Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus)

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm ac y, KHOA Y DƯỢC an NÔNG MỸ HOA ine XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ed ic DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP ho ol of M (Panax bipinnatifidus) Co py rig ht @ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2019 dP rm ac y, KHOA Y DƯỢC VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI an NÔNG MỸ HOA ed ic ine XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP of M (Panax bipinnatifidus) Sc ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC @ Khóa: QH.2014.Y Co py rig ht Người hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN ac y, VN U Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian qua dP rm Đầu tiên tơi xin gửi lời cám ơn đến tồn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho tơi làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo trường dìu dắt, giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập suốt năm qua ine an Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tri ân tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng, người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài of M ed ic Tôi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2014.Y đặc biệt bạn Hà, Nhung, Thảo, Vân đồng hành suốt thời gian qua Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thành viên nhóm nghiên cứu chị Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Thu Thủy người nhiệt tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình thực đề tài rig ht @ Sc ho ol Tôi xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCNTB.07C/13-18, 2015- 2017 (Chương trình Tây Bắc) PGS.TS Dương Thị Ly Hương chủ nhiệm tài trợ kinh phí để thực nội dung nghiên cứu Co py Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hôm Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! VN U Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, Nông Mỹ Hoa VN U DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Sâm vũ diệp HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) UV Ultra violete FLD Đầu dò huỳnh quang DAD Detector mảng điốt (Detector Diod Array) Rf Hệ số di chuyển RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) R2 Hệ số tương quan tuyến tính LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SKLM Sắc ký lớp mỏng an ine ed ic M of ho ol Sc @ ht rig py Co dP rm ac y, SVD Bảng 1.1 Các hợp chất saponin phân lập từ Sâm vũ diệp ac y, Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm mẫu Sâm vũ diệp VN U DANH MỤC CÁC BẢNG 22 22 Bảng 3.3 Kết xác định độ tro không tan acid mẫu 23 dP rm Bảng 3.2 Kết xác định tro toàn phần mẫu Sâm vũ diệp Sâm vũ diệp Bảng 3.4 Chương trình dung mơi Bảng 3.5 Tính thích hợp hệ thống 25 26 29 Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi 30 ine an Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu Sâm vũ diệp 31 Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp VN U DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ac y, Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ Sâm vũ diệp Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái dP rm Sa Pa, Lào Cai Hình 3.1 Vi phẫu thân rễ Sâm vũ diệp Hình 3.2 Bột thân rễ Sâm vũ diệp 11 21 21 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử 27 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 29 ine an Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 (A) dược liệu Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Sâm vũ diệp (B) 31 VN U MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ac y, DANH MỤC CÁC BẢNG dP rm DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN an 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học ine 1.1.2 Đặc điểm thực vật ed ic 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học M 1.1.5 Tác dụng dược lý of 1.1.6 Công dụng ho ol 1.2 TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 Sc 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11 @ 2.1.1 Nguyên liệu 11 ht 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 12 rig 2.1.3 Máy móc, thiết bị 12 Co py 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Mô tả 13 2.2.2 Vi phẫu 13 2.2.3 Soi bột 13 2.2.4 Độ ẩm 13 VN U 2.2.5 Tro toàn phần 13 2.2.6 Tro không tan acid 14 ac y, 2.2.7 Tạp chất 14 2.2.8 Định tính 15 dP rm 2.2.9 Định lượng 16 3.1 Mô tả 20 3.2 Vi phẫu 20 3.3 Soi bột 21 an 3.4 Độ ẩm 21 ine 3.5 Tro toàn phần 22 ed ic 3.6 Tro không tan acid 22 3.7 Định tính 23 M 3.8.