Nâng cao độ phân giải cho kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu bằng sử dụng hai dạng hàm nhòe điểm khác nhau với mối liên hệ nhân kiểu logarit

Trong bài viết này, để nâng cao độ phân giải cho kính hiển vi quét đồng tiêu tác giả đề xuất hai chùm tia kích hoạt mẫu. Ảnh thứ nhất nhận được bằng sử dụng một chùm kích hoạt Gausian, trong khi ảnh thứ hai nhận được bằng một chùm kích hoạt vành.

Kỹ thuật điều khiển & Điện tử NÂNG CAO ĐỘ PHÂN GIẢI CHO KÍNH HIỂN VI PHÁT XẠ HUỲNH QUANG QUÉT ĐỒNG TIÊU BẰNG SỬ DỤNG HAI DẠNG HÀM NHÒE ĐIỂM KHÁC NHAU VỚI MỐI LIÊN HỆ NHÂN KIỂU LOGARIT Hoàng Xuân Hội, Lê Văn Nhu*, Phạm Minh Nghĩa*, Trần Linh Khương Tóm tắt: Trong báo này, để nâng cao độ phân giải cho kính hiển vi quét đồng tiêu tác giả đề xuất hai chùm tia kích hoạt mẫu Ảnh thứ nhận sử dụng chùm kích hoạt Gausian, ảnh thứ hai nhận chùm kích hoạt vành Ảnh độ phân giải cao nhận mối liên hệ nhân-logarit hai ảnh thu nhận Các kết mô thực nghiệm trình bày Các kết chứng minh rằng, phương pháp đề xuất sử dụng cho nâng cao độ phân giải kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu Từ khóa: Siêu phân giải; Kính hiển vi; Xử lý ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ Một hệ thống quang học có độ xác định nhận giới hạn độ phân giải 0.61/NA, đây,  bước sóng ánh sáng NA độ số Giới hạn phân giải gây giới hạn nhiễu xạ ánh sáng [1, 2] Hệ thống quang học kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu cải thiện độ phân giải lên hệ số √2 so với kính hiển vi trường rộng [3, 4] Ngồi ra, kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu giảm ảnh hưởng nhiễu mờ gây vật độ sâu trường Trong điều kiện thí nghiệm nay, độ phân giải thiết bị nhận đến 200 nm [5] Do vậy, kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu sử dụng nhiều cho quan sát mẫu dạng 3D Để nâng cao độ phân giải cho kính hiển vi phát xạ huỳnh quang, phương pháp phổ biến sử dụng nhiều chùm tia kích hoạt mẫu khơi phục quang học ngẫu nhiên (stochastic optical microscopy-STORM) [6, 7]; hiển vi định vị quang hóa (photoactivated localization microscopy-PALM) [8, 9]; hiển vi suy giảm phát xạ đồng thời (stimulated emission depletion microscopy-STED) [10, 11]; hiển vi chuẩn trực cấu trúc (structured illumination microscopy-SIM) [12, 13], q trình ảnh số hóa [14, 15] hiển vi phản xạ toàn phần (total-internal reflection microscopy-TIRM) [16, 17] Trong phương pháp nêu trên, STROM, PLAM, STED SIM sử dụng rộng rãi Hiệu ứng dụng phương pháp cho nâng cao độ phân giải chứng minh, nhiên, phương pháp có nhược điểm định [18] STROM PLAM bị giới hạn vận tốc tạo ảnh Ở trình thu nhận ảnh độ phân giải cao, hành nghìn ảnh phải yêu cầu nhận Vì vậy, để nhận ảnh siêu phân giải tiêu tốn khoảng thời gian định Gần đây, tác giả cải thiện vận tốc tạo ảnh STROM tới giây ảnh [19, 20], nhiên, điều chưa đáp ứng cho nghiên cứu với tế báo sống Thêm vào đó, độ xác định vị hai phương pháp bị giới hạn điều kiện phát xạ huỳnh quang suy giảm-quay tạo ảnh với hướng ngẫu nhiên, điều dẫn đến giới hạn độ phân giải [21] Một phương pháp khác cho nhận kết siêu phân giải sử dụng hai chùm kích hoạt mẫu đồng thời, phương pháp gọi STED STED phương pháp cho nhận ảnh siêu phân giải mà không làm giảm tốc độ tạo ảnh Tuy nhiên, số thuốc nhuộm huỳnh quang với vật mẫu cho hiển vi STED chưa nhiều cặp phổ phát xạ kích hoạt phải yêu cầu phù hợp với bước sóng suy giảm kích hoạt SIM phương pháp cho nhận ảnh vượt qua giới hạn phân giải Ở phương pháp này, sử dụng dạng chùm tia có cấu trúc cho kích hoạt mẫu Tuy nhiên, chu kỳ 108 H X Hội, …, T L Khương, “Nâng cao độ phân giải … mối liên hệ nhân kiểu logarit.” Nghiên cứu khoa học công nghệ của chùm tia có cấu trúc cho kích hoạt mẫu bị giới hạn nhiễu xạ ánh sáng, phương pháp SIM có khả nâng cao độ phân giải đến so với kính hiển vi thơng thường [18] Hơn nữa, phương pháp tương đối đắt tiền cho thực thời gian thực Mặc dù độ phân giải SIM cải tiến xa trường hợp bảo hòa quang (được gọi SSIM) [22], tốn tương đối khó khăn thực Hơn nữa, huỳnh quang SSIM dễ dàng trở thành phản ứng quang hóa gây tượng nhiễm độc quang phơi sáng thời gian dài mẫu chùm kích hoạt mật độ cơng suất cao Do đó, nỗ lực liên tục cho phát triển kỹ thuật cho nhận ảnh siêu phân giải kính hiển vi quang học cần thiết Ở báo này, đề xuất phương pháp cho nhận ảnh độ phân giải cao kính hiển vi phát xạ huỳnh quanh quét đồng tiêu, mà ứng dụng cho nghiên cứu kích thước nano mét Ở phương pháp đề xuất, hai chùm kích hoạt mẫu khác sử dụng Cho nên trình thu nhận ảnh thực hai lần vậy, phương pháp làm tăng thời gian nhận ảnh Sau đó, ảnh độ phân giải cao đưa đến liện hệ nhân-logarit hai ảnh PHƯƠNG PHÁP Phân bố cường độ sóng lan truyền qua vật kính trường xa tính tốn cơng thức: ia  , ikn z cos   r2 sin  cons  2   E  r2 , 2 , z2   iC sin   E0 A  ,   P  e  e  d d (1)  Ở đây, E  r2 , 2 , z2  mô tả véc tơ trường điện từ điểm (r2, 2, z2) mà biểu diễn hệ tọa độ trụ, C số qui chuẩn, E0 mô tả hàm biên độ chùm sáng vào, A(, ) biểu diễn ma trận 33 matrix liên quan tới cấu trúc thấu kính tạo ảnh P biểu diễn véc tơ Jones chùm sáng tới a(, ) biểu diễn tham số chậm pha sử dụng mặt nạ pha Khi điều kiện sin thỏa mãn với vật kính, A(, ) biểu diễn bằng:    cos   1 cos   A  ,    cos   cos   1 cos  sin   sin  cos    cos   1 cos  sin    cos   1 sin  sin  sin   sin  cos     sin  sin    cos   (2) Hàm nhịe điểm (PSF) nhận bằng: h E (3) Hàm nhòe điểm tồn hệ thống quang học cho kính hiển vi phát xạ huỳnh quang qt đồng tiêu mơ tả công thức sau: hhethong  hchieu sang   hthu anh  pinhole (4) Ở đây, để thuận lợi cho q trình mơ phỏng, giả định rằng, hàm nhòe điểm phần thu tương ứng với hàm nhịe điểm dạng chùm kích hoạt Gaussian; pinhole có tác dụng loại bỏ nhiễu gây vật tiêu điểm Ảnh nhận đầu thu biểu diễn cơng thức sau: g  o * hhethong (5) đây, o mơ tả vật quan sát Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 68, - 2020 109 Kỹ thuật điều khiển & Điện tử Hình (a) Hàm PSF đặc; (b) Mặt nạ pha dạng xoáy 0-2; (c) Hàm PSF vành Trong báo này, giới thiệu phương pháp cho tăng độ phân giải kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu sử dụng hai kiểu chùm kích hoạt mẫu Để thực điều đó, trước hết hai chùm tia chuẩn trực mẫu đề xuất Chùm tia thứ dạng Gausian (đây dạng chùm tia dùng phổ thông cho tạo ảnh) Chùm tạo dạng PSF mà gọi PSF đặc hình 1(a) Chùm tia thứ hai đưa đến mặt nạ pha có dạng hình (b) Mặt nạ pha gọi mặt nạ pha xoáy 0-2[10] Chùm tia tạo PSF dạng vành mà gọi PSF vành hình 1(c) Như biết rằng, có nhiều dạng mặt nạ pha đề xuất cho mục tiêu ứng dụng khác Tuy nhiên, để tạo dạng PSF vành dạng mặt nạ pha xốy 0-2 sử dụng phổ biến Quá trình thu nhận ảnh hai chùm tia kích hoạt đưa đến hai ảnh Ảnh thứ nhận PSF đặt, mà gọi ảnh đặc, gdat Ảnh thứ hai nhận PSF vành, mà gọi ảnh vành, gvanh Bằng trình nghiên cứu mối liên hệ hai ảnh này, đưa đến công thức cho nhận ảnh độ phân giải cao