bệnh tiểu đường, bệnh gan Em tị mị khơng biết thành phần thuốc gì, tác dụng thật sao, nhà khoa học kiểm chứng chưa? Qua học lớp qua tìm hiểu mạng, em biết có nhiều lồi thảo dược người dân sử dụng lâu đời chưa khoa học chứng minh làm rõ khả chữa bện thuốc, có An xoa Cây An xoa sử dụng dân gian làm thuốc chữa bệnh cảm cúm, sởi, viêm gan, ung thư gan quảng cáo thị trường “khắc tinh bệnh gan” Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đầy đủ hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Với mong muốn tìm hiểu tác dụng chữa bệnh gan An xoa góp phần làm rõ sở khoa học thành phần hóa học hoạt tính chữa bệnh gan chúng em lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa, chống tế bào ung thư, bảo vệ gan chất An xoa, (Helicteres hirsuta L.)’’ Đây đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao, góp phần làm sáng tỏ sở khoa học khả ứng dụng An xoa Mục tiêu đề tài xác định thành phần hóa học An xoa đánh giá hoạt tính chữa bệnh gan Để thực mục tiêu đó, đề tài tiến hành nội dung nghiên cứu sau: - Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan cao tổng etanol chuột bị gây độc gan paracetamol - Nghiên cứu tách chiết xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ An xoa - Đánh giá hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, nhằm đánh giá khả bảo vệ gan khỏi tác nhân gây bệnh gốc tự Đánh giá khả diệt tế bào ung thư gan Hep-G2 nhằm tìm kiếm chất tiêu diệt tế bào ung thư gan) chất phân lập - Đánh giá khả bảo vệ tế bào gan chuột thử nghiệm bị gây độc gan paracetamol phân đoạn tách chiết từ An xoa để định hướng tạo chế phẩm bảo vệ gan CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan An xoa Helicteres hirsuta Loureiro (Sterculiaceae) 1.1 Đặc điểm hình thái An xoa Cây An xoa (hay gọi Dó lơng, Tổ kén cái) có tên khoa học Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae An xoa bụi, cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lơng Lá hình trái xoan, dài 5-17cm, rộng 2,57,5cm Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn Mép có không Mặt màu trắng, hai mặt phủ đầy lơng hình sao; gân gốc 5, cuống dài 0,8- 4cm, kèm hình dải, có lơng, dễ rụng Cụm hoa ngắn, đơn hay xếp đôi nách Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp có bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lơng hình sao, màu đo đỏ, chia Cánh hoa 5, cuống nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép nhị, bầu có nhiều gợn, chứa 25-30 noãn noãn Quả nang hình trụ nhọn, hạt nhiều, hình lăng trụ Ra hoa kết từ tháng đến tháng 11 Hình 1: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.) Cây An xoa phân bố Nam Trung Quốc nhiều nước Nam Á Ấn Độ, Camphuchia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippin Ở Việt Nam, mọc phổ biến từ Bắc tới Nam, thường gặp đồi bụi, rừng thưa, ven rừng 1.2 Tình hình nghiên cứu AN xoa giới Khi nghiên cứu loài An xoa Helicteres hirsuta có nguồn gốc từ Indonesia, nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) phân lập lignan có tên (±)pinoresinol (1); (±)-medioresinol (2); (±)- syringaresinol (3); (–)-boehmenan (4); (-)-boehmenan H (5) (±)-trans-dihydro diconiferyl alcohol (6) Hình 2: Các lignan phân lập từ An xoa (theo Chin, 2006) Trong số lignan tách từ lồi có chất 1, có hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư là: ung thư phổi (Lu1), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP) ung thư vú (MCF-7), đó, (±)-pinoresinol (1) thể khả gây độc tế bào mạnh dòng ung thư phổi Lu1, ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP), ung thư vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml Đây lớp chất nhiều cơng trình cơng bố có nhiều hoạt tính sinh học thú vị kháng viêm, chống ung thư, đặc biệt hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan Ví dụ như: pinoresinol syringaresinol có hoạt tính bảo vệ gan thử nghiệm chuột Pinoresinol có tác dụng chống oxy hóa, giảm hình thành chất trung gian gây viêm thông qua ức chế trung tâm hoạt động kB (NF-kB) Đồng thời pinoresinol liều 200mg/kg/ngày làm giảm nồng độ enzyme ALT, AST xuống rõ rệt, gần tương đương với silymarin liều 800mg/kg thử nghiệm chuột gây tổn thương gan CCl4 sau 24h 1.3 Tình hình nghiên cứu An xoa Việt Nam Cho tới nay, nghiên cứu khoa học nước An xoa có số lượng hạn chế Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015) công bố cặn chiết nước cặn chiết methanol từ thân An xoa thu hái Khánh Hòa, Việt Nam giàu nhóm chất phenol flavonoid có tác dụng chống oxy hóa invitro hệ DPPH, ABTS, FRAP Nhóm tác giả Hữu Duyên (2016) phân lập hợp chất từ cặn petroleum ether (PE) An xoa thu hái Kiên Giang: stigmasterol (7), lupeol (8), tiliroside (9) apigenin (10), kết thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE cao chiết dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan HepG2 với IC50 28,29 30,30 µg/ml Hình 3: Một số hợp chất phân lập từ cặn PE An xoa Từ tổng quan tài liệu đây, thấy An xoa chưa có cơng trình nghiên cứu hệ thồng thành phân hóa học hoạt tính sinh học Vì vậy, nghiên cứu sâu rộng việc làm cần thiết để chứng minh tác dụng chữa bệnh loài thực vật Tổng quan tình hình bệnh gan 2.1 Vai trò gan Gan quan quan trọng thể, tham gia vào trình trao đổi chất, tiết dự trữ Gan xem “nhà máy hóa chất” thể nơi sản xuất mật, tái tạo lượng, dự trữ glycogen, vitamin, chuyển hóa hydratcacbon, protein lipid Gan cịn chịu trách nhiệm việc thải độc thể tiếp xúc với tác nhân gây độc thuốc, virut, vi khuẩn hay rượu Do mà gan dễ bị tổn thương thiệt hại Một bệnh gan phổ biến viêm gan, kết tình trạng lạm dụng thuốc, uống nhiều rượu, béo phì lối sống khơng lành mạnh 2.2 Gốc tự nguyên nhân gây nhiều bệnh, có bệnh gan Gốc tự nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp điện tử ngồi chúng có chứa điện tử khơng cặp đơi Chúng mang điện tích dương, điện tích âm khơng mang điện Các điện tử khơng cặp đơi thường tìm kiếm điện tử khác để trở thành cặp đơi, phần lớn gốc tự thường hoạt động công phân tử khác Sự dư thừa gốc tự tổn thương hệ thống chống gốc tự nguồn gốc nhiều bệnh lý ung thư, lão hoá, rối loạn chuyển hoá, tim mạch… Các gốc tự tồn 10 -6 giây gốc tự khơng bền có độc tính lớn Cịn gốc tự tồn 10 -6 giây gốc tự bền có độc tính Chất chống oxy hóa loại hóa chất giúp ngăn chặn làm chậm q trình oxy hóa chất khác Sự oxy hóa loại phản ứng hóa học electron chuyển sang chất oxy hóa, có khả tạo gốc tự sinh phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn q trình phá hủy cách khử gốc tự do, kìm hãm oxy hóa cách oxy hóa chúng 2.3 Các bệnh gan Theo ước tính Tổ chức y tế giới (WHO) có khoảng 600.000 người chết năm hậu viêm gan B cấp mãn tính Ung thư gan loại ung thư hay gặp đứng hàng thứ giới Ở Việt Nam có khoảng 20.000 ca mắc viêm gan năm Các bệnh lý gan ngày trở nên trầm trọng có xu hướng gia tăng năm gần mối đe dọa sức khỏe cộng đồng toàn giới Bệnh gan thuật ngữ thiệt hại cấu trúc, chức tế bào, mô gan Các tổn thương bị gây nên tác nhân sinh học (vi khuẩn, virus, ký sinh trùng ), ảnh hưởng thuốc (paracetamol liều cao thuốc chống nghiện), chất độc hại [cacbon tetrachlorua (CCl4), thioacetamid, dimethylnitrosamine (DMN), D-galactosamine/ lipopolysaccharide (GalN/LPS)] hay ngộ độc gan uống nhiều rượu Phần lớn chất gây độc cho gan làm thiệt hại tế bào gan thông qua đường oxy hóa lipid gan, tạo nên sản phẩm độc hại với gan thể, aldehyde như: malondialdehyde (MDA) 4-hydroxynonenal (HNE) Ngồi ra, cịn gây độc gan cách tạo gốc tự gây tổn thương trực tiếp vào tế bào gan Các chất gây độc gan tác động vào ty thể làm rối loạn trình chết tế bào theo chương trình apoptosis làm giảm Glutathione dự trữ (một chất chống oxy hóa tự nhiên thể) Khi tế bào gan bị tổn thương, số enzym có nhiều gan giải phóng vào máu làm hoạt độ enzym tăng cao Đặc trưng enzym Aspartat aminotransferase (AST): enzym vận chuyển nhóm amin, nồng độ enzym có nhiều tim, gan, cơ, xương; enzyme Alanin aminotransferase (ALT): enzym vận chuyển nhóm amin, có chủ yếu gan Ngồi ra, cịn có enzyme khác Phosphatase kiềm (AP ), Gamma glutamyl transpeptidase (GGT)…Do vậy, để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan người ta thường xác định hoạt độ enzym máu 2.4 Xu hướng sử dụng dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên chữa bệnh gan Cho tới nay, dược liệu đóng vai trị quan trọng chăm sóc sức khoẻ người Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO) có khoảng 80% dân số giới tin dùng Y học cổ truyền, chủ yếu từ thực vật Đối với điều trị bệnh gan, việc sử dụng loại thảo dược làm thuốc chữa bệnh có lịch sử lâu đời sử dụng hầu khắp nước giới Một số loại thảo dược theo y học cổ truyền điều trị bệnh gan mật như: nhân trần, astiso, nghệ, diệp hạ châu, ké sữa GIẢ THUYẾT KHOA HỌC Từ tổng quan tài liệu An xoa bệnh gan nhận thấy rằng, nước ta nhiều vị thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng bảo vệ gan sử dụng nhiều theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có nhiều nghiên cứu cách hệ thống để chứng minh tác dụng Vì vậy, việc tìm kiếm nghiên cứu loại thảo dược từ thiên nhiên có tác dụng giải độc, bảo vệ gan vấn đề cấp thiết có giá trị khoa học thực tiễn Góp phần khai thác, sử dụng hiệu nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam, tạo thuốc chữa bệnh hiệu quả, giá thành hạ phục vụ đại phận bệnh nhân nghèo Việt Nam Sự lựa chọn An xoa làm đối tượng nghiên cứu đề tài dựa vào kinh nghiệm sử dụng Y học cổ truyền dân tộc nghiên cứu nhà khoa học nước Tuy nhiên nghiên cứu An Xoa hạn chế Do đó, chưa thể kết luận xác liệu An xoa có phải “khắc tinh bệnh gan” hay không? Để trả lời câu hỏi này, chúng em nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa, chống tế bào ung thư, bảo vệ gan chất An xoa” để làm rõ sở khoa học chữa bệnh Nếu An xoa có tác dụng chữa bệnh gan An xoa có chứa chất có hoạt tính sinh học như: bẫy gốc tự chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư gan Hep G2 , bảo vệ tế bào gan Do vậy, đề tài tiến hành tách chiết ,xác định cấu trúc chất hố học từ An xoa, sau thử hoạt tính bẫy gốc tự do, hoạt tính gây độc tế bào invitro hoạt tính bảo vệ tế bào mơ hình gan chuột bị gây độc paracetamol invivo Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Thu hái phận mặt đất An Xoa, phân loại riêng thân cành lá; phơi sấy khô, xay n hỏ Dược liệu giám định tên khoa học phương pháp Hình thái so sánh dựa mơ tả Võ Văn Chi - Từ điển Cây thuốc Việt Nam Tên khoa học loài thực vật PGS.TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam xác định 2.1.2 Các dịng tế bào ung thư thực nghiệm Các dòng tế bào ung thư người cung cấp ngân hàng tế bào American Type Culture Collection (ATCC) bao gồm: ung thư biểu mơ biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065 TM) chuẩn hóa ni cấy thường quy phịng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam 2.1.3 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss khỏe mạnh, cân nặng 20 - 25g Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật nuôi điều kiện tiêu chuẩn, đầy đủ thức ăn nước uống ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất Các loại dung mơi hữu cơ: n-hexan, điclometan, etylaxetat, etanol, nbutanol, metanol Chất đối chứng: quercetine, ellipticine, silymarin (Legalon 70 mg) Madaus GmbH (Đức) sản xuất, Paracetamol 500 mg (biệt dược Efferalgan BristolMyers Squibb sản xuất) Kít định lượng: AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin aminotransferase) hãng BIOSYSTEM 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị nghiên cứu Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Gồm: - Máy cô quay chân không Buchi - Máy quang phổ UV-VIS - Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động TC-3300 Plus (Teco diagnostics, USA) - Máy nghiền dịch đồng thể Wisestir HS-30E - Máy ly tâm Gilson GmClab - Cân phân tích Shimadzu AY 220 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xử lý chiết mẫu thực vật Các mẫu thực vật sau thu hái thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khơ nhiệt độ 40-45o C, sau đem nghiền nhỏ Tiếp theo, mẫu ngâm chiết với Etanol 700, 800 90o siêu âm 30-350C Quá trình chiết lặp lại 3-4 lần Gộp dịch chiết cất loại dung môi áp suất giảm thu cao chiết Etanol tổng tương ứng Tiếp đó, hịa cao chiết tổng dung dịch Etanol: H2O (1:1) chiết với dung môi n- hexan diclometal thu cặn chiết tương ứng Dung dịch nước lại chiết tiếp EtOAc Dịch chiết EtOAc cô cất chân không 40oC, thu cặn chiết EtOAc Phần nước cịn lại cất chân khơng thu cặn chiết nước Cặn chiết EtOAc sử dụng để tách chiết chất sạch, sau tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học chống oxy, chống tế bào ưng thư, bảo vệ gan chất 2.3.2 Phương pháp phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất tự nhiên Việc phân lập, tinh chế hợp chất từ cặn chiết thực phương pháp kết tinh sắc ký khác như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát, điều chế lượng nhỏ), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh silica gel (Merck) sephadex LH-20 Dung môi rửa giải chủ yếu dùng hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2, n-hexan/EtOAc, n-hexan/axetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất kết hợp xác định thông số vật lý điểm nóng cháy, độ quay cực []D… với phương pháp phổ đại bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều chiều 2.3.3 Phương pháp gây độc tế bào MTT * Nguyên lí: Hoạt tính gây độc tế bào thực dựa phương pháp MTT (3(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, - diphenyltetrazolium) mô tả lần tác giả Tim Mosman, 1983 Đây phương pháp đánh giá khả sống sót tế bào qua khả khử MTT (màu vàng) thành phức hợp formazan (màu tím) hoạt động enzym dehydrogenase ty thể Sản phẩm formazan hòa tan DMSO đo mật độ quang (OD) bước sóng 540 nm Giá trị thể hoạt tính IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% phát triển tế bào) * Chuẩn bị thí nghiệm: Các dịng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: ung thư biểu mơ biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065TM) Dòng tế bào lưu giữ nitơ lỏng, hoạt hóa trì mơi trường dinh dưỡng DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) số thành phần thiết yếu khác Tế bào nuôi điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 370C, vô trùng tuyệt đối) cấy chuyển 1-2 lần trước thí nghiệm Tế bào phát triển pha log sử dụng để thử độc tính Mẫu thử hịa tan dung môi DMSO với nồng độ ban đầu 20 mg/ml Tiến hành pha loãng bước đĩa 96 giếng thành dãy nồng độ từ cao xuống thấp 2564, 640, 160, 40 10 µg/ml Nồng độ chất thử đĩa thử nghiệm tương ứng 128, 32, 8, 0.5 µg/ml Chất tham chiếu Ellipticine (Sigma) pha DMSO với nồng độ mg/ml * Tiến hành thí nghiệm: - Bước 1: Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào đếm buồng đếm tế bào Tiếp đó, pha tế bào môi trường điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3x104 tế bào/ml tùy theo dòng tế bào) - Bước 2: Lấy vào giếng 10 µl chất thử chuẩn bị 190 µl dung dịch tế bào Đối chứng dương thí nghiệm mơi trường có chứa tế bào, đối chứng âm có mơi trường ni cấy - Bước3: Đĩa thí nghiệm ủ điều kiện tiêu chuẩn - Bước 4: Sau 72 giếng thí nghiệm tiếp tục ủ với 10 µl MTT (5 mg/ml) 4h Sau loại bỏ mơi trường, tinh thể formaran hịa tan 100 µl DMSO 100% - Bước 4: Kết thí nghiệm xác định giá trị OD đo bước sóng 540 nm máy quang phổ Genios Tecan Thí nghiệm lặp lại lần *Xử lý kết thực nghiệm: Giá trị IC50 xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển phần mềm máy tính Rawdata % ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100% (Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử nồng độ cao/chất thử thấp nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%: % ức chế nồng độ cao/% ức chế nồng độ thấp) * Đánh giá hoạt tính: Giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml (với dịch chiết thơ) IC50 ≤ µg/ml (với chất sạch) đánh giá có hoạt tính gây độc tế bào 2.3.4 Phương pháp bẫy gốc tự DPPH * Nguyên lý: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) chất tạo gốc tự dùng để thực mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu DPPH, xác định cách đo quang bước sóng  = 517 nm * Cách tiến hành: - Bước 1: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 300 M Methanol Chất thử pha DMSO 100% cho nồng độ cuối đạt dãy nồng độ 256; 64; 16; 4; g/ml - Bước 2: Đĩa thí nghiệm 96 giếng gồm: Giếng phản ứng: Trộn mẫu 10 l 190 DPPH l Giếng chứng: 10 l DMSO 0.5 % 190 DPPH l Chất tham chiếu: resveratrol, quercetin - Bước 3: Thời gian phản ứng 30 phút 37 0C, đọc mật độ hấp phụ DPPH máy quang phổ bước sóng 517 nm * Xử lý số liệu: % bẫy gốc tự DPPH mẫu thử tính theo cơng thức sau: SC% = (OD chứng – OD mẫu thử)/ ODchứng (%) EC50 (nồng độ chất thử bắt giữ hiệu gốc tự do) tính theo giá trị SC tương quan với nồng độ khác chất thử 2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình chuột thử nghiệm invivo * Ngun lý phương pháp: Xác định hoạt độ enzyme aspartat aminotransferase alanin aminotransferase (AST, ALT) huyết chuột, với quan sát mô bệnh học gan chuột thực nghiệm để đánh giá tác dụng bảo vệ gan mẫu thử nghiệm * Cách thức tiến hành: Gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Mẫu thử nghiệm cao tổng etanol An xoa Giai đoạn 2: Mẫu thử nghiệm phân đoạn cao chiết An xoa Cả giai đoạn tiến hành chuột theo qui trình sau: - Bước 1: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô gồm con: + Lô (Lô chứng trắng): Uống nước cất 0,1 ml/10g /lần/ngày + Lô (Lô mơ hình): Uống nước cất 0,1 ml/10g/lần/ngày + uống paracetamol 300 mg/kg + Lô (Lô chứng dương): Uống silymarin 100 mg/kg/lần/ngày + uống paracetamol 300 mg/kg + Lô (Lô dùng thuốc nghiên cứu): Uống mẫu thử liều 12g/kg (Liều tương đương dự kiến lâm sàng) + Uống paracetamol 300 mg/kg + Lô (Lô dùng thuốc nghiên cứu): Uống mẫu thử liều 24g/kg (Liều gấp lần dự kiến lâm sàng) + uống paracetamol 300 mg/kg - Bước 2: Chuột uống nước mẫu nghiên cứu liên tục ngày Ngày thứ 8, sau uống mẫu nghiên cứu giờ, gây tổn thương gan chuột lô từ lô đến lô uống paracetamol liều 300mg/kg Sau 48 uống paracetamol, chuột lấy máu, sau giết chuột, tách lấy gan - Bước 3: Lấy máu, ly tâm với 5000 vòng/phút 15 phút để thu huyết để định lượng AST, ALT - Bước4: Lấy xử lý gan: giết chuột, tách lấy gan Rửa gan nước muối sinh lý dùng gạc thấm khô Cân khối lượng gan quan sát đại thể gan Cắt phần gan để làm tiêu mô bệnh học cấu trúc vi thể gan * Các tiêu theo dõi: - Quan sát đại