Định lượng 24 of 3.9 Bàn luận 32 ho ol KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Sc PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC Co py rig ht @ PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP VN U ĐẶT VẤN ĐỀ ed ic ine an dP rm ac y, Sâm dược liệu quý có giá trị cao sử dụng nhiều thuốc y học cổ truyền Hiện nay, nhiều loài chi Sâm (Panax), đặc biệt loài nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng; syn.: P pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.) , thuốc quý, ưa chuộng, tiếng có giá trị cao Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thuốc quý sử dụng thuốc truyền thống có tiềm để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe lồi khác chi [2,14] rig ht @ Sc ho ol of M Ngày nay, xu hướng sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày tăng kèm theo làm hàng giả, hàng nhái, hàng chất lượng tăng theo Điều gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người gây lòng tin người sử dụng thuốc sảm phẩm từ dược liệu Để sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm thuốc địi hỏi cần phải xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây dựng phương pháp thử để đánh giá tiêu chuẩn Do đó, thực đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)” Đề tài phần đề tài cấp “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội Co py Mục tiêu đề tài: xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Sâm vũ diệp Để đạt mục tiêu trên, đề tài thực với nội dung sau: Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U quan tuyến tính diện tích pic sắc ký đồ nồng độ stipuleanosid R2 dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R2 = 0,9988 (Bảng hình 8) Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 µg/ml có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan cao 28 Nồng độ STT VN U Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 Diện tích pic (mAU*s) (µg/ml) 15,625 90,65283 37,5 154,6339 75 239,247 150 200 300 400 dP rm ac y, 418,038 589,441 836,676 an 1087,77 ine y = 2.6081x + 49.1185 R² = 0.9988 ed ic 1000 800 M 600 400 200 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Nồng độ (µg/ml) Sc ho ol of Diện tích pic (mAU*s) Đồ thị đường chuẩn stipuleanosid R2 1200 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 @ Độ Co py rig ht Khi thêm lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp cho độ thu hồi nằm khoảng độ lệch chuẩn tương đối RSD Kết chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 dược liệu Sâm vũ diệp Kết trình bày bảng 29 75 2094,160 75 2093,725 100 2167,998 100 2175,860 200 2416,990 200 2451,260 Trung bình RSD (%) Lượng tìm lại (µg) 72,358 72,191 100,668 103,683 196,137 209,277 Độ thu hồi (%) 96,48 103,68 100,67 96,25 98,07 104,64 99,96 3,31 ac y, 711,754 711,754 711,754 711,754 711,754 711,754 Diện tích pic (mAU*s) dP rm Lượng thêm vào (µg) an STT Lượng có sẵn (µg) VN U Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi ine Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ of M ed ic Tiến hành pha lỗng dung dịch hỗn hợp chuẩn phân tích HPLC đến tín hiệu chất định phân tích sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, S chiều cao pic chất phân tích, N chiều cao tín hiệu nhiễu lớn Nồng độ xác định giới hạn phát (LOD) phương pháp ứng với chất định phân tích ho ol Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng phương pháp xác định dựa giới hạn phát LOQ = 3,3 x LOD @ Sc Kết thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát LOD = 1,953 µg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 µg/ml rig ht Kết cho thấy phương pháp xây dựng có giới hạn phát giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu sâm vũ diệp py c) Kết định lượng Co Ta có sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 dược liệu SVD (Hình 9) 30 VN U ac y, dP rm an Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC stipuleanosid R2 (A) dược liệu Sâm vũ diệp (B) ed ic ine Kết định lượng thành phần stipuleanosid R2 mẫu SVD trình bày bảng 9: Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu Sâm vũ diệp Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo Tên mẫu M TT khối lượng khơ tuyệt đối Mẫu 0,338 Mẫu Mẫu 0,332 Trung bình 0,335 % ± 0,003 of Sc ho ol 0,334 Co py rig ht @ Nhận xét: Ta thấy hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu thử nằm khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % trung bình 0,335 % ± 0,003 Giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu SVD qui định tiêu chuẩn không thấp 0,3 % 31 3.9 Bàn luận VN U 3.9.1 Về mô tả dược liệu ac y, Nghiên cứu thực mẫu dược liệu giám định tên khoa học thu hái Sa Pa – Lào Cai năm 2016 Kết tốt thực quan sát nhiều mẫu thu hái vùng khác dP rm 3.9.2 Về khảo sát tiêu theo quy định Dược điển Việt Nam ine an Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nghiên cứu đánh giá tiêu độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần, tỷ lệ tro không tan acid số đặc trưng giúp đánh giá chất lượng dược liệu SVD trước đưa vào sử dụng Do thời gian kinh phí khơng cho phép nên số tiêu chưa thực tạp chất lẫn dược liệu, tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng chất chiết đượctrong dược liệu dung mơi (nước, ethanol,…) ed ic 3.9.3 Về định tính ho ol of M Định tính chúng tơi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử H2SO4 10% ethanol hơ nóng mỏng thấy có xuất vết chất khoảng Rf màu với cho thấy có mặt chất stipuleanosid R2 Nghiên cứu đề xuất hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 dược liệu SVD phương pháp SKLM Sc 3.9.4 Về định lượng ht @ Chúng xác định hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu dược liệu SVD thu hái Sa Pa phương pháp HPLC Co py rig Kết thu sau: Hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu thử nằm khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % Do đó, giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 dược liệu SVD qui định tiêu chuẩn không thấp 0,3 % 32 VN U KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài thực mục tiêu nghiên cứu đề sau: dP rm ac y, - Đã khảo sát tiêu chí dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định DĐVN V, gồm: mơ tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan acid, định tính, định lượng - Khảo sát, xây dựng quy trình định lượng saponin phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2 ed ic ine an - Đây nghiên cứu bước đầu góp phần bước hồn thiện chuyên luận tiêu chuẩn sở cho dược liệu SVD DĐVN tương lai Trên sở kết đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn sở cho dược liệu SVD (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm: khơng q 10,0%; tro tồn phần: khơng 8,0%; tro không tan acid: không 2,0%; định lượng: hàm lượng stipuleanosid R2 không thấp 0,3 % M KIẾN NGHỊ ho ol of Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất dược liệu, tỉ lệ vụn nát xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD Sc Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu SVD để bổ sung chuyên luận dược liệu SVD Dược điển Việt Nam Co py rig ht @ Đề xuất thầm định tiêu chuẩn sở dược liệu SVD 33 VN U TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt ac y, [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cộng (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 711 – 714 dP rm [2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285286 [3] Bộ Khoa học Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87 an [4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học ed ic ine [5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích Phụ lục - Thơng tư 22/2009 TT-BYT Quy định đăng ký thuốc of M [6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113, 216-250 ho ol [7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338 @ Sc [8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58 rig ht [9] Nguyễn Thị Thu Hương và cộng (2001), Cơng trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch sâm Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 464 - 466 Co py [10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích Đồn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam đinh lăng trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200 VN U [11] Nguyễn Thị Thu Hương Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress chống trầm cảm sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv Araliaceae) hoạt chất majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27 dP rm ac y, [12] Trần Cơng Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học số tác dụng dược lý hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr 165 ine an [13] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng dược lý hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23 M ed ic [14] Lã Đình Mỡi cộng (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr 1152-1158 of [15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76 Sc ho ol [16] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm vũ diệp Tam thất hoang Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr 177-180 Co py rig ht @ [17] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Huệ, Đặng Thị Thùy, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Phượng, Phạm Thị Tuyết Nhung, Hà Vân Oanh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2018), “Nghiên cứu thành phần saponin thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr 82-88 VN U [18] Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 202-206 ac y, [19] Trần Mỹ Tiên Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr 27-32 dP rm Tiếng Anh an [20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp ed ic ine [21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238 of M [22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420 ho ol [23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599 @ Sc [24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636 Co py rig ht [25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U [26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87 ht rig py Co @ ho ol Sc of M ine ed ic ac y, dP rm an VN U PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VN U PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP ac y, Sâm vũ diệp (thân rễ) Panax bipinnatifidus Seem dP rm Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất an Thân rễ phơi sấy khô Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), ho ̣ Nhân sâm (Araliaceae) Mô tả of Vi phẫu M ed ic ine Thân rễ thường nhiề u đố t, cong ngoằ n ngoèo, dài 7-12 cm, đường kiń h 0,5-1,5 cm Mă ̣t ngoài màu nâu, có những vế t nhăn ̣c, mảnh; những vế t vân ngang nổ i rõ chia thân rễ thành nhiề u đố t, có nhiề u se ̣o thân khí sinh hàng năm tàn lu ̣i để la ̣i Thể chấ t cứng chắ c, giòn, dễ bẻ, mă ̣t bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nha ̣t Mùi thơm nhe ̣ đă ̣c trưng, vi ̣đắ ng, ngo ̣t rig ht @ Sc ho ol Lớp bầ n gồ m - hàng tế bào hình chữ nhâ ̣t, thành cong, màu lu ̣c, lớp ngoài bi ̣bong rách Mô mề m vỏ gồ m những tế bào hình nhiề u ca ̣nh dày lên ở góc, chứa nhiề u ố ng tiế t và tinh thể calci oxalat hình cầ u gai Các bó libe-gỡ xếp thành bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm, phân cách bởi tia ruột rô ̣ng Gỗ gồ m những tế bào thành dày, đă ̣t mô mề m gỗ it́ hóa gỗ Tầ ng phát sinh libe-gỗ nằm libe cấp hai gỗ cấp hai, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật có màng mỏng, xếp thành dãy đặn Tia ruột rô ̣ng gồ m nhiề u tế bào xế p theo hướng xuyên tâm Ruô ̣t cấ u ta ̣o bởi các tế bào để hở những khoảng gian bào, ố ng tiế t ở vi ̣ trí ứng với các bó libe-gỗ ở cả phía lẫn phía ngoài Bột Co py Màu vàng nâu Soi kính hiể n vi thấ y: những ̣t tinh bơ ̣t hình bầu dục, kích thước không đề u, rố n ̣t là mô ̣t va ̣ch Mảnh bầ n với những tế bào hình nhiề u ca ̣nh, thành dày màu vàng nâu Mảnh mô mề m gồ m những tế bào màng VN U mỏng, màu trắ ng Mảnh ma ̣ch va ̣ch, ma ̣ch ma ̣ng Rải rác có chấ t tiế t màu nâu đen Tinh thể calci oxalat hình cầ u gai Định tính Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254S Dung môi khai triển: CH3OH-H2O (3:1, v/v) ac y, Phương pháp sắc ký lớp mỏng (phụ lục 5.4) dP rm Dung di ̣ch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10 ml methanol: nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký Dung dịch đối chiếu (1): Lấy 1g bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10 ml methanol: nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử an Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan lượng stipuleanosid R2 chuẩn methanol để dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml M ed ic ine Cách tiế n hành: chấ m riêng biê ̣t lên bản mỏng µl cho mỡi dung dich ̣ thử và dung dịch đối chiếu Sau khai triể n xong, lấ y bản mỏng để khô ở nhiêṭ đô ̣ phòng, phun dung dich ̣ acid sulfuric 10% ethanol (TT) Sấ y bản mỏng ở 105°C vết Các vết sắc ký đồ dung dịch thử phải có màu sắc giá trị Rf giống vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu of Định lượng @ Sc ho ol Cân xác khoảng 1,0 g bột dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, thêm xác 50,0 ml hỗn hợp methanol – nước tỷ lệ (70: 30), cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung hỗn hợp dung môi lượng mất, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 m dung dịch để tiêm sắc ký Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 methanol có điểm nồng độ xác gồm: 18,75 g/ml, 37,5 g/ml, 75 g/ml, 150 g/ml, 200 g/ml, 300 g/ml 400 g/ml ht Điều kiện sắc ký: Co py rig Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) Detector UV: bước sóng 203 nm Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh cần thiết Thể tích tiêm: 20 µL Pha động: Acetonitril (A) 0,5% acid acetic/ H2O (B) VN U Cách tiến hành: ac y, Kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn có nồng độ xác khoảng 75 µg/ml chuẩn bị trên, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic đáp ứng từ lần tiêm lặp lại không lớn 2,0 % dP rm Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Thiết lập đường chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ dung dịch (µg/ml) diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Tính nồng độ stipuleanosid R2 dung dịch thử (µg/ml) dựa phương trình đường chuẩn xây dựng ed ic ine an Hàm lượng stipuleanosid R2 có dược liệu SVD (%) tính theo dược liệu khơ kiệt tính cơng thức: mc × (100 – a) × 1000 of M X (%) = C × 50 × 100 ho ol Trong đó: C: nồng độ stipuleanosid R2 dung dịch mẫu thử (g/ml) Sc mc: lượng cân mẫu thử (mg) @ a: Độ ẩm mẫu thử (%) ht Hàm lượng saponin tổng không thấp 0,3% tính theo dược liệu khơ rig kiệt Co py Độ ẩm Không 10,0% ( phụ lục 9.6) VN U Tro tồn phần Khơng q 8,0% (phụ lục 9.8) Tro không tan acid ac y, Không 2,0% (phụ lục 9.7) dP rm Chế biến Thu hoạch thân rễ vào tháng - 4, lấy rửa sạch, phơi khô sấy nhiệt Bảo quản ine Để nơi khơ thống, tránh ẩm mốc an độ 50ºC ed ic Tính vị, quy kinh Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính ấm M Cơng năng, chủ trị Co py rig ht @ Sc ho ol of Có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, huyết, tán ứ Chủ trị: dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress…