Bài viết sử dụng nấm men Pichia pastoris làm tế bào chủ để biểu hiện protein KGF dạng tiết dưới sự điều hòa của promoter AOX1 với cảm ứng methanol. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 Bài Nghiên cứu Open Access Full Text Article Tạo dòng, biểu thu nhận nhân tố tăng trưởng tế bào sừng KGF (Keratinocyte Growth Factor) tái tổ hợp dạng tiết nấm men Pichia pastoris Nguyễn Phạm Anh Thư1 , Nguyễn Thị Thùy Trang1 , Nguyễn Hiếu Nghĩa1 , Đặng Thị Phương Thảo1,2,* TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Liên hệ Đặng Thị Phương Thảo, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: thaodp@hcmus.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 01-4-2020 • Ngày chấp nhận: 18-5-2020 • Ngày đăng: 01-7-2020 DOI : 10.32508/stdjns.v4i3.900 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo cơng bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Nhân tố tăng trưởng tế bào sừng (KGF - Keratinocyte Growth Factor) nhân tố tăng trưởng hoạt động theo chế cận tiết, tế bào trung mơ tiết ra, có vai trị kích thích tăng sinh, biệt hóa di chuyển tế bào biểu mô đồng thời hỗ trợ tái tạo biểu mô tổn thương Trong nghiên cứu gần đây, KGF tái tổ hợp sản xuất từ nhiều hệ thống biểu vi khuẩn, tế bào thực vật, tế bào trùng, tế bào động vật có vú mức độ biểu thấp, chi phí cao khó khăn quy trình thu nhận Trong nghiên cứu này, sử dụng nấm men Pichia pastoris làm tế bào chủ để biểu protein KGF dạng tiết điều hoà promoter AOX1 với cảm ứng methanol Kết cho thấy dòng nấm men Pichia pastoris X33:kgf có khả biểu KGF tái tổ hợp dạng tiết môi trường BMMY cảm ứng 0,5% methanol Protein tiết thu nhận tinh chế sắc ký lực heparin, đạt 1,350 mg/l với độ tinh 99,89% Bên cạnh đó, KGF tái tổ hợp cho thấy khả kích thích tăng sinh dịng tế bào A549 tế bào có thụ thể dành cho KGF tự nhiên Từ khoá: heparin, KGF, nhân tố tăng trưởng, Pichia pastoris GIỚI THIỆU KGF hay FGF7, nhân tố tăng trưởng sinh tổng hợp tế bào có nguồn gốc trung mơ, phát phân lập lần vào năm 1989 Rubin cộng từ dòng tế bào nguyên bào sợi phổi M426 phôi thai người [1, 2] Các nghiên cứu cho thấy KGF có nhiều chức khác bao gồm kích thích phân chia, tăng sinh biệt hóa dịng tế bào biểu mô tế bào sừng [1, 3, 4] Bên cạnh đó, KGF cịn có vai trị việc tái tạo, sửa chữa mô quan tổn thương thông kích thích di chuyển tế bào sừng biểu mơ miệng vết thương, từ thúc đẩy tiến trình làm lành vết thương [5, 6] Hiện nay, KGF nghiên cứu rộng rãi ứng dụng nhiều lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm hỗ trợ điều trị ung thư [7–9] Việc hóa trị xạ trị thời gian dài điều trị ung thư gây nhiều tác dụng phụ thể bệnh nhân mà phổ biến giảm sức đề kháng, dẫn đến người bệnh phải đối mặt thêm với hội chứng khác loét miệng, nhiễm trùng hay rụng tóc [10] Để giải tình trạng trên, thị trường xuất nhiều sản phẩm hướng đến hỗ trợ bệnh nhân điều trị ung thư, có nhiều sản phẩm có chất sinh học Palifermin (KepivanceTM) sản phẩm KGF tái tổ hợp sản xuất hệ thống E coli FDA Hoa Kì phê chuẩn vào ngày 15/12/2004, chấp thuận cho thương mại sử dụng để làm giảm hội chứng viêm loét màng nhầy niêm mạc miệng bệnh nhân ung thư máu ác tính trải qua nhiều trị lần hóa trị xạ trị Với tiềm ứng dụng lớn nhiều lĩnh vực, nhiên việc sử dụng KGF cịn hạn chế giá thành cao lượng KGF thu nhận tự nhiên tương đối thấp Theo theo thống kê, trung bình bệnh nhân có trọng lượng 70 kg tốn khoảng 5000 euro cho lần điều trị Palifermin [11], tương đương khoảng 100 triệu VNĐ Với mục tiêu thu nhận KGF với lượng lớn hơn, có nhiều chiến lược biểu tái tổ hợp tiến hành nhiều hệ thống vi khuẩn E.coli [12, 13], tế bào thuốc [6], tế bào tằm [14], tế bào chuột lang Trung Quốc – CHO [15], nhiên tồn nhiều nhược điểm lượng KGF thu nhận thấp, thân KGF gây độc cho tế bào chủ biểu hệ thống E coli [12]; đồng thời, hiệu sản xuất thấp chi phí cao hệ thống biểu tế bào động vật có vú,… Năm 2018, Bahadori cộng biểu thành công KGF dạng tiết hệ thống tế bào nấm men P pastoris với hoạt tính kích thích tăng sinh dịng tế bào A549 NIH3T3 Nhận thấy P pastoris hệ thống tế bào chủ biểu với nhiều ưu điểm Trích dẫn báo này: Thư N P A, Trang N T T, Nghĩa N H, Thảo D T P Tạo dòng, biểu thu nhận nhân tố tăng trưởng tế bào sừng KGF (Keratinocyte Growth Factor) tái tổ hợp dạng tiết nấm men Pichia pastoris Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 4(3):573-583 573 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 khả biến đổi sau dịch mã gấp cuộn protein tương đồng với tế bào động vật, đặc biệt promoter mạnh khả tiết protein ngoại bào giúp protein tái tổ hợp hệ thống biểu mức độ cao, chiếm tới 80% tổng protein tiết [16–18], lựa chọn P pastoris nhằm biểu KGF tái tổ hợp Với chiến lược trên, gen mã hóa cho protein KGF dịng hóa vào vector pPICZα A sau gắn chèn vào DNA gen nấm men P pastoris X33 nhờ chế tái tổ hợp tương đồng Dưới kiểm soát promoter AOX1- cảm ứng methanol, protein KGF dạng tiết biểu hiện, thu nhận tinh sắc ký lực heparin, sau đó, đánh giá hoạt tính sinh học dựa khả kích thích tăng sinh tế bào A549 Kết đề tài hướng tới giảm giá thành sản phẩm thương mại góp phần hỗ trợ bệnh nhân việc điều trị ung thư mở rộng ứng dụng lĩnh vực khác mỹ phẩm hay sản phẩm chăm sóc sức khỏe VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Chủng, plasmid tế bào Chủng E.coli DH5α [F− φ 80 lacZ ∆M15 ∆(lacZYAargF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK − , mK + ) phoA supE44 λ − thi-1 gyrA96 relA1] dùng để cấu trúc vector tái tổ hợp, nuôi cấy môi trường LB (Trypton 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%) Chủng nấm men P pastoris X33 [Hoang dại, Mut+ ] dùng để biểu KGF, nuôi cấy môi trường YPD (Dextrose 2%, peptone 2%, cao nấm men 1%) Plasmid pPICZα A (V195-20, Invitrogen) có kích thước 3593bp dùng làm vector dịng hóa gen kgf , mang gen kháng zeocin hỗ trợ q trình sàng lọc dịng tái tổ hợp, promoter AOX cảm ứng methanol, trình tự tín hiệu tiết α -MF giúp hỗ trợ tiết protein ngoại bào Gen mã hóa cho protein KGF (gen kgf) tham khảo từ Genbank [Genbank: M60828.1], thiết kế lại dựa trình tự protein KGF từ ngân hàng liệu protein Drugbank [Drugbank: Palifermin DB00039] tối ưu hóa nhằm phù hợp với mã di truyền chủng chủ biểu P p astoris Dòng tế bào A549 (ATCC: CCL-1859) có thụ thể KGFR sử dụng để thử hoạt tính sinh học protein KGF Cấu trúc vector tái tổ hợp pPICZα A-kgf Sau tổng hợp hóa học từ trình tự thiết kế, gen kgf khuếch đại phương pháp PCR cặp mồi đặc hiệu KGF-F/R với trình tự AAG GGG TAT CTC TCG AGA AAA GAT CTT 574 ACG ATT ACA TGG AAGG GCG GCC GCC GCG GCT CGA GTC ATT AAG TAA TAG CCA TTG GCAA Chu kỳ PCR thiết lập sau: Biến tính 94o C phút, lặp lại 30 lần chu kỳ 94o C 30 giây, 55o C 30 giây, 72o C 30 giây, kéo dài 72o C phút, ổn định 32o C phút Vector pPICZα A tách chiết phương pháp SDS-kiềm cắt mở vòng enzyme XhoI Sản phẩm PCR sản phẩm cắt kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,2% Gen kgf tinh phương pháp tủa cồn, plasmid sau cắt tinh qua cột silica gel kit EZ-10 (Biobasic), sau gen kgf dịng hóa vào plasmid pPICZα A theo chế tái tổ hợp tương đồng kit eClone cung cấp môn Công nghệ Sinh học Phân từ Môi trường – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP HCM Cấu trúc vector tái tổ hợp sơ đồ tạo dòng thể Hình Sản phẩm nối biến nạp vào tế bào E.coli DH5α phương pháp hóa biến nạp sàng lọc môi trường LB agar với kháng sinh zeocin (nồng độ 50 µ g/ml) Các thể biến nạp sàng lọc bước đầu phản ứng PCR khuẩn lạc mồi đặc hiệu, khuẩn lạc cho kết dương tính tiến hành tách chiết plasmid phương pháp SDS – kiềm Các plasmid sau tách chiết sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi KGF-F AOX-R để xác nhận gen chèn vào plasmid pPICZα A khung đọc mở thiết kế Cuối cùng, vector tái tổ hợp giải trình tự cặp mồi AOX-F AOX-R Tạo dòng nấm men P pastoris X33 mang vector tái tổ hợp pPICz α A-kgf Để cấu trúc chủng nấm men P pastoris::kgf, plasmid tái tổ hợp mang gen kgf cắt mở vòng với enzyme SacI vị trí vùng promoter AOX1 nhằm tăng khả sát nhập vào gen nấm men, sau đưa vào tế bào chủ P pastoris phương pháp điện biến nạp với điện dung 25 µ F, điện trở 200 Ω, hiệu điện 1,5 kV 5,0 ms Nhằm phát diện gen thể biến nạp, khuẩn lạc mọc đĩa YPD với kháng sinh zeocin với nồng độ 100 µ g/ml kiểm tra kĩ thuật PCR khuẩn lạc sàng lọc với mồi đặc hiệu KGF-F KGF-R Các khuẩn lạc nấm men phá lớp vách dày chứa chitin đường mannose lyticase trước sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Các khuẩn lạc cho kết PCR dương tính tách chiết DNA gen kiểm tra kiểu hình phản ứng PCR với cặp mồi AOX-F/R Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 Hình 1: Cấu trúc vector tái tổ hợp pPICzα A/kgf sơ đồ tạo dòng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp Kiểm tra biểu KGF dạng tiết chủng P pastoris X33::kgf Các dòng P pastoris X33::kgf tái tổ hợp mang kiểu hình Mut+ tiến hành hoạt hóa mơi trường BMGY (cao nấm men 1%, peptone 2%, YNB 1,34%, phosphate buffer 0.1M pH 6,0; biotin 4×10−5 %, glycerol 1%), nuôi cấy lắc 16 – 18 nhiệt độ 30o C, tốc độ 250 vòng/phút sau cấy chuyền sang mơi trường BMMY (cao nấm men 1%, peptone 2%, YNB 1,34%, 10% phosphate buffer M pH 6,0; biotin 4×10−5 %, methanol 0,5%) với mật độ tế bào khởi điểm OD600 =1 bổ sung methanol với nồng độ cuối 0,5% sau 24 nuôi cấy Mật độ tế bào xác định sau 24 giờ, 48 72 nhằm kiểm sốt q trình tăng trưởng dịng nấm men tái tổ hợp, bên cạnh đó, mức độ biểu protein KGF dịch biểu đánh giá phương pháp di SDS-PAGE khẳng định lại phương pháp lai western với kháng thể đặc hiệu kháng KGF Cụ thể, mẫu protein phân tách 575 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 gelpolyacrylamide chuyển thẩm lên màng nitrocellulose, khóa màng sữa gầy 5% qua đêm, sau tiến hành lai với kháng thể sơ cấp kháng KGF (R&D Systems) nồng độ 1µ g/ml kháng thể thứ cấp mouse – IgG gắn Horseradish peroxidase (HRP) (R&D Systems) tỉ lệ 1/1000 Tín hiệu ghi nhận màng lai nhờ phản ứng chất peroxidase (H2 O2 ) luminol với HRP Tinh chế thu nhận protein KGF tái tổ hợp sắc ký lực Heparin Cột sắc ký lực Heparin 5ml (GE Healthcare Life Sciences) cân với 50 ml dung dịch A (20mM Tris – HCl, pH 7,5), 200 ml dịch biểu sau thu nhận lọc qua màng lọc 0,2µ m sau tiến hành nạp qua cột Sau toàn mẫu nạp, tiến hành rửa cột với 50ml 100% dung dịch A 50 ml dung dịch 30% B (20mM Tris – HCl, pH 7,5, 2M NaCl) nhằm loại bỏ phần protein tạp bám không đặc hiệu cột, sau protein mục tiêu KGF dung ly khỏi cột với 50% 100% dung dịch B Tốc độ cho tồn quy trình 5ml/phút Các phân đoạn sau tinh chế tiến hành điện di SDS PAGE, đánh giá độ tinh phần mềm Gel analyzer định lượng nồng độ protein mục tiêu phương pháp Bradford Thử nghiệm hoạt tính sinh học protein KGF tái tổ hợp phương pháp MTT Thử nghiệm MTT dùng để