thể gan - Hoạt độ transaminase huyết thanh: xác định hoạt độ transaminase huyết (AST, ALT) theo phương pháp động học IFCC (international federation of clinical chemistry) (1977-1980) - Mô bệnh học: sau giết động vật, mẫu gan cố định dung dịch Carnoy, vùi parafin, cắt lát mỏng 5-7 µm, nhuộm hematoxylin-eosin quan sát kính hiển vi quang học để đánh giá vi thể gan Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thử hoạt tính bảo vệ gan chuột thử nghiệm cao tổng etanol An xoa Enzym aspartat aminotransferase (AST) enzym alanin aminotransferase (ALT) enzym vận chuyển nhóm amin, nồng độ enzym có nhiều gan Do vậy, gan bị tổn thương AST, ALT phóng thích vào máu Điều làm cho AST, ALT số quan trọng để đánh giá chức gan Kết nghiên cứu ảnh hưởng cao chiết An Xoa lên hoạt hoạt độ AST, ALT huyết chuột trình bày bảng 3.1 3.2 Từ kết bảng 3.2 3.2 cho thấy, gây độc gan paracetamol, hoạt độ AST ALT huyết chuột tăng lên so với chuột không bị gây độc gan Sau chuột bị gây độc gan paracetamol, cho uống cao chiết An xoa hoạt độ enzim AST ALT giảm đáng kể Đặc biệt, tác dụng An Xoa liều 24g/kg cho thấy tác dụng tương đương, chí tốt Silymarin liều 100g/kg Điều chứng tỏ, cao chiết An xoa liều 12g/kg 24g/kg có khả bảo vệ tế bào gan chuột thông qua làm giảm hoạt độ enzim AST ALT huyết chuột Kết sở để tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học bảo vệ gan từ An xoa Bảng 3.1 Ảnh hưởng cao lỏng An xoa lên hoạt độ AST huyết chuột Hoạt độ AST(UI/l) Lơ thí nghiệm p so với p so với X ± SE Lô 1: Chứng trắng 54,84 ± 6,43 Lơ 2: Mơ hình 806,54 ±213,84 < 0,05 Lô 3: Silymarin 100 mg/kg 348,88 ±121,68 < 0,05 Lô 4: An Xoa 12 g/kg 399,81±115,52 >0,05 Lô 5: An Xoa 24 g/kg 172,76 ± 21,10 < 0,05 Bảng 1.2 Ảnh hưởng cao lỏng An xoa lên hoạt độ ALT huyết chuột Hoạt độ ALT (UI/l) p so với p so với Lơ thí nghiệm X ± SE Lô 1: Chứng trắng 50,02 ± 3,82 Lơ 2: Mơ hình 351,32 ± 54,21 < 0,05 Lô 3: Silymarin 100 mg/kg 209,68 ± 28,89 < 0,05 Lô 4: An Xoa 12 g/kg 268,81 ± 67,92 >0,05 Lô 5: An Xoa 24 g/kg 249,76 ± 48,57 > 0,05 3.2 Kết phân lập hợp chất từ An xoa Từ cặn chiết EtOAc (65g) cao chiết An Xoa, phương pháp sắc ký kết tinh phân đoạn phân lập 11 chất ký hiệu: HH1 (30mg), HH2 (11mg), HH3 (20mg), HH5 (9mg), HH6 (15mg), HH8 (12mg), HH11 (5mg), HH12 (7mg), HH16 (7mg), HH28 (8mg), HH30 (30mg) Cấu trúc hóa học chất xác định nhờ phân tích liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D 2D NMR, đồng thời so sánh với tài liệu công bố trước Cấu trúc 11 chất xác định là: β-sitosterol (HH1), 6β-hydroxyenone hay stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH2), β-sitosterol glucoside (HH3), heliclactone (HH05), cucurbitacin D (HH6), axit bentulinic (HH8), isokaemferide (kaemferol3-O-methyl ether) (HH11), axit alphitolic (HH12), hibiscolactone A hay 3, – dihydroxy-1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide (HH16), betulin (HH28), propacin (HH30) Hình 4: Cấu trúc hợp chất phân lập từ thân An xoa 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học 3.3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất xác định cấu trúc tiến hành thử nghiệm khả gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) ung thư biểu mô (KB) theo phương pháp MTT mô tả phần Phương pháp (Mục 2.3) Kết thử nghiệm khả gây độc tế bào ung thư thể Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết gây độc tế bào ung thư hợp chất nồng độ thử 100 µg/ml TT Hợp chất % ức chế tế bào ung thư HepG2 KB HH1 12 13 HH2 HH3 4 HH5 40 35 HH6 99 97 HH8 98 98 HH11 20 17 HH12 98 98 HH16 70 68 10 HH28 55 52 11 HH30 98 97 Kết sàng lọc sơ cho thấy hợp chất HH6, HH8, HH12, HH16, HH28 HH30 có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư người HepG2 KB >50% liều 100 µg/ml Các hợp chất cịn có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan HepG2 KB thấp, hợp chất HH6, HH8, HH12, HH16, HH28 HH30 thí nghiệm nồng độ khác để xác định giá trị IC 50 (Nồng độ chất ức chế 50% tế bào ung thư) Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất theo nồng độ thể Bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất TT Hợp chất Giá trị IC50 (µg/ml) HepG2 KB HH6 2,85 ±0,10 2,84 ±0,10 HH8 27,87 ±0,34 29,18 ±2,19 HH12 26,05 ±0,07 24,15 ±0,44 HH16 90,99 ±1,19 97,89 ±0,29 HH28 106,40 ±3,39 109,89 ±2,97 HH30 52,63 ±0,24 56,37 ± 1,04 Ellipticine 0,34 ±0,1 0,41 ±0,1 Kết Bảng 3.4 cho thấy, hợp chất HH6 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 tương ứng 2,85 ±0,10 2,84 ±0,10 µg/ml dịng tế bào HepG2 KB, chất đối chứng Ellipticine (là thuốc tiêu diệt hiệu tế bào ung thư thông qua việc phá hủy deoxyribonucleic acid) 0,34 ±0,1 0,41 ±0,1 µg/ml Tiếp theo hợp chất HH8 HH12 có hoạt tính cao với giá trị IC 50 tương ứng 27,87 ±0,34 26,05 ±0,07 µg/ml dịng tế bào HepG2; 29,18 ±2,19 24,15 ±0,44 µg/ml dịng tế bào KB Hợp chất HH30 có hoạt tính trung bình với giá trị IC 50 tương ứng 52,63 ±0,24 56,37 ±1,04µg/ml dịng tế bào HepG2 KB Cịn lại, hợp chất HH16 HH28 có hoạt tính yếu HepG2 KB với IC50 tương ứng 90,99 ±1,19 đến 109,89 ±2,97 µg/ml Như vậy, thấy hợp chất có hoạt tính ức chế mạnh tế bào ung thư An xoa hợp chất có cấu trúc triterpenoid: HH6 (cucurbitacine D), HH8 (axit bentulinic), HH12 (axit alphitolic), hay HH30 (propacin) có cấu trúc courmarinolignan Đây lớp chất phổ biến, phân bố rộng rãi giới thực vật có hoạt tính sinh học đa dạng 3.3.2 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH Các gốc tự hình thành cách tự nhiên thể đóng vai trị quan trọng nhiều trình tế bào bình thường Tuy nhiên, gốc tự nhiều, dư thừa gây nên số bệnh lý như: xơ vữa động mạch, tiểu đường, Alzheimer, Parkinson bệnh thối hóa thần kinh khác Một số cơng trình gần cịn gốc tự nguyên nhân quan trọng phát triển bệnh ung thư (James et al., 2010; Valko et al., 2007) Vì vậy, nghiên cứu này, hợp chất phân lập từ thân An xoa đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả trung hịa gốc tự DPPH theo phương pháp mô tả mục 2.3 Đây phương pháp sử dụng phổ biến nhiều phịng thí nghiệm giới để sàng lọc xác định tác nhân có hoạt tính chống oxy hóa Kết xác định khả bẫy gốc tự DPPH chất tách chiết từ An xoa trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH hợp chất TT Tên chất % bẫy gốc tự Giá trị DPPH nồng độ (µg/ml) 100 µg/ml HH1 2,0 >100 HH2 3,5 >100 HH3 2,5 >100 HH5 91,5 28,82 ±0,49 HH6 15,0 >100 HH8 13,0 >100 HH11 51,5 125,04 ± 1,35 HH12 14,0 >100 HH16 35,0 >100 10 HH28 14,5 >100 11 HH30 15,0 >100 Quercetine 100 8,5 ± 0,1 EC50 Kết thử quét gốc tự chất sử dụng chất đối chứng quercetin Bảng 3.5 cho thấy, số chất thử nghiệm có hợp chất HH5 (Helilacton) có hoạt tính bẫy gốc tự DPPH mạnh với giá trị EC 50 28,82 ±0,49 µg/ml HH11 có khả trung hòa 50% gốc DPPH với EC50 125,04 ± 1,35 µg/ml Hợp chất HH16 có hoạt tính yếu trung hòa 35% DPPH Các hợp chất cịn lại khơng thể hoạt tính bẫy gốc tự DPPH thử nồng độ 100 µg/ml Tính đề tài: Về thành phần hóa học: - Kết nghiên cứu không phát thấy lignan: (±)-pinoresinol (1); (±)medioresinol (2); (±)- syringaresinol (3); (-)-boehmenan (4); (-)-boehmenan H (5) (±)-trans-dihydro diconiferyl alcohol (6) công bố tác giả Chin cộng (2006) nghiên cứu thành phần hóa học An xoa từ Indonesia Đây điều đáng ý chất lignan chứng minh có hoạt tính gây độc số dòng tế bào ung thư khả bảo vệ gan tốt, đặc biệt hợp chất pinoresinol (1) - Đề tài tách chiết xác định cấu trúc hóa học 11 chất khác