Một ảnh độ phân giải cao nhận liên hệ logarit nhân hai ảnh mà biểu diễn công thức: g   g  g dat  log  vanh (6)   gvanh    Để nhận hai ảnh hai chùm tia kích hoạt, chúng tơi giới thiệu hai sơ đồ hệ thống quang học hình Ở sơ đồ thứ hình 2(a), chùm tia kích hoạt mẫu đặc vành tách Chùm tia kích hoạt vành đưa đến mặt nạ pha mà có dạng kiểu xốy 0-2 Mặt nạ pha đưa đến điều biến ánh sáng không gian kiểu truyền qua (Space light modulation-SLM) Một điều ý đối hệ kiểu hiệu chỉnh cẩn thận để đảm bảo rằng, hai chùm kích hoạt vào vị trí mẫu Một kiểu khác giới thiệu hình 2(b) Ở sơ đồ hệ thống quang học tạo ảnh này, chèn SLM (SLM kiểu phản xạ) vào đường truyền sáng Ở đây, SLM có khả thay đổi kiểu mặt nạ pha Khi có kiểu mặt nạ pha 0, chùm kích hoạt mẫu dạng PSF đặc nhận được, SLM chuyển sang mặt nạ pha xốy 0-2, chùm kích hoạt mẫu dạng PSF vành nhận Chúng ta nhận thấy sơ đồ 110 H X Hội, …, T L Khương, “Nâng cao độ phân giải … mối liên hệ nhân kiểu logarit.” Nghiên cứu khoa học công nghệ hệ thống quang học hình 2(b) thuận lợi hình 2(a) Trong phần thực nghiệm chúng tơi sử dụng sơ đồ hình 2(b) Hình Mơ hình cho nhận hai ảnh từ hai kiểu chùm kích hoạt mẫu khác (a) Sơ đồ hệ thống quang học hai chùm kích hoạt mẫu tách nhau; (b) Sơ đồ hệ thống quang học hai chùm kích hoạt mẫu trùng nhau; BS lăng kính bán phản xạ; SLM điều biến ánh sáng không gian KẾT QUẢ MƠ PHỎNG VÀ THỰC NGHIỆM Hình (a) Ảnh gốc; (b) Ảnh truyền thống; (c) Ảnh đề xuất Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 68, - 2020 111 Kỹ thuật điều khiển & Điện tử Để xem xét hiệu phương pháp đề xuất, chúng tơi thực mơ q trình tạo ảnh cho phương pháp đề xuất so sánh hiệu nâng cao độ phân giải với phương pháp truyền thống Để thực mô phỏng, sử dụng tham số xuất phát sau: độ số, NA = 1.49; bước sóng laser sử dụng,  = 640nm; mẫu đặt mơi trường có chiết suất 1.518; tham số α = 0.15 β = 0.1 Đối với hai tham số α β, tham số ảnh hưởng đến khả phân giải phương pháp đề xuất Tuy nhiên, hai tham số lựa chọn không phù hợp làm thông tin vật Do vậy, chúng chọn cho đảm bảo ảnh nhận độ phân giải cao không làm thông tin vật Với tham số đầu vào này, sử dụng ảnh mẫu spokes cho thực mô Ảnh gốc hình 3(a) Hình 3(b) đưa đến kết ảnh nhận kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu truyền thống, gọi ảnh truyền thống Hình 3(c) mơ tả kết ảnh nhận phương pháp đề xuất, gọi ảnh đề xuất Có thể nhìn thấy rõ rằng, vùng phía vịng trịn màu xanh hình 3(b), khơng cịn thể phân biệt vạch Giới hạn phân giải kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu truyền thống không vượt qua độ phân giải Tuy nhiên, nhận thấy ảnh đề xuất, phần phía ảnh khả phân biệt vạch sáng tối Điều nghĩa rằng, khả phân giải phương pháp đề xuất vượt qua vòng tròn màu xanh Hay nói cách khác, phương pháp đề xuất nhận cải tiến khả phân giải so với kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu truyền thống Hình (a) Ảnh gốc; (b) Ảnh truyền thống; (c) Ảnh đề xuất Để kiểm nghiệm thêm hiệu phương pháp đề xuất kết mô phỏng, sử dụng mẫu ảnh gốc khác hình 4(a) Ảnh truyền thống hình 4(b), ảnh đề xuất hình 4(c) Chúng ta 112 H X Hội, …, T L Khương, “Nâng cao độ phân giải … mối liên hệ nhân kiểu logarit.