đánh giá hoạt tính kích thích tăng sinh KGF tái tổ hợp tế bào A549 Tế bào A549 nuôi cấy ngày đĩa Φ60, thu nhận chuyển vào vào đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng môi trường ni cấy DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS, 100µ l/ giếng Ủ tế bào 37o C, 5% CO2 24 Loại môi trường cũ, rửa tế bào mơi trường DMEM/F12 khơng chứa FBS, bổ sung 95 µ l DMEM/F12 khơng chứa FBS Bổ sung 5µ l KGF nồng độ 25; 50; 100; 200 ng/µ l vào giếng 5µ l dung dịch pha lỗng mẫu vào chứng âm Ủ tế bào 37o C, 5% CO2 48 Bổ sung 5µ l MTT (5mg/ml) vào giếng Ủ 37◦ C, 5% CO2 Hút bỏ toàn dịch nổi, bổ sung 100µ l dung dịch hồ tan MTT vào giếng Đặt đĩa lên máy lắc 10 phút Đo lượng tinh thể tím tạo thành máy đọc đĩa 96 giếng bước sóng 550 nm Thực tương tự với mẫu KGF thương mại Mỗi thí nghiệm lặp lại lần đánh giá thống kê T-test KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 576 Kết tối ưu hóa trình tự gen mã hóa cho phân đoạn protein KGF Trình tự gen kgf dịch mã ngược từ trình tự polypeptide KGF thu từ ngân hàng liệu Drugbank Đây trình tự protein KGF biểu thu nhận hệ thống E.coli sử dụng làm thuốc Vì với mục tiêu biểu protein KGF với trình tự polypeptide hệ thống Pichia pastoris, tiến hành tối ưu số ba mã hóa gene kgf Gen mục tiêu tối ưu phần mềm snapgene kiểm tra trình tự phần mềm Genscript Kết phân tích trình tự Bảng cho thấy, trước tối ưu, gen kgf có số tương thích codon (CAI) hệ thống Pichia pastoris đạt 0,8 – số thấp khoảng lý tưởng (0,8 – 1,0) Sau tối ưu, số tương thích đạt 0,92, bên cạnh tần suất sử dụng codon giảm từ 7% xuống 0% - số lý tưởng cho việc biểu protein ngoại lai Đặc biệt, sau tối ưu, tỉ lệ GC phân tử thay đổi không đáng kể (tăng 1,35%) nằm khoảng lý tưởng Cấu trúc vector tái tổ hợp pPICzα A-kgf Các khuẩn lạc cho kết PCR dương tính với vạch DNA có kích thước tương ứng với kích thước chứng dương gen kgf (468 bp) điện di tách plasmid tái tổ hợp phương pháp SDS-kiềm kiểm tra gắn chèn gen kgf lên plasmid pPICZα A phản ứng PCR với cặp mồi KGF-F AOX-R Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với khuôn mẫu plasmid thu nhận từ khuẩn lạc dương tính giếng 3, 4, 5, (Hình 2) cho thấy có giếng xuất vạch mục tiêu nằm vạch 600 bp 800 bp thang DNA (giếng 3, 4, 6) chứng tỏ plasmid tái tổ hợp thể biến nạp có gen kgf chèn vị trí mong muốn thiết kế Ngược lại, giếng 2, sản phẩm PCR với khn plasmid pPICZα A nên khơng có vị trí bám đặc hiệu cho mồi KGF-F, sản phẩm khơng xuất vạch Thêm vào đó, kết giải trình tự cho thấy gen kgf dịng hóa tương đồng 100% mặt trình tự so với thiết kế ban đầu đồng khung dịch mã với trình tự α -MF Như vậy, nghiên cứu cấu trúc thành cơng dịng tế bào E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa cho protein KGF Tạo dòng nấm men P pastoris X33 mang gen mã hóa protein KGF Gen AOX1 chịu trách nhiệm cho chế sử dụng methanol nấm men P pastoris, sát nhập plasmid tái tổ hợp vào vùng gen xảy Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 Bảng 1: Kết tối ưu hóa codon trình tự gen kgf Trước tối ưu Sau tối ưu Thông số lý tưởng CAI (*) 0,8 0,92 0,8-1,0 CFD (%) (**) 99%) hoạt tính kích thích tăng sinh tế bào tương tự KGF tự nhiên Với mục tiêu ứng dụng KGF lĩnh vực dược phẩm mỹ phẩm quy mô lớn giảm giá thành sản phẩm, cần tăng quy mô biểu tối ưu hóa điều kiện ni cấy có kiểm sốt, xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học nhiều mơ hình khác Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(3):573-583 Hình 6: Hoạt tính sinh học KGF tái tổ hợp dòng tế bào A549 Chứng âm (PBS) xem có mức độ tăng sinh 100% *: p-value