từ cặn EtOAc Đó là: β-sitosterol (HH1), 6β-hydroxyenone hay stigmast-4-ene-6βol-3-one (HH2), β-sitosterol glucoside (HH3), heliclactone (HH05), Cucurbitacin D (HH6), axit bentulinic (HH8), isokaemferide (kaemferol-3-O-methyl ether) (HH11), axit alphitolic (HH12), hibiscolactone A hay 3,9-dihydroxy-1,3,5,7,9cadinapentaene-14,2-olide (HH16), betulin (HH28), propacin (HH30) Trong từ An xoa thu hái Kiên Giang, Hữu Duyên phân lập chất từ cặn petroleum ether stigmasterol (7), lupeol (8), tiliroside (9) apigenin (10) Điều cho thấy điều kiện sinh thái, khí hậu thổ nhưỡng vùng định đến thành phần hóa học An Xoa Các chất có hoạt tính sinh học lý thú chống ung thư khả kháng viêm, bảo vệ gan trình bày phần tổng quan Về hoạt tính sinh học: - Đề tài đánh giá hoạt tính gây độc hai dịng tế bào ung thư người 11 chất xác định hợp chất HH6 (cucurbitacine D) có khả diệt 50% tế bào ung thư HepG2 KB nồng độ 2,85±0,10 µg/ml 2,84 ±0,10 µg/ml Kết chứng minh sử dụng phân đoạn giàu cucurbitacine D từ An xoa để nghiên cứu sâu để tạo chế phẩm chữa bệnh gan An xoa - Đề tài đánh giá hoạt tính chống oxy hóa qua việc bẫy gốc tự bền sinh DPPH 11 chất tách chiết từ An xoa phát hợp chất HH5 (helilacton) có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất, khả bắt giữ 50% gốc tự nồng độ 28,82 ±0,49 µg/ml - Ngồi ra, bước đầu đề tài đánh giá khả bảo vệ gan chuột khi gây viêm gan paracetamol cao chiết etanol An xoa với liều 24g/kg/ngày có khả làm giảm hoạt độ enzym AST, ALT gấp 1,5-2 lần so với lô đối chứng tương đương với Silymarin liều 100mg/kg/ngày sau ngày thử nghiệm PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Kết cho thấy cao chiết ethanol từ An xoa liều 24g/kg/ngày có khả làm giảm hoạt độ enzym AST, ALT gấp 1,5-2 lần so với lô đối chứng tương đương với Silymarin liều 100mg/kg/ngày sau ngày thử nghiệm Đã nghiên cứu thành phần hóa học thân An xoa Kết phân lập xác định cấu trúc 11 hợp chất chủ yếu hợp chất triterpenoid, steroid, flavonoid, lacton Không phát thấy hợp chất lignin (±)pinoresinol (1), (±)-medioresinol (2), (±)- syringaresinol (3), (–)-boehmenan (4), (-)-boehmenan H (5) (±)-trans-dihydro diconiferyl alcohol (6) công bố tác giả Young-Won Chin nghiên cứu An xoa từ Indonesia Các ligna có hoạt tính gây độc tế bào ung thư bảo vệ gan tốt, đặc biệt pinoresinol (1) Đã thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư người HepG2 KB hợp chất Kết cho thấy hợp chất HH6 (cucurbitacine D) có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh với IC 50 2,8±0,1µg/ml, chất tiềm để chữa bệnh ung thư gan từ Đã thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH hợp chất Kết cho thấy hợp chất HH5 (helilacton) có hoạt tính trung hịa gốc tự DPPH mạnh với IC 50 28,8±0,4 µg/ml Chất helilacton chất tiềm để bảo vệ gan khỏi tác nhân gốc tự làm tổn thương tế bào gan Hướng nghiên cứu Hiện nay, đề tài tiếp tục nghiên cứu tách phân đoạn giàu hợp chất pinoresinol (1) phân đoạn giàu hợp chất HH5 (helilacton) để nghiên tạo chế phẩm chống ung thư gan chế phẩm bảo vệ gan  ... Tính đề tài: Về thành phần hóa học: - Kết nghiên cứu không phát thấy lignan: (±)-pinoresinol (1); (±)medioresinol (2); (± )- syringaresinol (3); (-) -boehmenan (4); (-) -boehmenan H (5) (±)-trans-dihydro... lượng gan quan sát đại thể gan Cắt phần gan để làm tiêu mô bệnh học cấu trúc vi thể gan * Các tiêu theo dõi: - Quan sát đại thể gan - Hoạt độ transaminase huyết thanh: xác định hoạt độ transaminase... nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) phân lập lignan có tên (±)pinoresinol (1); (±)-medioresinol (2); (± )- syringaresinol (3); (–)-boehmenan (4); (-) -boehmenan H (5) (±)-trans-dihydro diconiferyl