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ nhìn thấy rằng, ảnh truyền thống vị trí (1) (2), hai đường thẳng chập vào không cịn phân biệt được, vị trí ảnh đề xuất phân biệt hai đường cách rõ ràng Điều nghĩa rằng, độ phân giải phương pháp đề xuất cải thiện tốt Cuối cùng, để chứng minh cách rõ ràng hiệu của phương pháp đề xuất, sử dụng hạt cầu phát xạ hình quang với kích thước, 200nm, để tiến hành thực nghiệm Kết thực nghiệm hình Hình 5(a) ảnh nhận kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiờu truyn thng vi kớch thc nh 5ì5 àm Kt ảnh nhận phương pháp đề xuất hình 5(b) Như hình 5(a) 5(b) ra, nhìn thấy rằng, kích thước ảnh cầu phát xạ huỳnh quang gần Tuy nhiên, điều rõ ràng rằng, tốc độ thay đổi lượng từ chân lên đến đỉnh ảnh cầu phát xạ huỳnh quang ảnh đề xuất nhanh so với ảnh truyền thống Vì vậy, khả phân giải ảnh đề xuất tốt Để rõ khả phương pháp đề xuất tốt hơn, sử dụng tiểu chuẩn đo độ rộng cầu phát xạ huỳnh quang cường độ để chứng minh, gọi FWHM (full-width at halfmaximum (FWHM)) Nếu giá trị nhỏ khả phân giải tốt Hình 5(c) kết đường theo phương nằm ngang từ 1.25µm đến 1.77µm qua tâm cầu phát xạ huỳnh quang mà đánh dấu hình 5(a) 5(b) đường thẳng màu nâu Trên hình 5(c) sử dụng đường chuẩn màu xanh mức cường độ 0.5 để FWHM Kết rằng, FWHM cầu phát xạ huỳnh quang ảnh đề xuất nhỏ 1.42 lần so với cầu phát xạ huỳnh quang ảnh truyền thống Điều nghĩa rằng, khả phân giải phương pháp đề xuất tốt (a) (b) (c) Hình (a) Ảnh truyền thống; (b) Ảnh đề xuất; (c) Ảnh đường kẻ ngang qua tâm cầu phát xạ huỳnh quang mà hai ảnh (a) (b) KẾT LUẬN Trong báo này, giới thiệu phương pháp hiệu sử dụng hai kiểu chùm tia kích hoạt mẫu cho nâng cao độ phân giải kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu Một mối liên hệ nhận logatit hai ảnh nhận cho nhận ảnh độ phân giải Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 68, - 2020 113 Kỹ thuật điều khiển & Điện tử cao đề xuất Một số kết mô thực nhiệm đưa đến cho kiểm chứng khả nâng cao độ phân giải của phương pháp đề xuất Kết thực nghiệm chứng minh rằng, phương pháp đề xuất làm tăng độ phân giải khoảng 1.42 lần so với kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét đồng tiêu truyền thống Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số (103.03-2018.08) Quỹ nghiên cứu Học viện Kỹ thuật Quân đề tài mã số (19.1.029) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Wan C, et al “Three-dimensional visible-light capsule enclosing perfect supersized darkness via antiresolution”, Laser Photonic Review 5: 743-749 (2014) [2] J Pawley J “Handbook of Biological of confocal microscopy” 3rd ed (Springer, 2006) [3] Wilson T “Confocal microscopy” Academic Press, London 426, pp1-64 (1990) [4] Gu M “Principles of three dimensional imaging in confocal microscopies” World Scientific, Singapore (1996) [5] Segawa S, Kozawa Y, and Sato S “Resolution enhancement of confocal microscopy by subtraction method with vector beams” Opt Lett 39(11): 3118-3121 (2014) [6] Rust M J, Bates M & Zhuang X “Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)” Nat Methods 3, 793–796, (2006) [7] Xu J, Ma H, Liu Y “Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)” Curr Protoc Cytom 81:12 (2017) [8] Hendrik D et al “Complementarity of PALM and SOFI for super-resolution livecell imaging of focal adhesions” Nature Communications volume 7, Article number: 13693 (2016) [9] Betzig, E et al “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006) [10] Hell, S W “Microscopy and its focal switch” Nat Methods 6, 24–32 (2009) [11] Mikhail E M et al “A set of monomeric near-infrared fluorescent proteins for multicolor imaging across scales” Nature Communications volume 11, Article number: 239 (2020) [12] Karl Z et al “Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy” Nature Communications volume 10, Article number: 4694 (2019) [13] Andreas M et al “Ideo-rate multi-color structured illumination microscopy with simultaneous real-time reconstruction” Nature Communications volume 10, Article number: 4315 (2019) [14] Carrington W A et al “Superresolution 3-dimensional images of fluorescence in cells with minimal light exposure” Science 268, 1483–1487 (1995) [15] Kano, H et al “Avalanche photodiode detection with object scanning and image restoration provides 2-4fold resolution increase in two-photon fluorescence microscopy” Bioimaging 4, 187–197 (1996) [16] Rasmus P T et al “A large size-selective DNA nanopore with sensing applications” Nature Communications volume 10, Article number: 5655 (2019) [17] Min G “Single-shot super-resolution total internal reflection fluorescence microscopy” Nature Methods volume 15, pages425–428(2018 [18] Gustafsson, M G L “Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution” Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13081–13086 (2005) 114 H X Hội, …, T L Khương, “Nâng cao độ phân giải … mối liên hệ nhân kiểu logarit.” Nghiên cứu khoa học công nghệ [19] Cox, S et al “Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics.” Nat Methods 9, 195–200 (2012) [20] Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D & Huang, B “Faster STORM using compressed sensing” Nat Methods 9, 721–723 (2012) [21] Engelhardt J et al “Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy” Nano Lett 11, 209–213 (2011) [22] Aviram G et al “The Limitations of Nonlinear Fluorescence Effect in Super Resolution Saturated Structured Illumination Microscopy System” J Fluoresc (2010) ABSTRACT RESOLUTION-ENHANCEMENT FOR CONFOCAL SCANNING FLUORESCENCE MICROSCOPY USING TWO DIFERENT POINT SPREAD FUNCTIONS WITH THE LOGARITHM -MULTIPLYING RELATIONSHIP In this paper, one method improving the resolution of confocal scanning fluorescence microscopy has been suggested One image is achieved by using Gaussian beam, other image is acquired by employing doughnut beam The highresolution image can be achieved from the logarithm-multiplying relationship of the two images The simulation and experimental results are presented The results demonstrated that the proposed method can be used to improve the resolution of confocal scanning fluorescence microscopy Keywords: Super-resolution; Microscopy; Image proccesing Nhận ngày 21 tháng năm 2020 Hoàn thiện ngày 19 tháng năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 03 tháng năm 2020 Địa chỉ: Học viện Kỹ thuật quân * Email: levannhuktq@gmail.com; nghiapm2018@mta.edu.vn Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 68, - 2020 115 ... phát xạ huỳnh quang mà hai ảnh (a) (b) KẾT LUẬN Trong báo này, giới thiệu phương pháp hiệu sử dụng hai kiểu chùm tia kích hoạt mẫu cho nâng cao độ phân giải kính hiển vi phát xạ huỳnh quang quét. .. pháp cho nhận ảnh độ phân giải cao kính hiển vi phát xạ huỳnh quanh quét đồng tiêu, mà ứng dụng cho nghiên cứu kích thước nano mét Ở phương pháp đề xuất, hai chùm kích hoạt mẫu khác sử dụng Cho. .. thứ hai nhận PSF vành, mà gọi ảnh vành, gvanh Bằng trình nghiên cứu mối liên hệ hai ảnh này, đưa đến công thức cho nhận ảnh độ phân giải cao Một ảnh độ phân giải cao nhận liên hệ logarit nhân hai